대기압에서 작동하는 질량 분석 이미징(MSI) 소스는 중적외선 레이저 탈착과 전기 분무 후 이온화를 결합하여 개발되었습니다. 외인성 얼음 매트릭스는 조직 관련 물질의 공명 탈착을 촉진하기 위해 에너지 흡수 매트릭스로 사용되었습니다. 이 원고는 전신 신생아 마우스의 IR-MALDSI MSI를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
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방법 논문
적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)
이 논문에서
요약
초록
질량 분석 (MS)에 대한 주변 이온화 소스는 지난 10 년간 많은 관심의 대상이되어왔다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 전기 분무 이온화 (MALDESI)는 이러한 방법의 일례이다 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) (예를 들어, 탈착 펄스 특성)과 전기 분무 이온화 (ESI) (예를 들어, 소프트 - 이온화 기능 ) 결합된다. MALDESI의 주요 이점 중 하나는 고유의 다양성이다. MALDESI 실험에서 자외선 (UV) 또는 적외선 (IR) 레이저로 공진 내인성 또는 외인성 매트릭스를 여기 시키는데 사용될 수있다. 행렬의 선택은 피 분석 물에 의존하지 않고, 여기에 사용되는 레이저 파장에 전적으로 의존한다. IR-MALDESI 실험에서 얼음의 얇은 층은 에너지 흡수 매트릭스 시료 표면에 증착된다. 적외선 - MALDESI 소스 형상은 통계 액체 샘플의 분석을위한 실험 (DOE)의 디자인뿐만 아니라 BIOL를 사용하여 최적화 된ogical 조직 표본. 또한, 강력한 IR-MALDESI 촬상 소스는 가변 중간 IR 레이저는 컴퓨터 제어 XY 병진 스테이지 및 고분해능 질량 분석 장치와 동기화되는 경우, 개발되었다. 커스텀 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 레이저의 반복률의 사용자 선택을 허용 복셀마다 촬영, 시료 스테이지의 스텝 크기 및 탈착 사이의 지연 소스를위한 이벤트를 검색 번호. IR-MALDESI는 생체 조직 절편의 섬유와 염료 및 MSI의 법의학 분석과 같은 응용 프로그램의 다양한 사용되어왔다. 내인성 대사에서 조직 절편 내에 외래 생체 이물질에 이르는 상이한 분석 물의 분포를 측정하고,이 기술을 이용하여 정량화 할 수있다. 이 논문에 제시된 프로토콜은 전신 조직 섹션의 IR-MALDESI MSI에 필요한 주요 단계를 설명합니다.
서론
마이크로 프로브 모드에서 질량 분석 이미징 (MSI)는 샘플의 표면에 분리 위치에서, 빔 (레이저 또는 이온)에 의해 표면으로부터 시료의 탈착을 포함한다. 각 래스터 지점에서, 질량 스펙트럼을 생성하고, 획득 된 스펙트럼들은 수집되었던 공간 위치와 함께 동시에 수많은 샘플 내 분석을 매핑하는데 사용될 수있다. 감도와 질량 분석의 특이성에 결합 이미징이 레이블없는 방식 MSI는 질량 분석 1, 2에서 가장 빠르게 발전하는 분야 중 하나가 도왔다.
매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)는 MSI 분석에 사용되는 가장 일반적인 이온화 방법이다. 그러나, 유기 매트릭스에 대한 필요성 및 MALDI의 진공 요구 재현성 샘플 처리량 및 방법을 이용하여 분석 될 수있는 샘플의 유형에 상당한 제한을 야기. 대기압 (AP) IO의 수그러한 조직 방법은 이러한 제한을 피하기 위해 3 최근 개발되어왔다. 이러한 주변 이온화 방법은 자연 상태에 매우 가까운 분석에 앞서 샘플 제조 단계를 단순화하는 환경에서 생체 시료의 분석을 허용한다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화가 일렉트로 (MALDESI)은 이러한 이온화 방법 -4,5-의 일례이다.
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프로토콜
참고 : 다음 프로토콜은 IR-MALDESI MSI 실험을 수행하기위한 필요한 모든 단계를 설명합니다. 에서 심층 최적화 된 IR-MALDESI 소스의 형상과 레이저, 무대와의 동기화 및 질량 분석기에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 5,6 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 동물 조직 샘플은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 노스 캐롤라이나 주립 대학의 규정에 따라 얻었다.
