Method Article

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

DOI:

10.3791/53924

⸱

May 17th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD는 완전히 분화된 많은 비근육 세포주의 근육 전달화를 유도하는 강력한 능력을 가진 근육 전사 인자입니다. 이 전이분화(transdifferentiation)에 관여하는 후성유전학적 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 여기에서는 이중 친화성 정제 방법과 질량 분석법을 설명하여 MyoD 파트너를 철저하게 특성화합니다.

Abstract

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골격 근육 터미널 차별화는 근육 아세포에 만능 중배엽 전구 세포의 의지로 시작합니다. 이러한 세포는 여전히 증식 할 수있는 능력을 가지고 있거나 그들은 근섬유를 형성하도록 더 성숙하다 다핵 myotubes로 차별화 퓨즈있다. 골격근 단말 차별화 특히 근육 규제 요인 또는 MRFs의 멤버 (MyoD이 오게 닌은 Myf5 및 MRF4)는 또한 근육 조직 bHLH 전사 인자 계열이라는 다양한 전사 인자의 협조 작용에 의해 조율된다. 이러한 요인은 골격 근육 생성을 달성하기 위해 정교한 전사 조절 네트워크 내에서 염색질 리모델링 복합체와 협력. 이러한면에서, MyoD 근육 터미널 차별화를 트리거의 마스터 근육 조직 전사 인자로 간주됩니다. 이 개념은 골격근 세포에 비 - 근육 세포를 변환 MyoD의 능력에 의해 강화된다. 여기에서 우리는 MyoD를 식별하는 데 사용되는 방법을 설명골격근 단말 분화에 관련된 다른 요인을 해명하기 위해 철저하게 단백질 파트너. 장기 목표 골격근 유전자의 조절, 즉,., MyoD 타겟 관련된 후생 유전 학적 메카니즘을 이해하는 것이다. MyoD 파트너는 골격근 단말 분화 동안 관련된 파트너의 역할을 확인 하였다 질량 분석 (MS)의 특성에 결합 된 이종 시스템에서 직렬 선호도 그래피 (T​​AP 태그)를 이용하여 식별된다. 근육 재생에 선천성 중증, 근긴장 성 이영양증, 횡문근 육종 결함 : 근육 조직 요인, 또는 비정상적인 규제의 비정상적인 형태, 근육 질환의 수와 연관됩니다. 이와 같이, 근육 조직 인자가 질병의 치료를 향상시킬 수있는 질병 자체 회생기구 원인 메커니즘에 대하여 모두 근육 질환의 잠재적 치료 타겟의 풀을 제공한다. 따라서, 상세한 understan근육 조직 요인에 의해 제어되는 분자간 상호 작용과 유전 적 프로그램 땡 효율적인 치료의 합리적인 디자인을 위해 필수적이다.

Introduction

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진핵 다세포 생물은 다른 기관 및 조직 구성된다. 각 기능 조직 각 분화 단계에서 결정되는 특정 유전자의 발현 패턴을 갖는다. 세포 분화 유전자 세트 세포 증식에​​ 관여하는 등 사람들의 침묵, 일반적으로, 특정 유전자의 활성화, 발현의 유지를 포함하고. 골격근 분화 또는 근육 생성, 즉 근육 아세포로 중배엽 간세포의 결정으로 시작 따라서 다단계 공정, 그 후 제 모노 - 핵 생성하고 다중 핵, myotubes에서 이러한 아세포의 말단 분화를 유도 . 따라서, 근육 아세포는 계속 증식 할 수있는 세포를, "결정"되어 있지만, 그들은 배아 개발하는 동안 또는 성인 근육 재생에 어느 골격 근육 세포에 전적으로 구별하실 수 있습니다 따라서 골격 근육 계통 위해 노력하고 있습니다. 골격근 단말의 처리가 다를entiation 그러한 E2F 대상 유전자 1과 증식 관련 유전자의 결정적인 사일런 리드 근원 세포 전구체 세포의 세포주기에서 영구 출구에서 시작하여 특정 유전자 프로그램 조율된다. 실제로 단말 분화 과정에서, 근육 모세포 증식 정지 골격근 특정 유전자의 발현 및 (2)에 myotubes 아세포의 융합 선행 중요한 단계이다. 이러한 프로그램은 골격근 손상 후 재생 공정 동안에 분화하는 성체 근육 줄기 세포라고도 위성 세포를 허용한다.

포유 동물의 근육 생성이 근육 조직의 기본 나선 루프 나선의 가족에 결정적으로 의존 (bHLH) 전사 자주 골격 근육의 결정 요인 또는 MRFs (근육 규제 요인) (3)의 가족이라 MyoD, Myf5, MRF4 및 오게 닌을, 요인. 그들 각각의 사양 및 DIF에 필수적인 역할을한다골격 근육 세포의 ferentiation과 특정 식 패턴 (4) 5-7 있습니다. Myf5 및 MyoD의 활성화는 근육 조직 계보에 세포를 커밋 결정적인 단계를 구성하고 오게 닌의 후속 표현은 MCK (근육 크레아틴 키나제) 등의 골격근 특정 유전자의 활성화와 근육 생성을 트리거합니다. 근육 조직 bHLH의 전사 인자는 이전에 침묵 궤적 8에서 근육 유전자의 활성화에 MEF2 가족의 구성원들과 협력한다. 또한 다양한 유전자 조절 영역 (8)에서 이른바 E-E 박스 결합 단백질로 알려진 유비쿼터스 bHLH 단백질, E12 및 E47,와 같은 이종 골격근 유전자 전사를 자극한다. 트위스트 이드 (분화 억제제) 및 기타 요인에 부정적인 8 바인딩 E 단백질에 대한 MyoD와 경쟁하여,이 과정을 조절한다.

