방법 논문

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

DOI:

10.3791/53927

⸱

2016년 9월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Bonn, 2Department of Ophthalmology, National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology, University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease, National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department, Singapore National Eye Centre

이 논문에서

요약

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망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.

초록

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연령 관련 황반변 성 (AMD), 색소 성 망막염 및 기타 RPE 관련 질환은 산업 선진국에서 성인 비전의 돌이킬 수없는 손실에 대한 가장 일반적인 원인이다. RPE 이식은, 장애 RPE를 대체 그 기능을하여 시력을 복원 할 수 있으므로, 유망 치료로 나타납니다.

여기에서 우리는 토끼의 망막 하 공간 (SRS)에 지지체에 배양 된 망막 색소 상피 단층을 이식하는 방법을 설명합니다. 유리체 xenotransplants는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)으로 코팅 된 플런저 20 게이지 금속 노즐 이루어진 주문품 사수하여 SRS로 전달 된 후. 현재의 기술 6 년 동안 150 개 이상의 토끼 수술의 진화. 수술 후 추적 관찰은 관류 고정 조직학 다음 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영 (SD-10월)로 생체 내 이미징에서 비 침습적 및 반복 사용하여 얻을 수있다.

일전자의 방법은 쉽게 학습 및 높은 성공률에 대한 잘 정의 된 단계가 있습니다. 토끼는 임상 번역에 대한 전임상 연구에 유용 큰 눈 동물 모델 간주됩니다. 이러한 맥락에서 토끼는 다른 큰 눈 동물 모델에 비용 효율적이고 아마도 편리한 대안이다.

서론

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는 중심 시력의 상실을 초래로서 연령 관련 황반 변성 (AMD)은 공업 선진국에서 50 세 이상의 성인 시각 장애의 가장 흔한 원인이다. 이들 환자 중 약 15 %는 혈관 신생이 맥락막 및 망막으로부터 유래 한 기능을 방해하는 질병의 "젖은"형태 겪는다. 이 변이체는 항 혈관 형성 약물이 반복 인트라 vitreal 주사로 매우 효과적인 치료에 의해 ​​치료 될 수있다. 그러나 환자 (~ 85 %)의 대부분은 망막 색소 상피 (RPE)하에 세포 외 침착 (예를 들어, 드루 젠)을 특징으로 건조 형태 겪는다. 이 예금은 황반 망막 위축으로 이어지는 망막 색소 상피 장애 원인이됩니다. 어떤 치료 치료 옵션의 부족을 감안할 때, AMD는 다양한 치료 치료 방법이 시험되고있다 집중적으로 개발하는 연구 분야로 진화. 외과 RPE 교체는하나의 매력적인 미래의 가능성이 쇠약 질병 (3)을 물리 칠 수 있습니다.

자가 망막 RPE 이식은 황반의 기능 장애 또는 손실 RPE를 대체, 그 생리 기능 4-9을 복원 할 수있는 가능성이있다. 이 수술 기법은 이식 10 과학자에게 RPE 무제한 셀 소스주는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)에서 RPE 분화 프로토콜의 개발로 돌파구를 가졌다. RPE 이식은 이제 줄기 세포 유래 치료제에 대한 매력적인 최초의 인간 응용 프로그램으로 인식되고있다. 눈은 생체 모니터링 도구 11-13 우수한 수술 접근하고 세련된을 제공합니다.

RPE 세포를 이식 한 방법은 최소 침습 전달 더 RPE 특성 및 이식 기능을 유지하기 위해, 대안 적으로, 인터넷 ARTI 인​​공 캐리어 SUBSTR를 세포 현탁액을 이용하여 인RPE 교체 ATES (발판)는 4,14,15으로 간주되고있다. 대형 동물 모델은 임상 검증, 아직 동물 처리 및 수술 기법이 최신 16-23로 누락에 대한 자세한 기술 정보가 필요합니다.

그 안전한 취급을 제공 단층 무결성 기능을 유지로 우리와 반대로 25 증거에도 불구하고 다른 11,24은 강성 아직 탄성 캐리어 기판의 사용을 제안한다. 시간이 지남에 따라 우리는 망막 하 공간 (SRS)에 전지 캐리어 지원 RPE 이식의 이식에 대한 몇 가지 맞춤 설계 악기 및 보조 기술을 테스트했습니다. 우리는 이식 성공 14,26,27을 평가하기 위해 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영 (SLO / SD 간섭 단층), 및 조직학과 함께 생체 내 주사 레이저 검안경에, 수술 비디오 녹화를 이용했다. 여기에 우리가 토끼 망막 RPE 임플란트에 대한 현재의 권장 사항을 제공,이는 150 절차에 5 가지 토끼 균주, 7 세포 담체 물질과 4 RPE 세포 소스에서 테스트되었다.

프로토콜

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안과 연구에서 동물 처리의 윤리 : 우리는 의료 학부, 본 (Bonn) 대학의 윤리위원회의 승인을 얻어, 비전 연구 및 안과 협회 (ARVO)에 의해 명시된 지침을 준수합니다. 또한, 모든 절차는 노르 트라 인베스트 팔렌의 상태 규제 당국에 의해 승인되었다. 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 표준화 된 개별 케이지에서 20 ° C를 정기적으로 일광에 노출, - 동물 (18) 사이의 온도와 에어컨 방에 ​​전문 시설에서 실내에서 개최되었습니다.