1. 조직 준비
- 흄 후드에서 드라이 아이스의 보조 용기 내부에 깨끗한 비커에 ~ 이소 펜탄 200 ㎖를 배치하여 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕을 준비합니다. 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕조와 조직을 취급 할 때는 항상 보호 장갑과 보안경을 사용하십시오.
- AVERTIN 과다에 의한 2 일된 전체 신생아 마우스 새끼 (7.5 밀리그램 / g 체중)를 안락사하고 조직 구조를 보존하기 위해 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕에서 조직을 동결. 미리 청소를 사용집게의 에드 쌍을 배치하고 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕에서 cryomold에 마우스 강아지를 제거합니다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 플래시 냉동 조직을 저장합니다.
- 보호 장갑을 사용하여, 40mm의 ....
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결과
도 4에 제시되는 이미지는 전신 조직 절편의 여러 장기에서 대사 산물의 공간적 분포를 나타낸다. 신체의 특정 영역에 고유의 m / z 값은 이미지 생성을 위해 일괄 처리 한 후, MSiReader PeakFinder를 이용하여 발견되었다. 화상 오버레이 도구 (도 3-4) 얻어진 이온 맵 얼음 행렬 증착 전에 촬영 한 광학 이미지를 정렬하는 데 사용 하였다. 동물 세포막 (도 4a)에 구조적 역할에서 예상대로 다른 대사 물질은 특정 장기 나 조직 구획 (도 4B-D) 내의 별개의 분포를 나타내는 반면, 콜레스테롤은 모든 조직 유형에 걸쳐 관찰된다.
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토론
프로토콜은 위의 IR-MALDESI MSI 실험을 수행하기위한 주요 단계를 설명한다. 매트릭스 신청 절차 (제 3 장)은 로봇 분무기를 사용하여 코팅 스프레이 승화 또는하여 MALDI MSI 실험의 일반적인 매트릭스 응용 프로그램 프로세스와 유사 약 20 분 걸립니다. 또한, IR-MALDESI 매트릭스의 결정 (6)에 분석 물의 분할에 의존하지 않고, 얼음 행렬 보편적 관계없이 질량, 크기, 화학적 성질의 분석 모두에 사용될 수있다. 또한, 얼음의 사용은 전형적인 MALDI 실험 23에서 관찰 된 낮은 m / z 범위에서 매트릭스 관련 이온을 제거한다.
실험에서의 모든 단계는 품질 MSI 데이터를 생성 할 필요가 있지만, 실험 과정 동안 전기 분사 안정성 재현성 IR-MALDESI 이온 생성에 필수적이다. 상대 습도는 촬상 실험 과정에 걸쳐 모니터 될 필요일정한 얼음 매트릭스 층을 유지한다. Ir이 MALDESI 탈착 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 쥐 조직 전체를 제공해 준 NCSU 분자 생물 의학과의 H. Troy Ghashghaei 교수에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01GM087964), W.M. 켁(W.M. Keck) 재단, 노스캐롤라이나 주립대학교(North Carolina State University)로부터 받은 재정 지원에 감사를 표한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IR-MALDESI 소스 | 맞춤형 | N/A | IR-MALDESI 소스 개발에 대한 자세한 설명은 참고 자료 4 및 12를 참조하십시오. |
| Q 엑액티브 플러스 | Thermo Scientific | Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량 | |
| 물, HPLC 등급 | Burdick & 잭슨 | AH365-4 | |
| 메탄올, HPLC 등급 | Burdick & 잭슨 | AH230-4 | |
| 포름산 | 시그마 Aldrich | 56302 | |
| 조정 가능한 mid-IR 레이저 | Opotek Inc. | IR 오폴렛 | 조정 가능 2,700-3,100 nm IR OPO 레이저 |
| 질소 가스 | Arc3 가스 | AG S-NI300-5.0 | 등급 5.0 고순도 질소 가스 실린더 (300) |
| 저온 | Leica Biosystems | CM 1950 | 극저온 현미경 절개 |
| 블레이드 | Leica Biosystems | 3802123 | Leica DB80HS |
| 장착 매체 (OCT) | Leica Biosystems | 3801480 | Surgipath FSC 22 장착 매체 |
| 저온 유지 장치 표본 디스크 | Leica Biosystems | 14047740045 | 직경 40mm |
| 유리 현미경 슬라이드 | VWR | 48312-003 | 젖빛, 선택, 사전 세척 |
참고문헌
- Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A. Imaging Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 26, 606-643 (2007).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. A. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem. Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C.
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재인쇄 및 허가