MyoD 근육 터미널 차별화 9 트리거에서 주요 플레이어로 간주됩니다 그것은 많은 완전 비 분화 된 근육 시스템 10-13의 근원 성 결정 / 분화 (트랜스 분화) 프로그램을 유도하는 능력을 가지고 있기 때문이다. 실제로, MyoD의 강제 표현은 서로 다른 세포 유형의 다른 태생 학적 기원 (12)로부터 유래도 사람들의 트랜스 분화를 유도한다. 예를 들어, MyoD 근육과 같은 세포로 간세포, 섬유 아 세포, 멜라닌 세포, neuroblasts 및 지방 세포로 변환 할 수 있습니다. MyoD의 트랜스 differentiative 작업은 원래의 유전 적 프로그램 (특히, 증식 유전자)의 침묵에 수반 비 근육 환경에서 근육 조직 유전 적 프로그램의 비정상적인 활성화 (특히 그 표적 유전자)를 포함한다.

근육 아세포 증식에 MyoD 표현하지만 그들의 발기인 14 ~ 16에 결합하는 경우에도 그 표적 유전자를 활성화 할 수 없습니다입니다. 따라서, MyoD가 지속적으로 미분화 된 근육 아세포에서 발현되는 대한 요구 사항은 매우 ELU 유지시브. MyoD 이전 염색질 리모델링을 활성화하는 14,17 효소의 로딩에 근육 아세포 증식에 억압 염색질 - 수정 효소의 채용으로 인해 그 표적 유전자를 억제 할 수있다. 예를 들어, 근육 아세포 증식에​​ MyoD은 히스톤 H3 라이신 9 H3K9 및 H3K27 KMTs 포함한 전사 공동 리프레 KAP-1, 히스톤 데 아세틸 라제 (HDACs) 및 억압 리신 methyltransferases (KMTs)와 연관되고, 적극적으로 표적 유전자의 발현을 억제한다 로컬 억압 크로 마틴 구조 14,17을 설정하여. 중요한 것은, 최근의 보고서는 MyoD 자체가 직접 H3K9 KMT G9a가 transactivating 활동 (16)의 억제 결과에 의해 메틸화 인 것으로 나타났다.

MyoD 의한 비 근육 세포의 이러한 트랜스 분화에 관련된 후성 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않다. 특히, 일부 세포주 MyoD 유도 트랜스 분화에 내성이다. 따라서, HeLa 세포에서 MyoD은 하나 또는 비활성심지어 인해 복잡한 SWI / SNF (18) 리모델링 염색질의 BAF60C 서브 유닛의 표현의 부족으로 리프레보다는 전사의 활성화로 작동 할 수 있습니다. 이 모델은 따라서 더 나은 MyoD 유도 유전자 억압의 메커니즘을 특성화하는 선택이 될 수 있습니다. 관련 파트너와 목표 궤적에서 억압 염색질 환경을 유도하기 때문에 터미널 차별화를 미세 조정하는 근육 아세포 증식에 MyoD 종속 억압 메커니즘을 밝히기 위해서 MyoD의 능력을 분석하는 것이 적합하다.

여기에서 우리는 질량 분석기 (MS)의 특성에 결합 탠덤 선호도 정화 (TAP-태그)를 사용하여 MyoD 파트너의 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 안정 플래그-HA-MyoD 발현-S3 헬라 세포의 사용은 분별 핵 추출물에서 MyoD 복합체를 정제하기에 충분한 재료를 얻을 수. 이종 시스템의 MyoD 파트너의 식별은 validati으로 이어졌습니다관련 시스템에.

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Protocol

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헬라-S3 핵 소금 추출 및 염색질 바인딩 된 분수 1. 준비

