여기에서는 실험용 쥐의 뒷다리, 긴 뼈(대퇴골 및 경골)를 해부하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 골수 공간에서 골수를 제거하기 위해 원심분리를 사용하는 이러한 뼈에서 골수를 신속하게 분리하는 기술에 대해 설명합니다.
이 논문에서
요약
초록
뼈와 골수에 대한 연구는 기초 뼈 생물학, 면역학, 혈액학, 암 전이, 생체 역학 및 줄기 세포 생물학을 포함한 많은 연구 분야에서 매우 중요합니다. 그러나 건강하고 병리적인 상태에서 뼈의 중요성에도 불구하고 뼈 해부 및 골수 분리에 대한 전문 지식이 부족하기 때문에 대체로 연구가 부족한 기관입니다. 마우스는 뼈와 골수에 미치는 영향을 연구하는 일반적인 모델 유기체이므로 대규모 실험 코호트 처리를 위한 긴 뼈 절개 및 골수 분리를 위한 표준화되고 효율적인 방법이 필요합니다. 우리는 대퇴골과 경골을 제거하기 위한 간단한 해부 절차를 설명하며, 이는 조직 형태학적 분석 및 강도 테스트를 포함하되 이에 국한되지 않는 다운스트림 응용 분야에 적합합니다. 또한 취급 시간이 제한된 원심분리를 통해 긴 뼈에서 골수를 신속하게 분리하는 절차를 간략하게 설명하며, 이는 세포 분류, 일차 세포 배양 또는 DNA, RNA 및 단백질 추출에 이상적입니다. 이 프로토콜은 실험 오류를 제한하기 위해 시료를 신속하게 처리할 수 있도록 간소화되었으며, 사용자 간 변동성을 최소화하도록 표준화되었습니다.
서론
긴 뼈와 골수의 세포에 대한 연구는 뼈 생물학, 암 생물학, 면역학, 혈액학 및 생체 역학을 포함하되 이에 국한되지 않는 수많은 연구 분야의 중심입니다. 뼈는 연골과 함께 골격을 형성하여 내부 장기의 하중을 기계적으로 지지하고 보호하는 매우 역동적인 기관입니다. 또한 뼈의 미네랄 성분은 중요한 신호 분자인 칼슘과 인뿐만 아니라 다른 요인을 저장하는 흡수원입니다1. 마지막으로, 뼈는 골수를 수용하며, 대사 활동이 활발한 뼈 형성 조골세포 및 뼈 흡수 파골세포와 함께 조혈 세포 및 림프 세포 집단을 유지하는 데 필요한 줄기세포 틈새를 제공합니다.
뼈와 골수는 많은 질환에 영향을 미치며, 종종 골수 기능 장애, 심한 뼈 통증 및 병리학적 골절로 이어집니다. 뼈는 많은 고형 종양, 특히 유방암과 전립선암에서 흔히 발생하는 전이 부위로, 종양 세포가 골수 틈새와 직접 접촉하여 뼈 전이의 악순환을 시작하고 조혈 줄기세포를 대체하는 곳입니다2,3. 골수종과 백혈병을 포함한 조혈 악성 종양은 골수 기능 장애와 건강한 뼈 리모델링의 조절 저하를 특징으로 한다1. 다른 비악성 골격계 질환도 골관절염, 골다공증, 척추측만증 및 구루병과 같은 활발한 연구 분야입니다. 건강한 사람이라도 뼈의 생체역학적 결함은 고통스러운 골절로 이어집니다. 이러한 모든 질환은 이환율과 사망률을 줄이기 위한 새로운 예방 조치와 치료 요법을 식별하는 것을 목표로 하는 활발한 연구 분야를 나타냅니다.
생리학적, 병리학적 조건 하에서 뼈와 골수의 과다한 역할을 연구하기 위해서는 연구자들이 대규모 생체 내 실험의 신속한 처리를 위해 쥐의 긴 뼈를 해부하는 간단하고 효율적인 표준화된 방법을 갖는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 해부 프로토콜은 체외 이미징, 조직학, 조직 형태 측정 및 강도 테스트를 포함한 모든 긴 뼈 분석에 적합합니다. 마찬가지로, 골수 세포 회수율이 높고 사용자 간 변동성이 낮은 표준화된 골수 분리 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 정량 PCR(qPCR)과 같은 실험 분석뿐만 아니라 골수 세포의 일차 세포 배양과 같은 다운스트림 응용 분야에 중요합니다.
프로토콜
모든 동물 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 요약된 권장 사항에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 뒷다리 긴 뼈 해부
- 기관 지침에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
- 마우스를 누운 자세로 놓고 발목 관절 아래의 마우스 발 패드를 통해 네 다리를 모두 고정하여 부착합니다.
- 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 다리를 완전히 적십니다.
- 엉덩이 바로 위의 하복부 정중선 오른쪽으로 작게 절개합니다.
- 절개 부위를 다리 아래로 뻗어 발목 관절을 지나갑니다.