참고 : 동물에게 수술 친 화성을 보장하기 위해, 동물 건강 점수 시트는 다음과 같은 결정적인 동물 배제 기준에 포함 뒤에 : 입원시 체중에 비해 20 %의 체중 감소를; 동물의 겉보기 청색증; 동물 떨고, 경련이 있거나 조정에 이동할 수 없습니다; . 운동 실조증 / 감각 이상, 예를 들어, 마비; 냉담; 극단적 자동 절단 (피부 상처, 절단 된 사지).

1. 악기 살균

  1. 초음파 욕조에서 재사용이 가능한 기기를 놓습니다.
  2. 500 ml의 증류수와 악기 살균제 2 ㎖를 추가합니다.
  3. 15 분 동안 스윕 함수를 사용하여 청소기구.
  4. 초음파 목욕 장비를 제거하고 5 분 동안 증류수를 사용하여 충분히 헹군다.
  5. 오토 클레이브에서 악기를 삽입하고 (20 분 동안 121 ºC에서 악기의 살균) 표준 프로그램을 사용합니다.

2. 악기 준비

  1. 수립 및 외과 수술 용 마스크와 머리 덮개를 착용하고, 밀폐 된 공간에서 작업하여 멸균 필드를 유지한다. 무균 수술 장갑을 착용하기 전에 손을 소독. 자세한 방법 28를 참조하십시오.
  2. 멸균 드레이프에 살균 장비를 놓습니다.
  3. 주입을위한 27 G 바늘, 균형 소금 용액 (BSS) 10 ML의 주사기에 부착 된 40 mg을 트리암시놀론 가득 한 ML의 주사기, 5 ML의 주사기 O를 배치드레이프에 F 윤활제.
  4. 3-0 실크, 7-0 vicryl, 안구 스틱 (공막 / 결막 출혈을 멈추게하기 위해) 드레이프에, 트위스터 거즈 스폰지, 상처 봉합 스트립합니다 (유리체 절제술 팁 튜브를 흥분시키는합니다), 그리고 샹들리에 endoillumination 섬유 와이어를 놓습니다.
  5. 25 G 샹들리에 endoilluminator을 푸는 및 무균 기술을 사용하여 빛을 컴퓨터에 연결 (단계 2.1 참조). 멸균 기술을 이용하여 유리체 절제술 시스템으로 고속 vitrector과 벤 투리 카세트를 포함하여 유리체 절제술 세트를 연결합니다 (단계 2.1 참조).
  6. 500 ml의 BSS 병을 열고 제조업체의 지침에 따라 벤 투리 카세트에 솔루션을 연결합니다.

동물의 마취 및 위치 3. 준비

  1. 정확한 약물 투여 량을 보장하기 위해 동물의 무게를.
  2. 27 G 바늘 시작을위한 0.35 ㎎ / ㎏ 케타민 0.25 ㎎ / ㎏ 메데 토미을 함유 한 주사기를 사용하여 근육 (IM) 마취를 준비합니다. 혼합 할 수있는 주사기를 뒤집습니다.
  3. 1/3 t으로 2 주사기를 준비합니다그 동작 동안 마취를 유지 선량.
  4. 5 % 포도당 용액과 정맥 주입 대안으로 피하 주사 18 G 바늘 20 ㎖를 포함하는 주사기를 준비합니다.
  5. 동형 눈의 3 × 1 방울은 동공 팽창에 대한 유리체 절제술 이전에 삭제주십시오.
  6. 담요 커버 토끼, 마취 주사하기 전에 진정 30 초 동안 주사 부위 주변의 뒷다리 (둔부 근육) 마사지에 주입합니다.
    참고 : IM 마취의 첫 번째 슛은 약 1 지속 - 2 시간을. 토끼의 크기, 약물 내성, 지방 층, 스트레스와 신체 온도에 따라. 45 분 - 사라져 마취의 첫 번째 기호는 다음 주사 지난 30, (외과 의사에 의해 모니터링해야합니다)는 안진이다.
  7. 최면, 반사 저하, 통증과 동물의 근육 이완을 확인하여, 적절한 마취를 확인합니다.
  8. 토끼는 의식이되면, 목 피부 배에 피하 주사를 (PT. 3.3)을 얻었다.
  9. methylc 추가ellulose 윤활유 매 5 - 운영의 눈에서 10 분, 비 작동 눈에 윤활제 및 테이프 뚜껑을 추가합니다.
  10. 이러한 최적의 위치에 목화 담요로 커버가 드리 워진 수술 테이블에 덮여 토끼를 놓고 (약간 담요의 금형을 통해 상승 코, 그래서 안구 표면과 레벨) 수술 현미경. 목적 현미경에 수직 눈을 맞 춥니 다.
  11. 직장 온도계 (정상 체온 39 ± 1 ° C) (29)를 사용하여 적절한 신체 코어 온도를 확인합니다.
  12. 가위 (블레이드에 약간의 연고)를 사용하여 잘라 속눈썹 수술 후 감염을 줄일 수 있습니다.
  13. 국소 1 분 동안 0.1 g / ㎖ 포비돈 - 요오드 3 방울 및 무균 BSS 씻어 - 2를 사용하여 눈을 소독.
  14. 눈의 중간에 미리 잘라 구멍에 멸균 드레이프와 눈을 커버하고 (스티커) 수술 절개 드레이프 12 X 17cm로 커버.