  1. 세포의 컬렉션
    1. 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (성장 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 헬라-S3 플래그-HA-MyoD 및 헬라-S3 플래그-HA (대조군 세포주) 성장 습기가 인큐베이터에서 37 ° C에서 중간), 5 % CO 2.
      참고 : 안정적으로 국기-HA-MyoD와 헬라-S3 빈 벡터 (헬라-S3 국기-HA)와 형질 발현 세포 헬라-S3 세포에 설명 된 프로토콜을 사용하여 설정 될 수 중 하나 (19, 20)를, 또는 저자에 의해 제공.
    2. 각각의 세포주 (헬라-S3 국기-HA-MyoD와 헬라-S3 국기-HA 세포)의 10 완전히 합류 150mm 요리에 세포를 증폭.
    3. 5 L 스피너에 뜨는 (비 접착 모집단 포함)를 수집합니다.
    4. 객실 템에서 1 분 동안 세포를 Trypsinize, 150mm 접시 당 PBS 10 mL로 부착 모집단을 씻으십시오가능한 온도 (0.05 % 트립신 EDTA의 용액, 15cm 접시 2 ㎖).
    5. 150mm 접시 당 매체의 4 ML을 추가하고 50 ㎖ 튜브에 세포를 수집합니다.
    6. (5 L 스피너의) 단계 1.1.3 단계 1.1.5에서 세포 상층 액을 결합 각 세포주에 대한 신선한 사전 예열 성장 매체 500 ml에 추가 할 수 있습니다.
    7. 5 L 스피너에 세포 현탁액을 전송하고 습한 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 적어도 60 시간 동안 세포를 성장.
    8. 신선한 성장 매체의 500 ML을 추가하고 24 시간 동안 세포를 성장.
    9. 신선한 성장 배지 1 L를 추가하고 24 시간 동안 세포를 성장.
    10. 세포를 계수하고 세포 생존을 확인하는 세포 현탁액 1 ㎖를 꺼내. 색상 혈구를 사용하여 현미경 (30) 푸른 0.4 % 트리 판의 μL 및 계산 살아 (파란색되지 않음) 세포와 세포 현탁액 30 μL.
    11. ; 매일 신선한 성장 배지를 첨가하여 6 × 105 세포 / ml - 2의 셀 밀도를 유지 1 × 106 세포 / ml을 초과하지 않는다. 최대한 5 L 스피너에 대한 볼륨 L. 2.5
      주 : 다음 단계는 (2)의 배치에 의해 진행 - 밀도가 1 × 106 세포 / ml로 배양 2.5 L. 약 20 L를 수집하기 위해 1.1.14 - 반복 1.1.12 단계 다음 단계로 진행하기 전에 각 세포주 (건조 펠릿 ≈ 20g).
    12. 5 분 500 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포 4 ° C에서 상층 액을 버린다.
    13. 4 ° C에서 5 분 500 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 얼음처럼 차가운 PBS 100 ㎖에 재현 탁 세포 펠렛을 씻어.
    14. 빙냉 PBS 25 ㎖로 세포를 재현 탁 50 ㎖ 튜브에 현탁 전사, 4 ℃에서 5 분 동안 500 × g으로 원심 분리하여 세척을 반복한다.
      주 : 세포 펠릿을 즉시 사용 또는 액체 질소에 냉동 며칠 동안 -80 ℃에서 저장 될 수 있습니다.
  2. 핵의 분리
    참고 : 단계 1.2.1 수행 - 추운 방에서 1.4.3.
    1. 사전 냉각 buffeRS 및 균질.
    2. 고정 재료를 사용하면, 빠르게 37 ℃ 수욕에서 세포 펠렛을 해동.
    3. 재현 탁 20g 20ml에 세포 (≈ 20 ㎖) 다음에, 다음 5 mL를 첨가 처음에는 완충액 10 ㎖를 사용하여 추가하여 저장성 완충액 A (표 3)의 (세포 펠렛의 크기에 해당하는 양) 다른 5ml를. 셀의 최대를 얻기 위해 신선한 버퍼 잘 피펫을 씻으십시오.
    4. 꽉 끼는와 유 봉, 사전 냉장 호모 게 나이저로 전송 40 ML의 세포 현탁액.
    5. 균질화 20 스트로크 (및 운동 아웃 20)와 세포를 균질화하고 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
    6. 최대 셀을 복구 할 수 크로즈 완충액 (초기 셀 부피의 1/3, 표 3)를 7 ㎖의 균질화 씻는다. 핵을 유지하고 누설을 제한하는 단계 1.2.5에서 50 ㎖ 튜브에 신속 현탁액을 전송.
    7. 0.4 % (TR)의 30 μL와 30 μL 나누어지는을 얼룩(용해가 성공적으로 수행되면, 모든 핵이 파란색으로한다)에 용해 효율을 제어하기 위해 현미경 분석 청색 ypan. 필요한 경우, 균질화 단계를 반복합니다.
    8. 10,000 XG에 7 분, 4 ° C를위한 원심 분리기는 핵 펠렛합니다. 세포질 부분으로 뜨는을 저장합니다.
  3. 핵 소금 추출 (SE) 분수의 제조
    1. 슈 크로스 완충액 (핵 펠렛의 크기에 해당하는 양)을 8 ml의 핵 펠렛을 재현 탁. 와류 높은 염 완충액 (1 핵 펠렛 부피, 표 3)를 8 mL의에 충분히 혼합하여 300 mM의 염화나트륨의 최종 농도를 얻기 위해 동시에 적가 추가. 얼음에 30 분 동안 품어마다 5 분을 섞는다.
    2. 슈 크로스 완충액 8 ㎖ (총 용적의 1/3)을 첨가하여 150 mM의 염화나트륨 농도를 감소시킨다. 13,000 XG에 10 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 상층 액 (핵 소금 추출 분획, SE)를 수집합니다.
      참고 : 어느 SE를 1.3.3 단계 또는 탈퇴 진행염색질 바인딩 부분 모두 분수 동시에 다음 초 원심 분리기의 준비 기간 동안 얼음 분수.
    3. 4 ° C에서 85,000 XG에 30 분 동안 초 원심 분리기 SE. 상층 액 (≈ 26 ml)에 가져 가라.
    4. 액체 질소에서 100 μL 나누어지는을 동결. 추출물의 나머지 부분을 사용하여, 2 "단백질 복잡한 정제"단계로 진행합니다.
      주 : 분취 단계 5.1.1 동안 입력 제어로 사용하여야한다.
  4. 염색질 바인딩 된 분수의 제조
    1. 펠렛을 재현 탁하고 (단계 1.3.5에서를.) 꼼꼼하게 7 ml의 자당 버퍼 (펠릿의 크기에 해당하는 양).
    2. MNase (단계 1.4.4)를 활성화하고 혼합 1 mm의 최종 농도 (현탁액을 14 ml의 0.5 M CaCl2를 28 μL)에 염화칼슘 (2)를 추가합니다.
    3. 37 ℃에서 1 분간 예열 서스펜션.
    4. 0.5에서 0.0025 U / μL (1/200 희석의 최종 농도를 얻기 위해 70 μL를 micrococcal 클레아 제 (MNase)를 추가U / μL 주식)과 혼합한다.
    5. 37 ° C에서 정확하게 12 분을 품어. 매 4 분 섞는다.
    6. 즉시 얼음에 반응을 놓습니다.
    7. , MNase 활동을 중지 4 mm의 최종 농도 0.5 M EDTA pH를 8.0 (1/125 희석)의 112 μl를 추가합니다. 얼음에 5 분 동안 품어.
    8. 초음파 처리는 두 sonications 사이의 높은 진폭에서 1 분 5 시간, 1 분 (총 10 분)의 휴식을 할 수 있습니다.
    9. 85,000 XG에 30 분, 4 ° C에 대한 초 원심 분리기.
    10. 상층 액 (뉴 클레오 농축 분획, NE, ≈ 12 ml)에 수집합니다.
    11. 액체 질소에 50 μL 나누어지는을 동결. 추출물의 나머지 부분을 사용하여, 2 "단백질 복잡한 정제"단계로 진행합니다.
      주 : 분취 단계 5.1.1 동안 입력 제어로 사용하여야한다.

