MyoD는 완전히 분화된 많은 비근육 세포주의 근육 전달화를 유도하는 강력한 능력을 가진 근육 전사 인자입니다. 이 전이분화(transdifferentiation)에 관여하는 후성유전학적 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 여기에서는 이중 친화성 정제 방법과 질량 분석법을 설명하여 MyoD 파트너를 철저하게 특성화합니다.
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이 논문에서
요약
초록
골격 근육 터미널 차별화는 근육 아세포에 만능 중배엽 전구 세포의 의지로 시작합니다. 이러한 세포는 여전히 증식 할 수있는 능력을 가지고 있거나 그들은 근섬유를 형성하도록 더 성숙하다 다핵 myotubes로 차별화 퓨즈있다. 골격근 단말 차별화 특히 근육 규제 요인 또는 MRFs의 멤버 (MyoD이 오게 닌은 Myf5 및 MRF4)는 또한 근육 조직 bHLH 전사 인자 계열이라는 다양한 전사 인자의 협조 작용에 의해 조율된다. 이러한 요인은 골격 근육 생성을 달성하기 위해 정교한 전사 조절 네트워크 내에서 염색질 리모델링 복합체와 협력. 이러한면에서, MyoD 근육 터미널 차별화를 트리거의 마스터 근육 조직 전사 인자로 간주됩니다. 이 개념은 골격근 세포에 비 - 근육 세포를 변환 MyoD의 능력에 의해 강화된다. 여기에서 우리는 MyoD를 식별하는 데 사용되는 방법을 설명골격근 단말 분화에 관련된 다른 요인을 해명하기 위해 철저하게 단백질 파트너. 장기 목표 골격근 유전자의 조절, 즉,., MyoD 타겟 관련된 후생 유전 학적 메카니즘을 이해하는 것이다. MyoD 파트너는 골격근 단말 분화 동안 관련된 파트너의 역할을 확인 하였다 질량 분석 (MS)의 특성에 결합 된 이종 시스템에서 직렬 선호도 그래피 (TAP 태그)를 이용하여 식별된다. 근육 재생에 선천성 중증, 근긴장 성 이영양증, 횡문근 육종 결함 : 근육 조직 요인, 또는 비정상적인 규제의 비정상적인 형태, 근육 질환의 수와 연관됩니다. 이와 같이, 근육 조직 인자가 질병의 치료를 향상시킬 수있는 질병 자체 회생기구 원인 메커니즘에 대하여 모두 근육 질환의 잠재적 치료 타겟의 풀을 제공한다. 따라서, 상세한 understan근육 조직 요인에 의해 제어되는 분자간 상호 작용과 유전 적 프로그램 땡 효율적인 치료의 합리적인 디자인을 위해 필수적이다.
서론
진핵 다세포 생물은 다른 기관 및 조직 구성된다. 각 기능 조직 각 분화 단계에서 결정되는 특정 유전자의 발현 패턴을 갖는다. 세포 분화 유전자 세트 세포 증식에 관여하는 등 사람들의 침묵, 일반적으로, 특정 유전자의 활성화, 발현의 유지를 포함하고. 골격근 분화 또는 근육 생성, 즉 근육 아세포로 중배엽 간세포의 결정으로 시작 따라서 다단계 공정, 그 후 제 모노 - 핵 생성하고 다중 핵, myotubes에서 이러한 아세포의 말단 분화를 유도 . 따라서, 근육 아세포는 계속 증식 할 수있는 세포를, "결정"되어 있지만, 그들은 배아 개발하는 동안 또는 성인 근육 재생에 어느 골격 근육 세포에 전적으로 구별하실 수 있습니다 따라서 골격 근육 계통 위해 노력하고 있습니다. 골격근 단말의 처리가 다를entiation 그러한 E2F 대상 유전자 1과 증식 관련 유전자의 결정적인 사일런 리드 근원 세포 전구체 세포의 세포주기에서 영구 출구에서 시작하여 특정 유전자 프로그램 조율된다. 실제로 단말 분화 과정에서, 근육 모세포 증식 정지 골격근 특정 유전자의 발현 및 (2)에 myotubes 아세포의 융합 선행 중요한 단계이다. 이러한 프로그램은 골격근 손상 후 재생 공정 동안에 분화하는 성체 근육 줄기 세포라고도 위성 세포를 허용한다.
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프로토콜
헬라-S3 핵 소금 추출 및 염색질 바인딩 된 분수 1. 준비
- 세포의 컬렉션
- 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (성장 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 헬라-S3 플래그-HA-MyoD 및 헬라-S3 플래그-HA (대조군 세포주) 성장 습기가 인큐베이터에서 37 ° C에서 중간), 5 % CO 2.
참고 : 안정적으로 국기-HA-MyoD와 헬라-S3 빈 벡터 (헬라-S3 국기-HA)와 형질 발현 세포 헬라-S3 세포에 설명 된 프로토콜을 사용하여 설정 될 수 중 하나 (19, 20)를, 또는 저자에 의해 제공. - 각각의 세포주 (헬라-S3 국기-HA-MyoD와 헬라-S3 국기-HA 세포)의 10 완전히 합류 150mm 요리에 세포를 증폭.
- 5 L 스피너에 뜨는 (비 접착 모집단 포함)를 수집합니다.