4. 유리체 절제술

  1. 3-0 실크 INV 사용에 Proptose 및 보안 눈erted 캘리퍼스와는 결막 절개를 수행합니다.
    1. 혈관에서 충분히 윤부에 가까운하지만 vannas 가위 (~ 1mm 거리)와 결막을 절개.
    2. 는 "T 컷"을 작성하여 결막을 해부하다. 7mm - 첫 번째 윤부 한 후 약 6의 "T"의 형태로 수직으로 결막을 절개하는 가위 평행으로 절개를 확대. 조심스럽게 퉁명스럽게 결막을 분리합니다.
  2. 조심스럽게 시신경을 향해 방향으로 블레이드의 날카로운 팁을 삽입하여 오른쪽 눈 / OD (왼쪽 눈 / OS 4시 방향) 8시에 23 G의 microvitreoretinal (MVR) 블레이드를 사용하여 공막을 수행합니다. 천천히 같은 방향으로 날을 철회하고 공막을 확대하지 마십시오.
  3. 삽입하고 봉합 사용자 측 포트 주입 캐 뉼러 (27)은 24 mmHg로에서 7-0 실크 봉합사 및 설정 안압 (IOP)를 사용.
  4. OD (10 오 '2시에 25 G 일자 투관침과 공막을 수행4.2 단계와 유사한 OS에 시계).
  5. 접착 테이프를 흥분시키는 및 약 30 %에 광원을 켜 일자 투관침로 25 G 샹들리에 빛을 삽입합니다.
  6. 필요한 경우, 더 나은 인공 시각화에 대한 # 20 메스를 사용하여 부종 각막 상피​​를 제거합니다.
  7. OD에 10시 (OS 2시 방향), (사전) 장소 매듭을 묶는없이 공막 약 7-0 봉합 모양의 U-, 삽입 유리체 절제술 커터 팁에서 4.2 단계로 유사한 공막을 수행합니다.
  8. 시신경 유두 및 최대의 작은 조각으로 유리체 유머를 절단하여 고속 vitrector을 사용하여 fibrae의 medullares을 통해 계속 다음 항목 포트 주위에 유리체 절제술 (30)를 시작합니다. 2,000 - 최대로 흡입 / 분 3,000 컷. 유리체 절제술 기계의 진술 파라미터 설정을 사용하여 200 mmHg로 (표 1)
  9. 후방 극 이상 고속 vitrector을 잡고 망막에서 유리체 유머를 분리하여 후부 유리체 박리 (PVD)을 수행차 (부드럽게 가능한 경우) 디스크 31 만 최대로 흡입하는 동안의 우수한. 절단없이 200 mmHg로.
  10. 유리체 강내 유리체 절제술시 후방 극과 midperiphery 위에 떠있는 유리체의 제거를 시각화하고 (총 근처) 용이하게하기 위해 약 50 μL (20 mg)을 트리암시놀론 또는 희석 형광 (약 0.1 ㎎ / ㎖)을 주입한다. 렌즈에서 건너하지 마십시오. 가스 주입술이 요구되는 경우 (숙련 된) 조수에 의해 주변 유리체를 면도하는 들여 쓰기를 권장합니다.
  11. 의 BSS 주입 용액에 0.001 ㎎ / ㎖의 최종 농도 20 단위 / ㎖ 헤파린 및 0.5 mg을 에피네프린을 추가 병렬 또는 단계 4.10 후.
    참고 : 헤파린 / 에피네프린은 인공 주입되어 있지 않으므로 그 효과는 주입 유량에 따라 지연됩니다.

5.로드 슈터

참고 : 여기에 설명 된 작품은 헬싱키 선언의 원칙에 해당하지 않는다; 그것은 인간의 환자를 포함하지 않았다. 여기에, 역ndard RPE 세포는 태아 인간의 눈, 배양 및 코팅 10 μm의 두께의 폴리 에스터 차별화 (PET) 우리의 이전에 게시 된 프로토콜 (14)에 따라 삽입에서 분리 하였다. 인간의 태아 재료로 작업 할 수있는 권한은 본 대학의 윤리위원회로부터 얻은 것입니다. 또한, 배아 줄기-RPE는 그들이 Vaajasaari 등에 의해 설명 된 기술에 따라 배양 된 Skottman 연구소 (. 사전에 원고), 출하되었다 (32).; 이러한 세포에 대한 권한은 R. 코흐 연구소, 베를린, 독일에서 얻을 수있다.