2. 단백질 단지 정화

참고 : 각각의 세포주 (헬라-S3 국기-HA-MyoD 및 제어, HEL에서 병렬 추출물에서 진행A-S3 국기-HA).

  1. 플래그 - 기반 정제
    1. 사전 세척 플래그 수지. 각각의 실험 점 (각 세포주에 대한 SE 및 NE 분수)에 대한 (상업 50 % 재고)의 국기 수지의 600 μl를 사용합니다.
    2. 15 ML 튜브로 전송 수지, 1,000 XG에 2 분 동안 차가운 TEGN (표 3), 원심 분리기 (13) 용액에 재현 탁하고 상층 액을 제거합니다. 5 번 반복합니다. TEGN의 동량 (각 실험 포인트 300 μL)에 마지막 세척에 resuspend 플래그 수지 후.
    3. 각 실험적 포인트를 들어, 600 씻어 플래그 수지 μL와 해당 단백질 추출물 (26 ml의 SE 유분 12 ML의 NE하는 15ml의 튜브와 50 ㎖ 튜브에서 각각)을 혼합한다. 4 ° C에서 회전 휠 하룻밤에 품어.
    4. 4 ° C에서 1,000 XG에 2 분 동안 원심 분리기, 옆으로 뜨는을 넣어 정화 효율 시험 (2.2)의 결과까지 4 ° C에서 보관하십시오.
    5. 남동쪽 샘플 플래그 수지 재현 탁15 ML 튜브에 TEGN 및 전송의 4 ml를한다. 이 단계를 3 번​​ 반복, 동일한 15 ML 튜브로 전송마다 구슬 손실을 방지합니다. 1000 XG, 4 ° C와 뜨는을 제거 원심 분리기 2 분.
    6. 워시 플래그 수지 TEGN 13 ml의를 사용하여 1,000 XG, 4 ℃에서 2 분 원심 분리 15 ML 튜브에서 7 번.
    7. 1.5 ml의로 지난 1 ml의 TEGN에서 세척,에 resuspend 및 전송 후 튜브를 낮은 결합. 1000 XG, 4 ° C와 뜨는을 제거 원심 분리기 2 분.
    8. 각각의 실험 점의 pH가 7.8에서 4 ㎎ / ㎖에서 플래그 펩티드 용액 200 μL에 재현 탁. 구슬과 펩타이드를 섞는다. TEGN 버퍼의 200 μl를 추가하고 적어도 4 시간 또는 결합 된 단백질을 용출 밤새 4 ° C에서 품어.
    9. 4 ° C에서 1,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기와 수지와 상층 액 (플래그 용출액) 2 ML 튜브에 넣고 빈 스핀 컬럼에 전송합니다.
    10. 원심 분리기는 열, 수집 왼쪽 위에 2 ML 튜브에 뜨는.
    11. 컬럼에 TEGN 버퍼를 추가하여 플래그 수지를 수집하고 각각의 실험 점 밤새 4 ° C에서 플래그 펩티드 용액 200 μL (4 ㎎ / ㎖)와 두 번째 플래그 용출로 진행합니다.
    12. 두 번째 용출를 수집 2.1.10 - 반복 2.1.9 단계를 반복합니다. 제 1 및 제 2 용출액을 결합합니다.
  2. 정화 효율 시험
    참고 : 단계 2.1.11 동안 - 2.1.12, SDS-PAGE 및 실버 염색 (- 2.2.2 2.2.1)를 수행합니다.
    1. , 용출액의 15 μl를 타고 배 로딩 버퍼의 5 μl의 10 배 환원제의 2 μl를 추가, 96 ℃에서 5 분간 끓여와 SDS 폴리 아크릴 아미드 4 실행 - 제조업체의 지침에 따라 12 % 젤.
    2. 실버 염색 키트를 사용하여 젤 얼룩 (제조업체의 지침에 따라). 국기-HA-MyoD 및 국기-HA 사이의 단백질 패턴의 명확한 차이 모의 용출액의 국기-HA MyoD의 특히 밴드가있는 경우 (50 kDa의, 그림 1A 주위), 다음 인트로 진행피.
  3. 헤 마글 루티 닌 (HA) 기반 정제
    1. 15 ML 튜브로 전송 TEGN 13 ㎖에 재현 탁하고 4 ℃에서 1,000 XG에서 2 분 원심 분리하여 세척 HA 수지. 반복 세척 단계 5 회. TEGN 버퍼의 동일한 볼륨에서 마지막 세척을 Resuspend 구슬 후.
      주 : 볼륨 플래그 기반 정제의 효율에 따라 조절되어야한다. 각각의 실험 점의 상업 50 %의 재고 300 ㎕를 시작합니다.
    2. 1.5 ml의 낮은 바인딩 튜브에 각각의 실험 점 HA 수지를 전송합니다. 원심 분리기 2 분 4 ° C에서 1,000 XG에서, 세척 버퍼 (표 3)의 최대를 제거하고 HA 수지에 국기 기반 정제에서 용출액을 추가합니다.
    3. 4 ° C에서 회전 휠 하룻밤에 튜브를 품어.
    4. 4 ° C에서 1,000 XG에 2 분 동안 원심 분리기, 옆으로 뜨는을 넣어 정화 효율 시험 결과까지 4 ° C에서 유지 (2.3.12.).
    5. 레, TEGN 0.5 ml의에서 HA 수지를 일시 중지 1.5 ml의 튜브를 결합 새로운 낮은 전송합니다. 1000 XG, 4 ° C에서 구슬과 원심 분리기 2 분 손실을 방지하기 위해 한 번 같은 1.5 ML 튜브에 추가 부유를 반복합니다. 상층 액을 제거합니다.
    6. (손실 구슬을 방지) 뜨는, TEGN 1 ml의 각 시간을 사용하여 1,000 XG에 2 분, 4 ° C를 원심 분리 및 제거하여 구슬을 8 회 반복한다. 마지막 세척 후, 0.5 ml의 튜브에 구슬을 전송합니다.
    7. 가능한 상층 액을 제거합니다. 결합 된 단백질을 용출하는 구슬의 pH 7.8에서 HA 무료 펩티드 용액 (4 ㎎ / ㎖) 100 ㎕를 추가합니다. 4 ℃에서 하룻밤 회전 바퀴에 품어.
      주 : HA 펩티드의 양이 복합체의 풍부에 따라 조절되어야한다.
    8. 4 ° C에서 1,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기와 2 ML 튜브에 넣고 빈 스핀 컬럼에 수지와 상층 액 (HA 용출)를 전송합니다.
    9. 2 ML 튜브에 왼쪽 위에 뜨는를 수집하기 위해 열을 원심 분리기.
    10. 각 실험 지점에 대한 HA 펩티드 100 ㎕ (4 ㎎ / ㎖)와 두 번째 용출을 수행합니다. 4 ℃에서 하룻밤 회전 바퀴에 품어. 단계를 반복 2.3.8 - 2.3.9는 두 번째 용출를 수집합니다.
    11. 제 1 및 제 2 용출액을 결합합니다.
    12. SDS-PAGE와 실버 염색에 의한 시험 정화 효율 (단계 2.2를 참조하십시오.) (그림 1A).
    13. 제조업체의 지시에 따라 10 kDa의 컷오프 (명목 분자량 한계 NMWL) 원심 필터 유닛을 이용하여 30 μL로 HA 용출액을 농축시킨다.
    14. 22.5 (3/4) 및 7.5 (1/4) μL : 두 부분으로 집중 샘플을 나눈다. 스냅 -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 샘플의 1/4을 동결. 3 단계의 3/4 부분을 사용합니다.
      주 : 1/4 냉동 제품은 웨스턴 블롯에 의해 질량 분석 결과의 확인을 위해 사용되는 (단계 5.1 참조).

3. 질량 분석 분석

참고 : 다음 단계는 분석을 수행 할 질량 분석 설비와 논의해야합니다.

  1. 배 로딩 버퍼의 7.5 μl의 10 배 환원제의 3.3 μL로 샘플의 3/4 (22.5 μl를) 보완하고 96 ℃에서 5 분간 끓인다.
  2. 12 % 젤 - SDS 폴리 아크릴 아미드 4로드 샘플. 150 V 상수 5 분에서 실행 젤은 모든 단백질을 분리하지 않고 젤을 입력 할 수 있습니다.
  3. 물 젤을 씻어; 다음 울트라 깨끗한 물에 고정 젤 5 번 씻어 정착 용액 (10 % 아세트산, 50 % 메탄올, 40 % 울트라 깨끗한 물)와 30 분 - 20 수정.
  4. 1.5 ML 튜브에 물 1 ㎖의 단백질, 저장소를 포함하는 밴드를 잘라 질량 분석 시설로 보낼 수 있습니다.

