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방법 논문

Marginating-간 백혈구의 선택적 수확

5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53918

⸱

2016년 7월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Sagol School of Neuroscience & School of Psychological Sciences, Tel-Aviv University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Marginating-hepatic leukocytes는 다른 백혈구 집단에 비해 독특한 특성과 뚜렷한 면역 기능을 나타냅니다. 여기에서 우리는 쥐 또는 생쥐의 간을 강제 관류하여 이 특정 간 세포 집단을 선택적으로 수확하는 방법을 설명합니다. 변두리-간 백혈구는 간 관련 질환 및 전이에 대한 감수성을 결정하는 데 중요한 것으로 보입니다.

초록

Marginating-hepatic (MH) 백혈구(간의 정현파에 부착된 백혈구)는 다른 면역 구획의 백혈구에 비해 독특한 구성과 특성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 특히, 증거는 MH-백혈구 집단의 뚜렷한 전염증 및 항염증 프로필과 생쥐와 쥐 모두에서 순환 또는 비장 면역 세포에 비해 간 특이적 NK 세포(즉, 구덩이 세포)의 세포 독성이 더 높다는 것을 시사합니다. 본원에 제시된 방법은 마우스 및 랫트에서 간의 강제 관류에 의한 MH 백혈구의 선택적 수확을 가능하게 한다. 조직 분쇄 및 생물학적 분해를 포함하여 간 백혈구를 추출하는 데 사용되는 다른 방법과 달리, 이 방법은 다른 간 구획의 세포에 의해 오염되지 않은 간 정현파에서 독점적으로 백혈구를 생성합니다. 또한 관류 기술은 MH 백혈구의 무결성과 생리학적 환경을 더 잘 보존하여 조직 처리에 대한 알려진 생리학적 반응을 보존합니다. 많은 순환 악성 세포와 감염된 세포가 간 정현파를 통과하는 동안 억류되어 내피 세포 및 상주 백혈구와 물리적으로 상호 작용하기 때문에 고유한 MH 백혈구 집단은 비정상적인 순환 세포와 상호 작용, 식별 및 반응하기 위해 전략적으로 배치됩니다. 따라서 MH-백혈구의 선택적 채취 및 다양한 조건에서의 연구는 특히 순환 비정상 세포 및 간 관련 질환 및 암 전이와 관련하여 MH 백혈구의 생물학적, 임상적 중요성에 대한 이해를 증진시킬 수 있습니다.

서론

간 사인 곡선은 유기체에 중요한 다양한 면역 활동의 많은 백혈구 아형이 포함되어 있습니다. 예를 들어,도 덩이 세포로 알려진 간을 marginating (MH), 자연 살해 (NK) 세포, 특징 형태학 큰 과립 림프구 (LG 생명 과학)와 기능적으로 혈액 - 확립에 대하여 간 저항을 가능 자연 세포 독성 용량 백혈구뿐만 매개 종양 전이. 본 명세서에있어서의 목표는 중요한 독특한 세포 집단 (면역 함)을 연구하기 위해 MH 백혈구 선택적 수확을 가능하게하고, 이러한 특정 세포에 대한 각종 조작의 영향 (예 : 면역 활성)을 규명하는 것이다.

현상 원발 종양을 제거하는 면역 장애에도 불구하고, 암 환자 및 동물 모델에서의 증거는 면역계가 종양 세포, 미세 전이 및 throu 잔여 질병을 순환 제어 할 것을 지시GH 세포 매개 면역 (CMI). 그러나, 생체 내 기능과 인간에서 시험 관내 연구에서 가장자가 종양 세포는 순환 또는 비장 백혈구 1,2- 의한 세포 독성에 내성이 있음을 입증 동물, 이들 사이에 명백한 불일치가있다. 이러한 불일치는 별개 백혈구 모집단, 즉 marginating - 간 (정현파) 백혈구 활성화 NK 세포, 즉 세포 덩이 3들의 모집단의 생체 내 존재에 적어도 부분적으로 기인 할 수있다. 사실, 우리의 실험실에서 출판되지 않은 데이터는 F344 쥐에서 동계 종양 세포 순환 및 비장 백혈구에 내성이 발견되었다 (MADB106가), MH-NK 세포 (4)에 의해 용해 된 것으로 나타났다. 따라서, 순환 백혈구에 의심 "NK 내성"이다 종양 세포 MH-NK 세포에 의해 제어 될 수있다. 주목할만한, 마우스에서 MH-NK의 개선 활동은 면역 생체 내에서 다음 분명하다(폴리 I의 사용을 통해 예 : C 또는의 CpG-C) 자극 (5).

