이 기사는 GC-MS에 의한 검출을 위해 글리칸을 구성 연결 특이적 단당류로 화학적으로 분해하여 분획되지 않은 생체 유체에서 글리칸의 통합 조성 프로파일을 분석하도록 설계된 새로운 상향식 글리코믹스 기술의 향상된 형태를 제시합니다. 잠재적인 응용 분야에는 암 및 기타 글리칸 정동 장애의 조기 발견이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase)라고 하는 효소에 의해 템플릿 기반이 아닌 과정에서 합성되는 글라이칸은 다양한 중요한 세포 내 및 세포 외 이벤트에서 중요한 역할을 합니다. 많은 병리학적 상태, 특히 암은 유전자 발현에 영향을 미치며, 이는 다시 배당체 가수분해효소 및 글리코실전이효소의 상대적 풍부도와 활성 수준을 조절할 수 있습니다. 비조절된 글리코실전이효소(glycosyltransferase)로 인한 고유한 비정상적인 전체 글라이칸은 종종 복잡한 생체 유체 내에 미량으로 존재하여 검출이 어렵고 때로는 확률적일 수 있습니다. 그러나 적절한 시료 전처리를 통해 가장 오래된 형태의 질량 분석법(가스 크로마토그래피-질량 분석법, GC-MS)은 복잡한 생체 유체에 존재하는 분지점 및 연결 특이적 단당류("글라이칸 노드")의 수집을 일상적으로 검출할 수 있습니다. 기존의 하향식 글리코믹스 기법을 보완하는 본 연구에서 논의된 접근법은 샘플의 각 구성 글라이칸 노드를 하나의 독립적인 분석 신호로 수집 및 응축하는 것을 포함하며, 이는 글리온 전체의 변화에 대한 자세한 구조적 및 정량적 정보를 제공하고 잠재적으로 조절되지 않은 글리코실전이효소를 밝힙니다. 본원에 제공된 과메틸화 및 후속 액체/액체 추출 단계에 대한 개선은 알칼리성 수성 조건에 대한 과메틸화 글라이칸의 노출을 최소화함으로써 재현성 및 전체 수율을 향상시킵니다. 아세틸화 단계에 대한 수정은 반응 범위와 전체 수율을 더욱 증가시킵니다. 재현성에도 불구하고 N-아세틸헥소사민(HexNAc) 부분 과메틸화 알디톨 아세테이트(PMAA)의 전체 수율은 헥소스 PMAA에 비해 예상 이론적 값보다 본질적으로 낮은 것으로 나타났습니다. 모든 헥소스(또는 HexNAcs)에 대한 XIC 영역의 합에 대한 각 개별 hexose PMAA(또는 HexNAc PMAA)에 대한 추출된 이온 크로마토그램(XIC) 아래 면적의 비율을 계산하면 샘플에서 개별 글라이칸 노드의 상대 정량화를 용이하게 하는 새로운 정규화 방법이 제공됩니다. 현재 검출의 절대적인 한계 측면에서 제약이 있지만, 이 방법은 임상 생체 유체의 분석을 촉진하고 기존의 하향식 당체학에 대한 보완적인 접근 방식으로서 상당한 가능성을 보여줍니다.
서론
당지질, 당 단백질, 프로테오글리칸과 글리코 사 미노 글리 칸 일괄 글리 칸으로 알려진 복잡한 이기종 탄수화물의 네 가지 주요 클래스를 구성한다. 마찬가지로 세포막, 글리코 칼 릭스, 세포 외 매트릭스와 유체 유비쿼터스 적분 성분, 글리 칸은 세포 내 이입 세포 내 피킹, 세포 운동성, 신호 전달 분자 인식, 수용체 활성화, 세포 부착, 호스트 병원체 상호 작용 등의 다양한 생화학 적 과정에 참여 삶의 거의 모든 영역에서 세포 간 통신, immunosurveillance 및 면역 반응 개시. 1 현재는, 글리 칸 폴리머를 구축 글리코 실 트랜스퍼 라 아제로 알려진 효소 글리코 시드 구축 (글리 칸을 무너 뜨리는 또한 글리코시다 아제로 알려진) 가수 분해, 개조와 협력하여 행동 궁극적 글리 칸 폴리머 2 최종 생산하고 있습니다. 각 글 라이코 실 트랜스퍼 라제는 다른 복합 당질에서 작동 할 수 있지만하는 글 라이코 실 트랜스퍼 라제일반적 핵성 수용체의 특정 카테고리 (예를 들어, 지질, 폴리펩티드, 핵산, 또는 성장에 특히 활성 뉴클레오티드 당 공여체 (예, GDP 푸 코스)의 단당 잔기를 전송하여 linkage-과 아노 머 특정 글리코 시드 결합을 위조 올리고당). 단백질 (특히 막과 분비 단백질)의 50 % 이상이-병....