4. 데이터 분석

주 :이 해석을위한 일반적인 지침이다. 정확한 단계는 MS 시설에 의해 주어진 데이터의 특정 모드에 따라 달라집니다분석을 수행하기 위해 사용되는 (예를 들어, 21, 22).

  1. 음성 대조군 대비 해당로부터 얻어진리스트 "MyoD"용출액에서 식별 된 단백질의 목록을 비교한다. 분석에서 모두 목록에있는 단백질을 제외합니다.
  2. 나머지 목록에서 확인 된 펩티드의 ≤2 총이 단백질을 제거합니다.
  3. 액세스 기능 주석과 DAVID 생물 정보학 자료를 이용하여 단백질의 획득 목록의 기능 분류 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)과 단백질 (23, 24)의 목록을 분류합니다.
  4. (선택 사항) 부정적인 DNA (25) 충전 할 바인딩 강한 외래와 비핵 단백질 충전 목록 "히치하이커"에서 제거합니다. 이러한 세포 골격, 세포질, 미토콘드리아, 막과 수용체 단백질을 포함 (단백질 폴딩, 표 1에서 세포 뼈대 및 기타 그룹 단백질과 2).
  5. 각 분획 (그림 2)에 대한 특정 일반적인 단백질과 단백질을 식별하기 위해 SE 및 NE 분수에서 MyoD의 인터랙의 획득 목록을 비교합니다.