  1. 이전 안과 학년 BSS와 임플란트 배의 준비에 세포 배양을 씻어.
  2. 10 ml의 안과 학년 BSS와 표준 세포 배양 접시 (100 × 20 ​​mm)를 입력합니다.
  3. BSS에로 세포 배양 삽입을 추가하고 광학 현미경 아래에 접시를 중심으로.
  4. 플랫, 콩 모양의 기판을 얻기 위해 무딘, 타원형, 주문 제작 바늘로 2.4 X 1.1 mm 임플란트를 펀치2 개의 긴 가장자리와 두 개의 둥근 가장자리.
  5. 조심스럽게 BSS 작성 사용자 정의 만든 로딩 스테이션 (그림 1)에 임플란트를 플러시 BSS와 두 번째 포트를 통해 바늘을 홍수.
  6. 선택적으로 바로 세 번째 가장자리를 얻기 위해, 임플란트 (<0.5 mm)의 한 라운드 끝을 잘라.
  7. 임플란트는 단층의 세포 캐리어에 상승 것을 보장함으로써 올바른 방향으로되어 있는지 확인합니다. 조심스럽게 두 메스를 사용하여 위치 변경합니다.
  8. 임플란트의 모두 팁의 내부에 고정 될 때까지 바늘 홀더를 사용하여 사수 악기로 부드럽게 완전히 임플란트를 밀어 넣습니다. 플런저는 수축 된 상태로 유지해야합니다.
  9. 이식의 순간까지 BSS에서 로딩 스테이션의 "로드"슈팅 게임 팁을 유지합니다.

6. 주입

  1. 기밀 주사기에 연결된 확장 가능한 41 G 망막 주사 바늘에 신경 망막 접근 (모든 기포가 대피했는지 확인튜브에서!).
  2. subretinally (칼슘과 마그네슘 / CM)와 BSS를 주입하여 약 2의 소포 망막 박리 (BRD) 작성 - 3 디스크 직경 (DD)를. 눈 당 두 BRD 안전하게 높일 수있다.
  3. 수직 23 G VR-가위로 1.5 mm에 retinotomy을 크게한다. 망막 하 공간은 이제 주입 또는 추가 기동에 대한 액세스 할 수 있습니다.
  4. 20 G 접근에 1.4 mm 절개 칼 공막을 (정확하게) 확장합니다.
  5. 로드 된 사수의 부드러운하면서도 아늑한 전환을 보장하기 위해 필요에 따라 확대, 20 G 사수 더미를 사용하여 공막을 통과하려고합니다.
  6. 24 mmHg로에 이상적으로 공막을 통해로드 사수 (27) 전달합니다.
  7. 가장자리 retinotomy 접근과 망막 위치에서 subretinally 임플란트를 꺼냅니다.
  8. 이 합리적으로 멀리 retinotomy에서 retina-에서 잘 배치되어 있는지 확인하기 위해 반 폐쇄 23 G 가위, 집게 또는 41 G 바늘 임플란트를 조정합니다.

7.작업 종료

  1. 25 G 샹들리에 및 주입 정맥을 제거합니다.
  2. 모든 sclerotomies을 봉합.
  3. (이전 봉합 마지막 공막에) 8시 공막 25 μL (10 mg)을 트리암시놀론을 주입한다.
  4. / 체크 촉진하여 안압을 조정하고 필요한 경우, 30 G 바늘 / 주사기를 통해 BSS를 주입.
  5. 7-0 vicryl와 봉합 결막.
  6. 천천히 3-0 실크 슬링을 proptosing 제거 (깊은 안와 정맥 얼기를 피하십시오!).
  7. 뚜껑 아래에 덱사메타손 / 항생제 연고를 추가합니다.
  8. 1 시간 동안 위치가 운영하는 눈 (공기 / 가스) 아래로 (가스 O / W)이 위를 향하도록, 또는 담요로 덮여.
  9. 이 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
  10. 마취가 완전히 퇴색하기 전에 토끼를 이동하지 마십시오,이 주어진 메데 토미의 양과 동일한 에이전트를 반전 메데 토미을 주입하여 가속화 할 수 있습니다.

8. 수술 후 동물 관리

  1. 유지적절한 조건 (온도, 빛, 음식, 물, 공간, 등.)과 전문 시설에서 가까운 감시 아래 토끼.
  2. 그 동물이 아니라, 휴식한다 즉. 확인, 음식이나 물 부족없이 장시간.
  3. 특히 주사 부위에 어떤 상처 나 부상을 찾습니다.
  4. 감염을 방지하기 위해 건조 상처를 보관하십시오. 감염이 의심되는 경우 항생제를 보내기 덱사메타손 1 mg / g 재생, 네오 마이신 황산염 3,500 IU / g, 6,000 IU / g 연고가 안구 표면에 1 주 수술을 위해 매일 두 번 적용되었다 폴리 믹신 B 황산염을.
  5. 더 나은 안구 표면 재생 및 감소 수술 후 통증 매일 두 번 다음 7 일 수술에 대한 덱사메타손 / 항생제 연고를 추가합니다.
  6. 전신 진통제를 제공 (Carprofene 4 밀리그램 / 회 kg) 초기 48 시간 동안.
  7. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
  8. 동물을 반환하지 않는완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 시행하고있다.
  9. 불필요한 고통에 동물을 노출시키지 마십시오.