간 특정 NK 세포 (NK-MH)은 내피 세포 및 쿠퍼 세포 부착, 정현파 루멘 내부에 위치하고있다. MH-NK 세포는 단독으로 생리 활성 물질로서 7,8- 리소좀 효소 및 퍼포 granzymes와 같은 산성 포스파타제를 포함하는 조밀 한 구형 입자 및 막대 코어 드 소체 (6)을 특징으로한다. NK 세포를 순환과 비교하여, MH-NK 세포 과립 및 소포 9-11 높은 수 및 크기를 나타낸다. NK 세포 순환에 비해 염증 조건 MH-NK 세포, LFA-1 (12)의 더 높은 발현을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 향상된 발현 MH-NK 세포는 NK 세포 13,14 순환 비해 특정 종양 세포에 대해 세포 독성 더있는 메커니즘을 구성 할 수도있다. nterestingly, 인터루킨 (IL) -2와 시험 관내 인큐베이션에 따라, MH-NK 세포가 확대되고,자신의 번호와 과립의 크기는 프로 Fi를 제작 림 포카 인 활성화 킬러의 (LAK) 세포 (15)와 일치 모두 증가.

액티브 MH 백혈구 독점적 그라인딩과 조직의 생물학적 분해에 기초하는 표준 간 백혈구 수확하는 방법을 통해 얻어 질 수 없다. 본원에 기술 된 우리 관류 방법은 표준 방법에 비해 두 가지 장점을 갖는다. 우선, 관류 방법은 선택적으로 다른 간 구획에서 다른 백혈구에 의한 오염을 방지 MH 백혈구를 수확. 조직 처리 손상 세포 것을 접근하거나 형태를 변경하고, 조직 손상으로 인해 현저 면역 조절 다양한 인자의 방출을 유도 달리 둘째, 더 관류 기술, 무결성, 활동, 및 MH 백혈구의 생리적 환경 보존 활동.

간은 암전 A에 대한 중요한 타겟 기관이다차 다양한 감염 16. MH 전지 고유 특성을 나타내는 바와 같이 이들 병변에 대해 다양한 조건에서이 특정 인구를 연구하는 것이 중요하다. 예를 들어, 다양한하는 BRM에 의한 전신 면역 활성화를주의하는 가치가있다 (예를 들면 폴리 I : C 또는의 CpG-C)가 백혈구 5 순환보다 MH-백혈구 더 활성화하는 것으로 나타났다.

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프로토콜

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 텔 아비브 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 쥐 프로토콜

  1. 준비
    1. PBS 헤파린 (30 유닛 / ml) 용액을 준비 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 식염수 (PBS) 1X 버퍼 용액. 동물 당 35 ml의를 계산합니다.
    2. 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다.
    3. (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독.
  2. MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류
    1. 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 이소 플루 란을 포함하는 50 ML 튜브를 배치그 흉강을 열 때까지 쥐의 머리 주위 -soaked 패드.
    2. 호흡 중단시 즉시 간 및 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다. 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오.
      1. 특히, 상부 가슴 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 리브를 향해 대각선 양쪽에 손상을 내장하지 않고 낮은 복부 정중선 점에서 절개, 진행을 시작합니다.
    3. 약 분 내 (~ 250 그램 동물에서 6 ml)에 가능한 한 많은 혈액을 수집 주사기로 우심실에서.
    4. 관류의 수집을 가능하게하는, 마음에 가능한 한 가까운 지혈과 꼬리 대정맥을 클램프.
    5. 포털 정맥을 노출, 실험자의 오른쪽에있는 동물 외부 장과 장소를 잡아 당깁니다.
    6. 가능한 꼬리 같이 문맥으로 연동 펌프 (25)에 연결된 G IV 카테터, 삽입하지만 비장 정맥에 주동이.
    7. 지혈에 꼬리 대정맥에 5 ML의 주사기에 연결된 25 G 나비 바늘을,,, 삽입합니다.
    8. 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 주사기로 혈액으로 오염 관류의 첫 번째 ml의를 수집합니다. 관류 색이 교대로 (약 3 ~ 5 ㎖) 붉은 창백한 때까지 계속합니다. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변화하고 있음을 알 수 있습니다.
    9. 연동 펌프를 정지하지 않고, 20 ml의 수확 주사기와 5 ml의 수확 주사기 교체 관류 고속화 (최대 4 ml / 분)을 이용 간 관류 적어도 20ml를 수집. 연속적으로 포집 주사기 내로 관류 흐름을 모니터링하고, (대정맥 벽 붕괴 통해 바늘을 방해 할 수있는) 너무 강한 진공을 피한다.
    10. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다.
  3. 백혈구 추출
    1. 24 400 XG에서 10 분 동안 관류 액을 원심 분리기 기음.
    2. 뜨는을 기음
    3. 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 뜨는을 대기음. 학습 목표에 기초하여, 그대로 조제를 사용하여, 또는 추가적인 정제를 (예를 들면, 밀도 구배 분리)을 수행.
      1. 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류 액 4 mL로. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀.
      2. 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다.