서양의 얼룩에 의해 확인 된 인터랙 5. 확인

  1. 헬라-S3 국기-HA-MyoD와 헬라-S3 국기-HA에서 확인
    1. 해동 용출액 샘플은 얼음 단계 2.3.14 (7.5 μL)에서 얻을. TEGN 버퍼의 12 μL, 4 배 로딩 버퍼의 10 μL 및 환원제 10 배의 3 μl를 추가합니다. 96 ° C에서 5 분간 삶아 샘플.
    2. 서쪽 블로 팅에 대한 입력 샘플을 준비합니다.
      1. 단계 1.3.9 및 1.4.11에서 분취 액을 해동 및 BCA 키트 (제조업체의 지침에 따라)를 사용하여 예를 들어, 단백질 농도를 측정한다.
      2. 레인 당 단백질의 15 μg의를 사용합니다. 추출물의 적절한 양을 측정하고 TEGN 버퍼 15 μL로 샘플의 볼륨을 조정합니다.
      3. 5 ㎕의 4 배 로딩 버퍼를 추가하고1.5 ㎕의 10 배 환원제. 96 ° C에서 5 분간 삶아 샘플.
    3. 용출액 샘플의 15 μl를 사용하여 (MS 분석에서 확인 된 파트너 후보에 대한 특정) 관심의 항체와 함께 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 내인성 단백질 수준 (도 3a)의 제어로 입력 된 추출물을 사용한다.
  2. 관련 셀룰러 시스템에서 확인
    1. C2C12 마우스 근육 아세포의 전체 핵 추출물의 제조.
      1. 습한 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 15 % 소 태아 혈청이 보충 된 DMEM 배지, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신에 C2C12 마우스 아세포 성장. 절대로 증식 상태에있는 세포를 유지하기 위해 80 %의 세포 합류를 초과하지 않습니다.
      2. 면역 침전 1 점 (한 항체) (IP)에 대한 C2C12의 적어도 두 개의 150mm 요리를 성장. , 매체를 대기음 PBS 10 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
      3. 세포를 긁어, 15 ML 튜브에 수집합니다. 세륨4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 ntrifuge. 폐기 뜨는.
      4. 세포 펠렛 (= V 셀)의 양을 추정한다. 부드럽게 세포질 막 (표 3)를 방해 저압 성 완충액 B의 3 볼륨 V 셀 펠렛을 재현 탁.
      5. 10 % X 0.44 V 세포 부피 추가 NP-40을 1 %의 최종 농도에 도달하기 위해 (V / V). 부드럽게 섞어 튜브를 여러 번 반전.
      6. 핵 무결성을 유지하기 위해 SR (표 3)의 0.89 X V 세포 부피를 추가합니다. 조심스럽게 핵을 펠렛 2,000 XG에서 5 분 동안 정지하고, 원심 분리기를 균질화 튜브를 여러 번 반전.
      7. 상층 액 (세포질 부분)를 제거합니다. 핵 펠릿 (= V의 NUC)의 양을 추정한다. 자당 버퍼의 하나의 볼륨 V의 NUC에 재현 탁 핵 펠렛.
      8. 높은 염 완충액 와류 한 체적 V의 NUC에서 충분히 혼합하여 300 mM의 최종 농도를 얻기 위해 동시에 적가 추가염화나트륨, 얼음에 30 분 동안 품어. 매 5 분을 섞는다.
      9. 자당 버퍼의 하나의 볼륨 V의 NUC를 추가하고 염화칼슘 2 (최종 농도 1 mM)을 (150 mM의 염화나트륨 농도를 감소합니다). 혼합.
      10. 예열 현탁액을 37 ℃에서 1 분간, 농도 0.0025 U / μL (0.5 U / μL의 재고 1/200)의 최종 얻을 micrococcal 클레아 제를 추가합니다. 혼합.
      11. 37 ° C에서 정확하게 12 분을 품어. 매 3 분 섞는다.
      12. 즉시 얼음에 반응을 배치하고 MNase 활동을 중지 EDTA (최종 농도 4 mm)를 추가합니다. 얼음에 5 분 동안 품어.
      13. 초음파 처리 높은 진폭 0.5 분마다 5 회. 이 sonications 사이에 0.5 분 (총 5 분)의 휴식을 할 수 있습니다.