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프로토콜
주의 :이 실험에 사용 된 시약의 피부 / 눈 접촉을 피하십시오. 노출되면, 완전히 물에 영향을받는 지역을 세척하고 즉시 의사의 진단을받을 것.
1. 메틸화 및 글리 칸 추출
- 열 준비
- 샘플을 분석 할만큼의 microfuge 스핀 컬럼 단위를 얻습니다. 휴식 및 플라스틱 저장 튜브의 캡을 분리합니다. 각 저장 튜브에서의 microfuge 미니 필터를 놓습니다. 의 microfuge 튜브 랙 (미니 필터를 포함) 조립의 microfuge 스핀 열을 놓습니다.
- 수산화 나트륨의 재고 (수산화 나트륨) 구슬 (20 ~ 40 메쉬)을 얻었다. 습도가 응집, 수산화 나트륨의 작업 재고로 뜨거운 도자기 박격포를 일으키는 경우, 작은 무게 보트에 약간의 NaOH를 전송하거나. 분말 / 수산화 나트륨 또는 분쇄 NaOH를 구슬 덩어리를 사용하지 마십시오.
주의 : 수산화 나트륨은 강력한 독소 및 부식 기지입니다. 15 분 동안 물로 노출 된 피부 / 눈. Thoroughly 실험을 완료 한 후 워크 벤치를 청소합니다. - 작은 국자 또는 주걱을 사용하여 (~ 가장자리 아래 5mm)를 제 1 외측 경사까지 NaOH를 갖는 미세....
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결과
상대 두 가지 중요한 메틸화 단계가 제대로 실행 된있는 경우에 성공적으로 메틸화, 가수 분해, 감소, 인간 혈장 샘플의 아세틸 화를 보여주는 총 이온 전류 크로마토 그램 (TIC)는 그림 3에 표시됩니다.
탄당에 HexNAcs의 상대의 절대 수율 :
N의 -acetylhexosamine (HexNAc) 부분적으로 메틸화 된 알디 톨 아세테이트 (PMAAs)는 탄당보다 낮은 수율을 가지고하는 경향이있다. (43) 탄당에 HexNAcs 상대의 절대 수익률을 추정하기 위해 N의 -acetyllactosamine (A Gal1-4GlcNAc의 이당류)의 여섯 1.......
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토론
일반적으로, 탄당에서 부분적으로 메틸화 된 알디 톨 아세테이트의 성공적인 생산 (PMAAs)는 적은 어려움을 내포하고 N의 -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs의 성공적인 생산보다 더 강력합니다. 이 절차의 모든 단계에서 재생 될 때,이 현상의 뒤에 정확한 메커니즘은 알려져 있지만 탄당에 HexNAcs 대하여 고유 (오히려 수산기 이상)이 N의 아세틸 기의 고유 화학에 관련한다. 이 산 가수 분해에 관련된 이러한 현상 뒤에 메커니즘은 한마디로 다른 곳에서. 43 설명, N 개의 -methylacetamido 긍정적으로 산 가수 분해 동안 충전되기위한 능력은 산 가수 분해에 내성 글리코 시드 결합을한다. 이 N의 -acetyllactosamine의 분석에 대해 상기 한 바와 같이 육탄 HexNAc에 비해 낮은 수율 (총 HexNAc + 헥 소오스 신호의 11.3 %, 총보다는 50 %)을 설명한다. 특히,이 비교적 리터Hex.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 애리조나 주립 대학의 인문과학대학(College of Liberal Arts and Sciences)에서 CRB에 대한 실험실 창업 자금 형태로 지원되었습니다. 또한 Flinn Foundation(보조금 번호 1977)과 National Institutes of Health의 National Cancer Institute(수상 번호 R33CA191110)의 보조금으로 지원되었습니다. JA는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) PREP(Postbaccalalureate Research Education Program)의 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 지원을 받았습니다(수상 번호 R25GM071798). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 수산화나트륨 구슬 | 367176 | 시그마-알드리치 | 20-40 메쉬, 시약 등급 97% |
| 0.9ml 스핀 컬럼 | 69705 | Pierce 부서의 ThermoFisher Scientific | 플러그와 폴리에틸렌 프릿 포함 |
| GC-MS 자동시료주입기 바이알(실란화)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP 고회수 바이알, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, 테플론 안감이 있는 피어싱 가능한 캡 |