9. SLO / SD 간섭 단층 안내

  1. 준비 27 G 바늘 시작을위한 0.175 ㎎ / ㎏ 케타민과 0.125 ㎎ / ㎏ 메데 토미을 함유 한 주사기를 사용하여 근육 (IM) 마취를 주입. 혼합 할 수있는 주사기를 뒤집습니다.
  2. 분명 SD 간섭 단층 영상을 눈에 수분을 유지 관리하기 위해 적어도 5 분마다 윤활유를 추가, 선택적으로 사용자 정의 콘택트 렌즈를 사용할 수있다.
  3. 원하는 위치에 동물을 안정화하기 위해 머리 받침에 강철 플랫폼을 연결합니다.
  4. 프로브에 수직의 눈을 배치, 철강 플랫폼에서 토끼를 놓습니다.
  5. 기관을 피하고 낮은 뺨 뼈 (mandibula)에서 토끼의 머리를 잡고.
  6. 대략 45도는 SD 간섭 단층 탐침으로하여 틸트 동물의 머리는 임플란트의 시야각을 최적화 할 수 있습니다.
  7. 30도 렌즈와 옵트에 대해 다음 매개 변수를 사용imal 10월 영상 [HS] : 한 줄 30도 설정은 100 (평균)으로 설정 ART 모드와 15로 설정 ART 모드와 볼륨 스캔 20 × 20 ​​정도의 설정으로 스캔; 고해상도 모드는 필요하지 않습니다.
  8. 임플란트 (. 그림 2A)의 초점면을 찾을 수 SLO 적외선 반사율 영상을 사용; 최적의 초점은 임플란트 가장자리 (14) 날카로운 경우 (모든)에 도달한다.
  9. 완료되면 뚜껑에서 덱사메타손 1 mg / g 재생, 네오 마이신 황산염 3,500 IU / g, 폴리 믹신 B 황산염 6,000 IU / g 연고를 추가합니다.

결과

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망막 코어 절제술을 수행 한 경우 61 % 약의 성공 확률을 가지고 있었고 유리체 박리가 유도 76 %, 최대 상승 하에서 망막 주입 기술 된 방법의 결과를 표 2 생착에 나타낸다. 이 숫자 중 하나를 수술 중 또는 제 3 수술 후 일 년에 사망 동물의 21 %를시켜 대략 포함한다. 이 기술은 동시에 다른 한쪽 눈의 망막 부분에서 두 개의 지지체를 이식하는데 사용될 수있다.

토끼는 스탠 젤 등에 의해 설명 된 바와 같이 생체 내에서 수술이 SD-및 OCT 조직 학적 처리를 사용하여 다음과 시행 하였다. (27) (그림 2). 그림. 2a는 단순한 이식 후 폴리 에스테르 막 (PET)에 이식 배양 RPE의 스캐닝 레이저 검안경 적외선 반사율 이미지를 보여줍니다. 그만큼임플란트 주위에 후광이 위축 광 수용체에 해당합니다. 그림. 임플란트에 인접한 신경 망막이 거의 정상 반사 밴드를 나타내고있다 (b)는, 해당 SD-10월, 통지 망막, 주로 외부 핵 층 (ONL) 숱이, 임플란트 위의 SD 간섭 단층에 하이퍼 반사 밴드를 보여줍니다. 이러한 결과는 무 외상성 전달을하는 것이 좋습니다.도. (c)이 의원 조작의 결과로 가능성이 retinotomy 사이트 주위 망막 흉터 및 ONL 위축을 보여줍니다 임플란트의 Hematoxiline / 에오신 (H / E) 얼룩을 보여줍니다, PET 이상 연속 아직 불규칙한 색소 층. 임플란트 아래 브루흐의 막도 연속으로 등장하고, 맥락막 모세는 일부 흩어져 적혈구가 포함되어 있습니다. 이러한 형태 학적 결과는 SD 간섭 단층 비교할 것이며 외상성 전달의 논문을 강화한다.

figure-results-1
무화과 URE 1 : PET 전지 캐리어에 인간의 IPSC-RPE 배양와로드 슈터. A) 사용자 정의 만든 바늘. B) 세포 배양에서 잘라 콩 모양의 임플란트를 이용하여 임플란트를 펀칭을 보여줍니다. 임플란트 C) 위치 전에로드. D) 임플란트와 사수의로드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

figure-results-2
그림 2 : 배양 된 인간 배아 줄기-RPE PET에 휴대 캐리어 토끼 망막 공간에서 4 주. A) 녹색 라인은도 1에 도시 된 단면을 지지층, SLO 적외선 반사 영상을 보여준다. (b). B) 해당 SD-10월 C) H / E 염색, 자세한 내용은 텍스트 나 (26, 27)을 참조하십시오.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

매개 변수 중고 설정
유리체 절제술 6,000 컷 / 분
진공 200 mmHg로
상승 시간 1 초
공기 24 mmHg로
관개 24 CMH 2 O
DIATHermy 30 %

표 1 : 유리체 절제술 기계의 파라미터 설정.

유리체 절제술 끼워 넣다 토끼는 운영 성공적인 임플란트 실패한 임플란트 죽음 성공률%
코어 유리체 절제술 착한 애 (30) (19) 4 (7) 63.33
PET + RPE (70) (42) (12) (16) (60)
PVD는 / PPV 승 플라스 민을 ± 착한 애 (28) (21) 이 (5) (75)
PET +의 RP이자형 (22) (17) 이 삼 77.27

표 2 : 방법 및 임플란트 종류를 포함하여 마지막 150 운영의 개요.