      14. 85,000 XG에 30 분, 4 ° C에 대한 울트라 원심 분리기. 상층 액 (전체 핵 추출물)를 수집합니다.
      15. (제조업체의 지침에 따라) BCA 키트를 사용하여 예를 들어, 전체 핵 추출물의 단백질 농도를 측정하고 immediat 진행엘리 5.2.2로 진행한다.
    2. 내생 MyoD의 면역 침전 (IP).
      1. , 추출물 명백한 사전에 각 IP 포인트 단백질 G 아가로 오스 비즈의 10 μl를 세척합니다.
        1. 1,800 XG에서 2 분 동안 차가운 TEGN, 원심 분리기의 1.4 ml의 1.5 ML 튜브,에 resuspend에 단백질 G 아가로 오스 비즈의 필요한 볼륨을 전송하고 상층 액을 제거합니다. 3 번 반복합니다.
      2. 전체 핵 추출물의 적절한 용적으로 미리 세정 단백질 G 아가 로스 비드를 섞는다. IP 지점 당 전체 핵 추출물 단백질의 500 μg의를 사용합니다.
      3. 추출물을 사전에 취소 2 시간 동안 4 ° C에서 회전 바퀴에 품어.
      4. 4 ° C에서 1,800 XG에 5 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 유지합니다.
      5. 1.5 ml의 낮은 바인딩 튜브에 500 μg의 사전 허가 전체 핵 추출물을 토끼 IgG를 5 MyoD 순이의 μg의 5 μg의 혼합. TEGN 1 ml의 최대 버퍼에 추가합니다. 밤새 4 ° C에서 회전 바퀴에 품어.
        주 : F를 수행단계 5.2.2.3 동안 단계를 따르게.
      6. IP 지점 당 사전 세척 7.5 ㎕의 단백질 A / G 재고 비즈 솔루션입니다.
        1. 2 분 동안 4 ° C에서 1,800 XG에 TEGN 원심 분리기 1 ml의 1.5 ML 튜브로에 resuspend 구슬 구슬 필요한 볼륨을 전송합니다. 뜨는을 제거합니다. 3 번 반복합니다.
      7. 밤새 4 ° C에서 회전 휠 솔루션 (표 3)과 부화를 차단 1.5 용액에 재현 탁 단백질 A / G 구슬.
      8. 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 애비 (단계 5.2.2.5)와 함께 배양 원심 분리기 전체 핵 추출물. 뜨는을 유지합니다.
      9. 원심 분리기는 4 ° C에서 2 분 동안 1,800 XG에서 단백질 A / G 수지 (단계 5.2.2.7)를 차단했습니다. TEGN 버퍼의 1 ml의 상층 액과에 resuspend 폐기하십시오. 다시 원심 분리기 4 ° C에서 2 분 동안 1,800 XG에서 버퍼를 차단 씻어합니다.
      10. 재현 탁 차단 단백질 A / G 7.5 μL의 BLO을 구하는 새로운 낮은 단백질 - 결합 튜브에 TEGN 버퍼 분취 액 1 ㎖에 수지IP 지점 당 cked 단백질 A / G 수지. 2 분 4 ° C에서 1,800 XG에 원심 분리기 등 많은 뜨는 가능한 한 제거합니다.
      11. 복근 배양 전체 핵 추출물을 추가 (또는 IgG의 제어)에 A / G 수지에. 믹스와 회전 바퀴에 실온 (RT)에서 2 시간 동안 품어.
      12. 원심 분리기 정지 2 분 동안 실온에서 1,800 XG. 새로운 낮은 바인딩 튜브에 세척 버퍼 및 전송 현탁액 1 ㎖에 뜨는,에 resuspend 폐기하십시오. 5 분 동안 회전 바퀴에 RT에서 품어.
      13. 세척 완충액 1 ㎖에서 2 분 동안 실온에서 1800 XG, 재현 탁 원심 분리기의 현탁액을 5 분 동안 회전 바퀴에 RT에서 배양한다. 4 번 반복합니다. 새로운 낮은 바인딩 튜브 마지막 세척 전송하십시오.
      14. 상층 액의 최대를 제거합니다. , 세척 버퍼의 7 μL, 4 배 로딩 버퍼 7 μL와 구슬에 환원제 10 배의 3 μl를 추가 혼합하고 96 ℃에서 5 분간 끓인다.
      15. INT의 항체와 함께 웨스턴 블롯 분석을 수행erest (면역에 대한 파트너 후보에 대한 특정 단백질을 침전). 내인성 단백질 수준 (그림 3B)의 제어로 입력 추출물의 1 % (5 μg의)를 사용합니다.