2. 마우스 프로토콜

  1. 준비
    1. 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 헤파린 PBS (30 단위 / ml) 용액을 준비 식염수 (PBS) 1X solutio 완충엔. 동물 당 20 ㎖를 계산합니다.
    2. 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다.
    3. (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독.
  2. MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류
    1. 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 그 흉강을 열 때까지 마우스의 머리 주위에 이소 플루 란 젖은 패드를 포함하는 15 ML 튜브를 놓습니다.
    2. 침대에 마우스의 사지를 고정합니다.
    3. 그대로 다이아 프램의 하부 측면을 유지, 간 및 호흡 중단시 즉시 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다 (A 배수 흉강 풀을 만들 수 있습니다). 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오.
      1. 특히, 아래에 절개를 시작합니다가슴 위쪽 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 대각선으로 갈비뼈를 향해 양쪽에 복부 정중선 손상 내부 장기가없는 점, 진행,.
    4. 간문맥 노출되도록, 실험자의 오른쪽 바깥 동물 장내 장소를 철수.
    5. 지라 정맥에 포털 정맥 주동이에 연동 펌프에 연결된 30g 바늘을 삽입합니다.
    6. 흉강에서 관류의 배수 및 수집 할 수 있도록 다이어프램 위의 하대 정맥을 잘라.
    7. 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 흉강 풀에서 혈액으로 오염 관류의 제 3 ㎖를 수집합니다.
    8. 이 관류를 폐기하십시오. 필요한 경우 생리 식염수를 사용하여 다시 같은 세척을 반복 한 경우에만 다음 간 관류를 수집하기 시작합니다.
    9. 다시 개시까지 ㎖ / 분 (4)의 속도로 관류 및 사용 흉강에서 관류 액 10 ㎖를 수집주사기에 연결된 나비입니다.
    10. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다.
  3. 백혈구 추출
    1. 원심 분리기 (400)의 X g에서 10 분 동안 관류.
    2. 뜨는을 대기음.
    3. 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 학습 목표를 바탕으로 뜨는을 대기음, 그대로 준비를 사용하거나 추가 정제를 (예를 들어, 밀도 구배 분리)를 실시하고 있습니다.
      1. 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류마다 4 용액. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀.
      2. 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다.

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결과

F344 래트에서 우리는 간 조직의 기계적 분쇄 다음, 전체 간 세포 집단의 세포 독성 (강제 간 관류 간 정현파 수집) MH-NK 세포의 세포 독성을 비교 및​​ 순환 백혈구의 세포 독성에 관한 것이다. 전체 세포 제제는 면역 분석법의 루틴으로 적어도 3 회 세척하고, 목표 세포주로서, 우리는 동종 YAC-1 또는 동계 MADB106 표적 세포주를 사용 하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 4 -, MH-NK 세포는 전체 간세포 집단 (도 1) 모두를 MADB106 및 YAC-1을 표적 세포주 대 (~ 80 % 각각 100 %까지) 심각한 독성을 나타내 반면 순환 백혈구 (도 2 및 3)의 깊이보다 낮은 세포 독성 수준과 동계 MADB106 목표 세포주에 대해 거의 사멸을 표시. 같은 relati기계적으로 처리 간은 또...

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토론

본 명세서 간 관류 방법은 선택적 수확 할 수 있으며 간 백혈구 marginating의 고유 인구 공부. 또한 피트 셀 3이라고 간 NK 세포, 간장 정현파에있는 독특한 NK 세포군을 구성한다. 그들은 쥐, 마우스 (17)과 인간 (18, 19)에서 발견된다. 절연 주변 NK 세포에 비해 피트 셀 작은 세포질 과립 (20)의 더 많은 수, 및 LFA-1 (12) 표면 항원의 이상 발현이 나타났다, YAC-1 및 CC531s 표적 세포 라인 (20)에 대하여 높은 세포 독성을 증명 . 또한, 절연 혈액 NK 세포와 달리 세포 덩이 NK 내성 P815 세포를 용균 할 수있다. 랫트와 유사 구덩이 세포, 인간 간 NK 세포는 NK 세포 18,19 순환 비교하여 NK-K562 민감한 표적 세포에 대해 높은 독성을 가지고, 강한 NK를 Lyse 표적 세포 18에 도시 하였다. Ov...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

저자와 이 작업은 NIH/NCI 보조금 # R01CA172138(SBE에)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Autoclud 연동 펌프
, 버터플라이 바늘,OMG26G
, 버터플라이 바늘OMG21G*3/4"
, 주사기Pic 용액1ml
주사기Pic 용액2.5ml
주사기Pic 용액5ml
주사기Pic 용액10ml
주사기Pic 용액25ml
무뚝뚝한 모서리 집게
가위
지혈
조직 집게
22W 형광 일광 돋보기 램프
, , , ,

참고문헌

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