토론

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토끼 모델을 사용하여, 안전하고 재생 가능한 방법은 맞춤 디자인 사수 악기와 망막 하 공간에 전지 캐리어에서 배양 RPE의 transvitreal 전달을 위해 제공됩니다. 이 망막 기동과 유리체 절제술에서 표준 기술을 수반으로하는 한 방법은, 쉽게 학습에 대한 짧은 / 최적화 된 수술 기법을 제공합니다. 결과는 크게 낮은 IOP에서 여과포 망막 박리 (BRD)를 유도 망막 및 건조를 통해 공막 손상, 그리고 토끼의 적절한 위치를 방지 주입 사이트를 통해 유체의 난류를 방지 깨끗한 유리체 망막 인터페이스 및 안내 주입에 의해 촉진된다.

우리는 예를 들어, 이식의 성공을 방해, 언제든지 발생할 수있는 여러 가지 수술 중 합병증으로, 그러나주의 내 안구 출혈, 마취, 이러한 주입과 같은 중요한 단계에서 떨어져 페이딩에 의한 기기의 조작 또는 눈 저 안압에 BRD의 붕괴, 아르 자형저산소 뇌 손상, 또는 고열을 일으키는 긴 운전 중 마취, 낮은 혈압의 과도한 복용으로 인해 abbit 죽음. 그들이 빨리 달려과 수술 팀의 경험을 증가시켜 해결되면 그러나 이러한 합병증은 시간에 따라 감소한다.

일부 합병증은 간단한 몇 가지, 아직 결정적인 단계에 따라 감소 될 수있다. 작업 중에 각막, 공막 및 결막의 손상을 방지하고 명확한 안내 미디어, 건조로 / 검게 공막이 차례로 눈 저 안압과 리드 상처 열개의 원인이 될 수있다 유지하기 위해 10 분 - 윤활유는 매 5를 추가해야 / 또는 sclerotomies에서 수술 누설. 헤파린은 특히 망막 이식 도전 동시에 에피네프린 헤파린 16하에 피 줄이기 위해 첨가한다 피브린 막의 형성을 방지하기 위해 첨가한다. 너무 오래 헤파린 / 에피네프린 노출 시간 (> 1 시간) 각막 루바을 방지하기 위해 피해야한다내피 부전 (33), 고혈압 성 위기 또는 수술 중 사망으로 엄마. 세심한 유리체 제거는 망막 및 / 또는 맥락막 박리를 방지하기 위해 악기 (항목) 포트에서 수행되어야한다. 인공 악기 렌즈 터치 (의원 성 백내장 형성의 원인) 또는 (항목 사이트) 망막 손상을 방지하기 위해 사후 극으로 지적되어야한다. 따라서이 제어되지 retinotomy 찢어 및 BRD의 붕괴를 방지 주입 주변 제트 기류를 감쇠으로하는 안구 측 포트 주입 뉼러가 사용되어야한다. BRD의 중간 선에서 유도 (시신경에서 수직 축) 또는 광학 medullar 섬유 가까이는 광범위한 의원 성 망막 박리를 방지하기 위해 피해야한다. 마지막으로, 마지막으로 적어도 BRD는 망막 손상으로 이어질 수 과도한 유량을 사용 (예., 스트레칭으로) 망막 BSS 주입을 방지하기 위해, 저 안압으로 유도해야하지.

이러한 세포 캐리와 같은 많은 연구 변수R 변형, 태아, 성인 또는 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포 소스, 면역 억제제에 대한 선택, 등., 14,26,27,34을 탐험 할 수 있습니다. 이러한 무 혈청 RPE 배양 방법, 망막 하 공간에 xenoRPE의 특성, 임플란트 고정에 대한 호스트 RPE 층 (14) 또는 전략의 제거와 같은 추가 개선이 진행중인 현재 작업입니다.

설명 된 기술 칠 놈, 친칠라 놈 / KBL 하이브리드, 뉴질랜드 화이트 / 레드 크로스, 뉴질랜드 화이트 (흰둥이)과 네덜란드 안전띠를 포함한 5 가지 토끼 균주에 사용 된 날짜합니다. 남성과 여성의 토끼를 모두, 수술 한 토끼와 함께 적어도 1.5 kg 또는 세 2 개월 (종에 따라 다름). 3kg - 대부분의 수술은 무게 2.5 사이에 착색 된 토끼 (칠 놈이나 칠 놈 하이브리드)에 있었다.

우리가 작업 할 수있는 기회를 가지고있는 토끼 균주는 모두 몇 가지 특수성을 갖고있는 것 같다. EXCLUS을 감안할 때2009-13 년 독일에서 칠 놈 균주의 색소 토끼의 필자 가용성, 우리는이 동물과 가장 경험을 수집했다. 불행하게도 그것은 번식이 중단 되었기 때문에, 더 이상 사용할 수 없습니다 만, 후자에 더 유리 두꺼운 공막과 큰 눈 볼륨을 제외하고 뉴질랜드 화이트 / 레드 크로스에 아주 잘 비교합니다. 친칠라 자식 하이브리드는 큰 수술 섬유소 형성이 성공적인 망막 기동을 보장하기 위해 위에서 설명한 바와 같이 헤파린 / 에피네프린의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 또한, 비 착색 된 흰둥이 토끼 (뉴질랜드 화이트)에서 수행하지만, 특히 BRD 작성 및 망막 이식이 감소 대비 감사 주어진 더 도전하고있다. 후방 유리체 박리를 유발의 가능성은 우리의 손에 의존하는 토끼의 피로를 보이지 않았다.