- 피부를 뒤로 당기고 대퇴골 근위 끝에 고정된 대퇴사두근을 절단하여 대퇴골의 앞쪽을 노출시키고 다리에서 핀을 빼내어 핀을 보드에서 45도 각도로 배치합니다.
- 가위의 칼날을 대퇴골 뒤쪽에 대고 햄스트링을 무릎 관절에서 잘라냅니다.
- 대퇴골의 근위부 끝에 고정된 피부와 햄스트링 근육을 뒤로 당겨 대퇴골의 뒤쪽을 노출시키고 다리에서 핀을 빼내고 핀을 보드에서 45도 각도로 배치합니다.
- 겸자로 무릎 관절 바로 위에 있는 대퇴골의 말단부를 잡습니다. 대퇴골 샤프트 양쪽에 있는 가위의 날을 고관절 쪽으로 안내하고 대퇴골 자체가 절단되지 않도록 주의하십시오.
- 가위가 약간 열리는 것으로 표시된 대퇴골두에 도달한 후 가위의 상단 날이 대퇴골두 바로 위로 이동하여 대퇴골두 아래의 뼈가 부러지지 않도록 주의하면서 가위를 비틀어 대퇴골을 탈구시킵니다.
- 집게로 대퇴골 샤프트의 상단을 잡고 대퇴골두에서 연조직을 잘라내어 비구에서 분리합니다.
- 대퇴골, 무릎, 경골을 포함한 다리 뼈 전체를 몸에서 위로 당겨 다리와 피부를 연결하는 결합 조직과 근육을 조심스럽게 잘라냅니다.
- 발목 관절을 과도하게 펴고 다시 가위를 비틀어 경골을 탈구합니다.
- 경골의 말단 끝을 잡고 힘줄이 끊어지지 않도록 주의하면서 경골을 위로 당겨 몸체와 핀 보드에서 분리합니다.
- 긴 뼈를 무릎 부분의 마우스에 부착하는 남아 있는 결합 조직을 잘라냅니다.
- 대퇴골과 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다.
- 뼈가 손상되지 않은 상태로 유지되어야 하는 모든 응용 프로그램(조직학, 조직 형태 측정, 생체 역학 테스트 등)의 경우 표준 사내 프로토콜(4-7 참조)을 진행하십시오. 골수를 분리하려면 섹션 2로 진행하십시오.
2. 골수 분리를 위한 긴 뼈 준비
- 겸자를 사용하여 슬개골이 반대쪽을 향하고 근위부 끝(대퇴골두)이 아래로 향하도록 대퇴골을 잡습니다.
- 무릎 관절을 과도하게 펴고 가위를 비틀어 경골과 대퇴골을 탈구시킵니다.
- 대퇴골과 경골을 함께 고정하는 결합 조직을 절단합니다.
- 겸자를 사용하여 앞쪽이 반대쪽을 향하고 근위부 끝(대퇴골 머리 끝)이 아래로 향하도록 대퇴골을 잡습니다.
- 가위를 대퇴골 샤프트 위로 올려 과두로 안내합니다.
- 가위를 앞뒤로 부드럽게 돌려 과두, 슬개골 및 골단을 제거하여 형이상물을 노출시킵니다.
- 집게, 가위 및 Kimwipes를 사용하여 대퇴골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다.
- 겸자를 사용하여 앞쪽이 반대쪽을 향하고 원위 끝(발목 끝)이 아래로 향하도록 경골을 잡습니다.
- 경골 골단이 손상되지 않은 경우 가위를 경골 샤프트 위로 과두로 안내합니다.
- 가위를 앞뒤로 부드럽게 돌려 과두와 골단을 제거하여 형이상물을 노출시킵니다.
- 집게, 가위, Kimwipes를 사용하여 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다.
3. 골수 격리
- 18g 바늘을 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 바닥으로 밀어 넣습니다.
- 긴 뼈(최대 대퇴골 2개와 경골 2개)를 튜브에 넣고 무릎 끝이 아래로 내려가 뚜껑을 닫습니다.
- 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 중첩합니다.
- 마이크로 원심분리기에서 ≥10,000 x g의 중첩된 튜브를 15초 동안 원심분리합니다.
- 육안 검사를 통해 골수가 뼈에서 분리되었는지 확인합니다. 뼈는 하얗게 보여야 하며 더 큰 튜브에 큰 시각적 펠릿이 있어야 합니다.
- 뼈가 있는 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 버립니다.
- 적절한 용액(예: PBS, 배양 배지, FACS 완충액)에 골수를 현탁하고 실험 프로토콜(DNA, RNA 또는 단백질 분리, FACS 분석 또는 1차 세포 배양)을 진행합니다.