| 포함 1.5 ml 폴리프로필렌 시험관 | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | 스냅 캡 뚜껑 |
| 2ml 폴리프로필렌 시험관 | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | 스냅 캡 뚜껑 |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | D8418 | 시그마 - 알드리치 | 분자생물학용 바이오시약, 시약 등급 >99.0% |
| 요오도메탄 | I8507 | 시그마-알드리치 | 안정제로 구리 함유, ReagentPlus 99% |
| 아세토니트릴 | A955-4 | ThermoFisher Scientific | 옵티마 LC/MS |
| 마이크로 원심분리기 | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 원심분리기 | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 로터(ClickSeal 생물 격리 뚜껑 포함). 로터 카탈로그 번호: 75003424 |
| 13 x 100 유리 시험관 (실란화)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm 붕규산 유리 시험관 나사 캡 마감 |
| 유리 시험관용 캡 | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | 킴블&트레이드; 까만 페놀 나사 모자; 13 mm-415 GPI 나사; PTFE 표면 고무 라이너. |
| 염화나트륨 | S7653 | 시그마-알드리치 | >99.5% 순도 |
| 클로로포름 | 4440-08 | 마크롱 정밀 화학 | |
| 트리플루오로아세트산 | 299537 | 시그마-알드리치 | 단백질 시퀀싱을 위한 재증류로 99% 정제됨 |
| 나트륨 붕소 수화물 | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| 수산화암모늄 용액 | 320145 | 시그마-알드리치 | NH3 함량: 28.0-30.0% |
| 메탄올 | AH230-4 | 허니웰 버딕 & Jackson | HPLC 등급 |
| 아세트산 | 320099 | 시그마-알드리치 | 99.70% |
| 플라스틱 진공 탈착기 | 적절한 크기의 모든 모델 | FoodSaver | |
| 아세트산 무수물 | 539996 | 시그마-알드리치 | 99.50% |
| 디클로로메탄 | D143SK-4 | 써모피셔 사이언티픽 | 안정화된 HPLC 등급 |
| 아세톤 | 9006-03 | J.T.Baker | Baker 분석 |
| 가열 증발 매니폴드(본체) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* 가열 및 교반 모듈; 가열 및 교반 기능이 있는 트리플 블록 모델 |
| 가열 증발 매니폴드(오버헤드 증발기) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap 증발기, 27포트; 트리플 블록 Reacti-Therm 가열 모듈과 함께 사용하기 위해 |
| 증발 매니폴드용 알루미늄 샘플 홀더 블록 | pi18816 | ThermoFisher Scientific | 블록, 알루미늄, Reacti-Block S-1, 13개 보유 mm 직경 시험관, 13개 구멍(14 mm 직경 x 45 mm 깊이) |
| 가스 크로마토그래프 | 모델 A7890 | Agilent | CTC PAL 자동시료주입기 장착 |
| 질량 분석기 | GCT 프리미어(Time-of-Flight) | Waters | |
| 분할 모드 라이너 (비활성화 / 실란화) | 5183-4647 | Agilent | 화된 유리솜 |
| DB-5ms GC 컬럼 | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron 필름 두께 |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| 유리 진공 데시케이터(유리 제품 실란화용) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" 너비; 230mm 플레이트 크기 |
| *유리 제품 실란화는 대형 유리 진공 데시케이터에서 클로로트리메틸실란 증기를 사용하여 밤새 사내에서 수행됩니다. |
참고문헌
- Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
- Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).
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