Transvitreal 망막 배달은 가장 통신입니다 주어진 가능성이 선택의 미래 외과 전략 노선에 현재 임상 적으로 망막에 액세스 할 수 있습니다. 캐리어 동물 작업 11,15,23,35의 지원에 그 결과 많은 다른 그룹은 배양 된 RPE에 대한 이러한 기술을 발표했다. Aramant 등. (36)가 배치보다는 망막 대상 사이트에 자신의 하이드로 겔 캡슐 소프트 임플란트를 밀어 악기를 가지고 있습니다. Thumann 등의 디자인은. 유체 분사 (19)를 통해 전원을 부동하여 캐리어 지원 이식을 방출하는 중공 주걱을 사용합니다. 두 전 전략은 epiretinally appositioned 악기에 비해 우리의보기에, 합병증에 더 경향이 악기의 망막 삽입이 필요합니다. 몬테 등. (22)는 돼지의 망막 칩 이식의 전달을위한 망막 삽입 악기를 설명하지만 더 이상 작품은 우리가 아는 한에 있기 때문에 공개되지 않았다. 우리는 돼지에 약간의 수정과 함께 설명 된 기술을 확장 할 수 있었다.

jove_content "> 우리의 선호하는 휴대 캐리어가 10 미크론 두께의 폴리 에스테르 테레 프탈레이트 (PET) 멤브레인이다. 수술 관점에서 볼 때,이 물질은 세포 배양 실험 기간 동안 광범위한 다양성뿐만 아니라, 유리한 강성과 탄성 매개 변수가 있습니다. 우리는 확장 테트라 플루오로 에틸렌과 비슷한 경험을 발견 (37) 또는 나노 섬유 막을 PET, 폴리 락트산 / capronolactic 산 (PLCL) 또는 폴리 전기 방사 (의 ePTFE.) - 락트산 - 코 - 글리콜 산 (PLGA)뿐만 아니라, 복합 나노 파이버 (PLGA 또는 PET) 및 초박형 PET 26 때 PET 막은 우리의 금속 사수 기기와 함께 사용, 그들은 초슬림의 폴리이 미드 막이 우리 손에 위에서 설명한 프로토콜과 망막 하 공간에 이식 할 수 없습니다 (27). 사수에서 자신의 배출에 도전하는 정전기를 전시 가끔 경향이있다 할 ( 준비 원고).

대리석 등. 체계적으로 자연 RESO을 공부의원 지역화 된 망막 박리 38-41에서 망막 유체의 rption. 심지어 망막 하 공간에서 조작 다음이이 사건 수술에서 수술 후 4 일째에 의해 재 흡수 될 밝혀졌다. 레이저 retinopexy는 retinotomy의 에지를 고정하기 위해 수행되지 않는다. 인간의 수술에 비해 직관적 때이지만, 공기 / 가스 주입술이 필요하지 않습니다. 주변 유리체의 세심한 제거는 달성 할 수없는 한, 특히 우수한 사분면에,이 사실에 retinotomy 사이트에서 발생하는 거대 망막 눈물의 원인이 될 수 있습니다. 단지 수술 의원 성 망막 박리 또는 특정 임플란트 위치를 확보 할 필요가 경우를 구제하기 위해 이후 20 % SF6 가스 주입술과 유체 공기 교환을 수행하는 것이 좋습니다.

신경 망막의 기계적 유도 절제 토끼 42, 43에서 RPE 및 광 수용체 손상을 일으킬 수 있지만, 그 정도는 크게 (심지어 일반 BSS)와 드 변화등과 연신함으로써 유도 망막 함께 사용 IOP, 주사기 형, 주입량 등의 요인에 보류. 우리는 또한 종종 권장 칼슘 / 마그네슘이없는 BSS가 분리 42-44을 용이하게 테스트하지만 (특히 높은 온도에) 수술 렌즈 혼탁이 발생, 크게 지연 또는 망막 재 부착 (27)을 손상 것으로 나타났습니다. (20)의 느린 망막 주입 - 100 μL 주사기와 일반 BSS의 30 μl의 볼륨 따라서 권장; 주사 바늘의 움직임은 주위 retinotomy 씰하므로 최소화 및 부르크 막 손상을 방지한다. 인성 손상 일부 RPE 상처 치유에 의해 해결하고, 재 부착 후 ONL 두께 관찰 상대적 보존 또한 다른 45 바와 같이 RPE / 감광체 착물이 손상을 견딜 수있는 것을 제안한다.