- 객실 템에서 1 분 동안 세포를 Trypsinize, 150mm 접시 당 PBS 10 mL로 부착 모집단을 씻으십시오가능한 온도 (0.05 % 트립신 EDTA의 용액, 15cm 접시 2 ㎖).
- 150mm 접시 당 매체의 4 ML을 추가하고 50 ㎖ 튜브에 세포를 수집합....
- 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (성장 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 헬라-S3 플래그-HA-MyoD 및 헬라-S3 플래그-HA (대조군 세포주) 성장 습기가 인큐베이터에서 37 ° C에서 중간), 5 % CO 2.
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결과
MyoD 활성의 조절을 이해하기 위해서 질량 분석 (MS)에 의해 다음의 두 MyoD 태그 형태의 immunopurification에 기초한 생화학 적 정제를 사용 MyoD 착체의 완전한 특성화 착수. 플래그-HA-태그 MyoD 플래그-HA 허가를 발현 제어 세포주를 발현 헬라-S3 세포주의 사용 플래그-HA-MyoD 이중 화성 정제를 수행하여 MyoD 복합체를 정제하기에 충분한 재료를 얻을 수있다.
우리는에 핵 부분을 분획 추가 한 다음, 세포질과 핵 분수에 세포 추출물을 분획 소금 추출 (핵 소금 추출, SE) 및 뉴 클레오 위해 (뉴 클레오 강화, NE) 분수를 강화. 이러한 분리 된 핵 분수 (그림 1, 표 1 및 표 2)에서 TAP-태그 정화는 상대적으로 낮은 .......
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토론
제시된 방법은 전사 인자, MyoD의 파트너 철저한 식별을 허용한다. 그것은 MyoD 유도 분화, 즉 헬라-S3 세포에 강한 이종 시스템에서 MyoD 파트너를 한 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, 정의, 식별 MyoD 파트너는 보편적으로 표현된다. 이러한 일반 및 서열 - 특이 적 전사 요소, 염색질 변형 효소, RNA 프로세싱 단백질 키나제 (표 1 및 2)를 포함한다. 헬라-S3 세포 MyoD 유도 트랜스 분화에 내성이므로 MyoD 활성은 주로 억압하고 식별 파트너 MyoD 공동 리프레 될 가능성이 높다. 이것은 MyoD 전이 활성 능력을 저해 8 알려져 이드 단백질 (표 1 및 표 2,도 2)의 존재에 의해 강조된다. 중요한 것은, 이러한 억압 상태는 근육 아세포 증식의 MyoD 상태에 해당합니다. 사실, 우리는 CBFβ하는 MyoD와 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Ait-Si-Ali 연구실의 연구는 Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon)의 지원을 받았습니다. 국립 암 연구소(INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS입니다. 파리 디드로 대학교(Université Paris Diderot)와 '나는 누구인가?' Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071은 AN#ANR R이 운영하는 "미래를 위한 투자" 프로그램을 통해 프랑스 정부의 자금 지원을 받았습니다. EB는 INCa 보조금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포주 | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce 균질화기 | Wheaton | 432-1273 및 432-1271 | |
| 스피너용 교반 장치 | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| 혈구계 | Marienfeld Superior | 640610 | |
| 저결합 튜브 | Sorenson | 27210 | |
| 빈 스핀 컬럼 | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x 환원제 | Life technologies | NP0004 | |
| 은 염색 키트 | Life technologies | A8592 | |
| 원심 필터 유닛, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G 수지 | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag 수지 (anti-Flag M2-agarose 친화성 겔) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA 수지 (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | 50 mM에서 최대 4 mg/ml 재현탁 Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA 유리 펩타이드(YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | 맞춤형 합성 | 50mM Tris-HCl, pH 7.8에서 최대 4mg/ml까지 재현탁 |
| Bicinchoninic acid 기반 단백질 분석 키트 : BCA 키트 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 프로테아제 억제제 | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| 루미놀 기반 향상된 화학발광(ECL) HRP 기질 | Life Technologies | 34075 | |
| BSA | 시그마-알드리치 | A9647 | |
| 전단 연어 정자 DNA (연어 고환에서 추출한 디옥시리보 핵산 나트륨 염) | 시그마-알드리치 | D1626 | |
| 스페르민 테트라하이드로클로라이드 | 시그마-알드리치 | S1141 | |
| 스페르미딘 | 시그마-알드리치 | S0266 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS 러닝 버퍼 | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (고포도당) | Sigma-Aldrich | D0822 | 사전 예열 at 37 ° 사용 전 |
| C Trypsin-EDTA (0.05% 페놀 레드 | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | 각 로트의 혈청은 먼저 세포에 대해 테스트해야 합니다. |
| 페니실린과 스트렙토마이신 | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| 물(멸균 여과) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| 항체 | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | 웨스턴 블로팅에 사용 |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | 면역침전 및 웨스턴 블로팅에 사용 |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | 세포 신호 기술 | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | 산타 크루즈 | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG 마우스 | 산타 크루즈 | SC-2025 | |
| IgG 토끼 | 산타 크루즈 | SC-2027 | |
| 염소 안티-랫 -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| 염소 안티-토끼 -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| 염소 안티 마우스 -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
참고문헌
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regul....
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재인쇄 및 허가
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