결과
여기에 설명된 프로토콜은 골 조직의 손상을 최소화하면서 마우스의 대퇴골과 경골을 신속하게 해부할 수 있도록 최적화되었습니다. 이 기술은 생체 역학 연구, 조직 형태 측정(그림 1A - B) 및 조직학(그림 1C)을 포함한 다양한 하위 분석에 적합합니다4,7. 대표적인 조직 형태 측정 microCT 3D 재구성 이미지(그림 1A - B)를 통해 해면골과 피질골 껍질이 모두 유지됨을 확인할 수 있으며, 이를 통해 소주 개수, 두께, 간격, 골 부피, 피질 두께 등 골 조직 형태 측정의 표준화된 구조적 매개변수를 정확하게 정량화할 수 있습니다8. 대표적인 조직 절편은 H&E 염색을 거친 포르말린 고정 및 탈칼슘 처리된 경골을 보여줍니다(그림 1C). 이 이미지는 조직학적 분석을 위한 석회화된 뼈와 세포성 골수의 무결성을 보여줍니다.
골수 분리 절차는 골수 공간의 무균 상태를 유지하며, 오염을 줄이기 위해 조작 과정을 최소화하였고, 긴 뼈를 절단할 필요가 없어 골수 수율의 손실을 줄여줍니다. 이렇게 분리된 골수는 유세포 분석5 및 PCR 분석을 포함한 다양한 후속 응용 단계에 적합합니다. 또한, 이 절차는 파골세포 및 조골세포를 포함한 골수 세포의 일차 세포 배양을 위한 골수 분리에 사용할 수 있습니다 (그림 2A - B)4,6.
그림 1. 마우스 긴 뼈의 조직 형태학적 및 조직학적 분석. (마우스 경골의 3차원 microCT 재구성 영상으로, 다음을 보여줌:A) 외측 피질 껍질과 (B) 소주골(척도 막 = 0.5 mm). (C) 조직학적 H&탈칼슘화 및 절편화된 경골의 E 염색 (4배). 이미지는 미국 워싱턴 대학교 의과대학의 Katherine Weilbaecher 제공. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 파골세포 및 조골세포 분화를 위한 일차 골수 세포 배양. (A) 파골세포 분화 배지에서 7일간 배양 후 다핵 파골세포에 대한 TRAP 염색 (4배 확대). (B) 골모세포를 위한 알칼라인 포스파타아제(보라색) 및 골분화 유도 배지에서 21일 배양 후의 광물화를 확인하기 위한 알리자린 레드(빨간색) 염색. 이미지 제공: 미국 워싱턴 대학교 의과대학 Katherine Weilbaecher. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
토론
우리는 마우스 뒷뼈 제거 및 후속 골수 분리를 위한 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 뼈와 골수의 높은 구조적 및 세포적 완전성을 유지하고 처리 시간이 짧아 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 사용자 유발 골절 또는 뼈 채점 가능성을 최소화합니다. 또한, 골수를 분리하는 원심분리법은 골수 공간을 노출시키기 위해 뼈를 절단하거나 골수를 세척하기 위해 체액을 절단할 필요가 없어 잠재적인 오염 지점을 줄일 수 있습니다. 또한 원심분리기 기술은 다른 방법보다 실습 시간이 짧고 처리량이 상대적으로 높아 처리 시간이 단축됩니다.
높은 변이는 높은 마우스 간 표현형 변이로 인해 생체 내 마우스 연구에 내재되어 있습니다. 비용이 많이 들고 노동 집약적인 마우스 연구의 연구 효과를 극대화하기 위해서는 기술적 실험 오류를 최소화하는 것이 중요합니다9,10. 동물 희생에서 다운스트림 분석 또는 조직 고정까지의 시간은 미묘한 변화를 극복하고 그룹 간의 큰 차이를 줄일 수 있는 실험적 변화를 도입합니다. 따라서 정확한 데이터 분석을 위해서는 샘플의 신속한 처리가 필수적입니다. 여기에 설명된 장골 해부 및 골수 분리 기술은 기술적 변동을 줄이기 위해 동물 및 샘플의 신속한 처리에 최적화되어 있습니다.
이 프로토콜은 뼈 조직 자체의 조사 또는 골수 세포의 조사를 포함하여 많은 연구 분야에 널리 적용될 수 있습니다. 또한, 긴 뼈 해부에 대한 이러한 간단한 접근 방식을 통해 관련 분야의 연구자들은 제대로 연구되지 않은 병리에서 골수 기능 장애에 대한 지식을 확장하기 위해 뼈 기여도를 직접 조사할 수 있습니다.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NCI 보조금 번호 U54CA143803, CA163124, CA093900 및 K.J.P.에 대한 CA143055의 지원을 받았습니다. 저자는 Weilbaecher 연구실의 전현직 구성원, 특히 Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla, Hongju Deng과 Brady Urological Institute의 구성원, 특히 원고를 비판적으로 읽어준 Pienta 실험실의 구성원에게 감사를 표합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 핀보드 | |||
| 핀 | |||
| 70% 에탄올 | |||
| 해부 가위 | |||
| 해부 겸 | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 16G 바늘 | |||
| 1.5 ml 마이크로 원심 튜브 | |||
| 0.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브 | |||
| 마이크로 원심 분리기 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