세포 기반 치료제 또는 망막 보철은 전임상 애니 마이 필요리터 테스트 이전에 규제 당국의 승인과 인간의 안전 연구를 시작. 전자는 국가별로 다를 수 있습니다. 여기에 설명 된 토끼 모델 확립 또는 규제 당국의 모든 요구 사항을 수행하기위한 비용 효율적이고 덜 까다로운 플랫폼으로서 기능 할 수있다. 또한, 이후 최종 다기관 임상 시험 또는 길을 따라 기술의 추가 개선에서 외과 의사의 훈련을 위해 역할을 할 수있다.

공개 사항

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RB, BVS, ZL, NE 및 Geuder AG는 범인에 유럽 특허 출원을 제기했다. NB는 Geuder AG의 직원이다. 이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 Geuder AG 지불했다.

감사의 글

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2008 년 & 2010 년 (BVS), BONFOR / Gerok 장학금 O-137.0015 (BVS), BONFOR / Gerok 장학금 O-137.0019 (FT), 독일 연구 협회 / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, 중국어 뤼디거 재단 보조금에서 지원 장학위원회 제 2008627116 (ZL)와 Geuder AG, 하이델베르크 (그림. 2)에 의해 제한 부여. H. Skottman의 실험실의 구성원은, 탐 페레 핀란드의 대학은 감사도 2에 도시 된 RPE를 유도 배아 줄기을 제공하기 위해 인정된다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
s30 초음파 세척 장치Elmasonic100 46312.75 L
DE-23  오토클레이브SystecC 220923 L
주사기 BD 300013
300995 
301285
300294
300330 		1 ml x3
2 ml x3
5 ml x1
10 ml x1
20 ml x1
바늘 BD305196
305136		18 G x1 
27 G x5
메스깃털2975#20블레이드#20 x3
수술용 드레이프HARTMANN
LOHMANN & RAUSCHER		277 502
25 440		60 x 40 cm x2
12 x 17 cm
접안구 스틱LOHMANN & RAUSCHER16 51666 x 5 mm
트위스터 거즈 스폰지HARTMANN481 274x2
클로저 스트립HARTMANN540 686x4
Opmi Visu CS 현미경ZeissN/a포함 안저 이미징 시스템 BIOM II
샹들리에 내시광GeuderG-S03503 +
G-S03504		25 G 포함 투관침
라이트 머신GeuderG-26033Xenotron III
Vitrectomy 기계GeuderG-60000MegaTRON S4 S4/ HPS
VitrectorGeuderG-46301MACH2 vitreous cutter 23 G
Venturi cassette GeuderG-60700
Sideport-infusion 캐뉼라Geuder맞춤형 23 G x1
3-0 실크 봉합ETHICONV546Gx1
캘리퍼스GeuderG-19135x2
Vannas 가위GeuderG-19777x1
경화 절제술 블레이드Ziemer21-23011x 23 G
1x 20 G
7-0 실크 봉합ETHICONEH6162Hx1
바늘 홀더GeuderG-32320x2
아이리스 집게GeuderG-18910x1
Colibri 집게GeuderG-18950x1
확장 가능한 망막하 주사 바늘DORC1270.EXT41 G
VR 가위GeuderG-3654225 G
Grieshaber 집게 홀더Alcon712.00.4123 G
곡선 가위 집게팁 Alcon723.5223 G
임플란트 로딩 스테이션Dow Corning3097358-1004SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트
블런트 오발형 임플란트 트레핀 Geuder맞춤 제작 2.4 x 1.1 mm 
슈터 더미GeuderG-32227x1
슈터GeuderG-S03443x1
플루트 바늘DORC1281.SD 20 G (진공)
수동 마이크로리터 주사기Hamilton24535100 µ l
조직 배양 플레이트Greiner bio-one  664160100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality
이미징 시스템		Heidelberg
Engineering		N/aSpectralis HRA
 + OCT
Drugs and solutions
NameCompany>Active agent 코멘트
Mucadont-ISMerz Hygienevirucidal instrument disinfectant 2
점액질  TMerz 위생알데히드 프리 기구 소독제2 L
케타민 10%WDT케타민 10ml(100mg/ml)
DomitorOrion Pharma메데토미딘 염산염10 ml (1 mg/ml)
AntisedanOrion Pharma아티파메졸 염산염10 ml (5 mg/ml)
네오시네프린 POS 10%URSAPHARM페닐에프린 HCl10 ml
MydriacylAlconTropicamid10 ml (5 mg/ml)
Methocel 2%Omni Vision하이드록시프로필 메틸셀룰로오스
푸리 클리어자이스밸런스 소금 용액(BSS) 10g 500 밀리리터
포도당 5%   B.BraunGlucose 5%  용액100 ml
Heparin-Natrium-25,000RatiopharmHeparin5 ml (2,500 unit/ml)
SuprareninSANOFIEpinephrine1 ml (1 mg/ml)
TriamcinoloneUniversity of Bonn pharmacy preservative-freeTriamcinolone 1ml(40mg/ml) 
Isoptomax 눈 연고Alcondexamethasone 1 mg/g
neomycin sulfate 3,500 IU/g
polymyxin B sulfate 6,000 IU/g		10 ml
BetaisodonaMundipharmaPovidon-Iod30 ml (1 g/10 ml)
OptiveALLERGAN나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 글리세롤10 ml
사 사 리터

참고문헌

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