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Results

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MyoD 활성의 조절을 이해하기 위해서 질량 분석 (MS)에 의해 다음의 두 MyoD 태그 형태의 immunopurification에 기초한 생화학 적 정제를 사용 MyoD 착체의 완전한 특성화 착수. 플래그-HA-태그 MyoD 플래그-HA 허가를 발현 제어 세포주를 발현 헬라-S3 세포주의 사용 플래그-HA-MyoD 이중 화성 정제를 수행하여 MyoD 복합체를 정제하기에 충분한 재료를 얻을 수있다.

우리는에 핵 부분을 분획 추가 한 다음, 세포질과 핵 분수에 세포 추출물을 분획 소금 추출 (핵 소금 추출, SE) 및 뉴 클레오 위해 (뉴 클레오 강화, NE) 분수를 강화. 이러한 분리 된 핵 분수 (그림 1, 표 1 및 표 2)에서 TAP-태그 정화는 상대적으로 낮은 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 방법은 전사 인자, MyoD의 파트너 철저한 식별을 허용한다. 그것은 MyoD 유도 분화, 즉 헬라-S3 세포에 강한 이종 시스템에서 MyoD 파트너를 한 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, 정의, 식별 MyoD 파트너는 보편적으로 표현된다. 이러한 일반 및 서열 - 특이 적 전사 요소, 염색질 변형 효소, RNA 프로세싱 단백질 키나제 (표 1 및 2)를 포함한다. 헬라-S3 세포 MyoD 유도 트랜스 분화에 내성이므로 MyoD 활성은 주로 억압하고 식별 파트너 MyoD 공동 리프레 될 가능성이 높다. 이것은 MyoD 전이 활성 능력을 저해 8 알려져 이드 단백질 (표 1 및 표 2,도 2)의 존재에 의해 강조된다. 중요한 것은, 이러한 억압 상태는 근육 아세포 증식의 MyoD 상태에 해당합니다. 사실, 우리는 CBFβ하는 MyoD와 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ait-Si-Ali 연구실의 연구는 Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon)의 지원을 받았습니다. 국립 암 연구소(INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS입니다. 파리 디드로 대학교(Université Paris Diderot)와 '나는 누구인가?' Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071은 AN#ANR R이 운영하는 "미래를 위한 투자" 프로그램을 통해 프랑스 정부의 자금 지원을 받았습니다. EB는 INCa 보조금의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
세포주
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipment
SpinnerCorning778531
Homogenizer:  Dounce 균질화기 Wheaton432-1273 및 432-1271
스피너용 교반 장치Bellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
혈구계Marienfeld Superior 640610
저결합 튜브Sorenson27210
빈 스핀 컬럼Bio-Rad7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gelLife technologiesNP0336BOX
4x loading buffer Life technologiesNP0007
10x 환원제Life technologiesNP0004
은 염색 키트Life technologiesA8592
원심 필터 유닛, 10KMilliporeUFC501024
Protein G agarose beadsSigma-AldrichP4691
Protein A/G  수지Thermo Scientific53132
Flag 수지 (anti-Flag M2-agarose 친화성 겔)Sigma-AldrichA2220
HA 수지 (monoclonal Anti-HA agarose)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Flag free peptide (DYKDDDDK)Ansynth Service BVCustom synthesis50 mM에서 최대 4 mg/ml 재현탁 Tris-HCl, pH 7.8
HA 유리 펩타이드(YPYDVPDYA)Ansynth Service BV맞춤형 합성50mM Tris-HCl, pH 7.8에서 최대 4mg/ml까지 재현탁
Bicinchoninic acid 기반 단백질 분석 키트 : BCA 키트Thermo Scientific23225
프로테아제 억제제Sigma-AldrichS8830
루미놀 기반 향상된 화학발광(ECL) HRP 기질Life Technologies34075
BSA시그마-알드리치A9647
전단 연어 정자 DNA (연어 고환에서 추출한 디옥시리보 핵산 나트륨 염)시그마-알드리치D1626
스페르민 테트라하이드로클로라이드시그마-알드리치S1141
스페르미딘시그마-알드리치S0266
글리세롤시그마-알드리치G5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS 러닝 버퍼Life technologiesNP0001
DMEM (고포도당)Sigma-AldrichD0822사전 예열  at 37 ° 사용 전
C Trypsin-EDTA (0.05% 페놀 레드Life technologies25300-054
SerumGE healthcare life sciences PAA A15-102각 로트의 혈청은 먼저 세포에 대해 테스트해야 합니다.
페니실린과 스트렙토마이신 Life technologies15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4%Life technologies15250-061
물(멸균 여과)Sigma-AldrichW3500
항체
HA from rat (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758웨스턴 블로팅에 사용
MyoDSanta CruzSC-760면역침전 및 웨스턴 블로팅에 사용
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1세포 신호 기술8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5산타 크루즈SC-302
TubulinSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG 마우스산타 크루즈SC-2025
IgG 토끼산타 크루즈SC-2027
염소 안티-랫 -HRPSigma-AldrichA9037
염소 안티-토끼 -HRPSigma-AldrichA6154 
염소 안티 마우스 -HRPSigma-AldrichA4416

References

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