콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.
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이 논문에서
요약
초록
역사적으로 대부분의 세포 과정은 2차원에서만 연구되었습니다. 이러한 연구는 일반적인 세포 신호 전달 메커니즘에 대해 유익한 정보를 제공했지만, 국소 미세환경 및 세포외 기질(ECM)의 구조적, 기계적 특성에서 얻은 중요한 세포 신호를 무시했습니다. 생리학적 ECM 내에서 세포가 어떻게 상호 작용하는지 이해하려면 3차원 분석의 맥락에서 세포를 연구하는 것이 중요합니다. 세포 이동, 세포 분화 및 세포 증식은 3차원 ECM의 기계적 특성의 국부적 변화에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀진 몇 가지 과정에 불과합니다. ECM의 핵심 섬유소 구성 요소인 콜라겐 I은 조직의 단순한 구조 요소 그 이상입니다. 정상적인 조건에서는 콜라겐 네트워크의 기계적 신호가 형태 형성을 지시하고 세포 구조를 유지합니다. 종양 미세환경과 같은 병든 미세환경에서는 콜라겐 네트워크가 극적으로 리모델링되어 조성 변경, 침착 강화 및 섬유 조직 변경이 나타납니다. 유방암에서는 종양 경계에 수직으로 정렬된 섬유의 증가가 환자의 예후 저하와 상관관계가 있기 때문에 섬유 정렬의 정도가 중요하다1. 정렬된 콜라겐 매트릭스는 지속적인 이동을 통해 종양 세포의 전파를 증가시킵니다2,3. 다음은 3차원 섬유소 콜라겐 하이드로겔 내에 세포를 내장하기 위한 간단한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 많은 플랫폼에 쉽게 적용할 수 있으며, 조정 가능한 3차원 생리학적 미세환경에서 세포 이동, 세포 분열 및 기타 세포 과정을 조사하기 위해 정렬된 콜라겐 매트릭스와 무작위 콜라겐 매트릭스를 모두 재현 가능하게 생성할 수 있습니다.
서론
많은 세포 과정이 2차원에서 광범위하게 연구되어 기본 세포 신호 메커니즘에 대한 집단 지식을 형성했습니다. 그러나 이러한 연구는 국소 세포 미세환경 및 세포외 기질(ECM)의 구조적 및 기계적 특성에서 얻은 중요한 세포 신호를 무시합니다. 생리학적 맥락에서 세포가 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 이해하려면 3차원(3D) 분석으로 세포를 연구하는 것이 중요합니다. 이러한 3D 분석을 위한 ECM은 세포 유래 또는 정제된 단백질에서 재구성할 수 있습니다. ECM의 출처에 관계없이 3D 매트릭스 분석은 세포가 생리학적 세계 내에서 어떻게 탐색하고 상호 작용하는지 이해하는 데 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 예를 들어, 3D 매트릭스에서 성장한 세포는 2D 실험4-6에서 관찰되지 않은 주변 ECM의 기계적 특성에 따라 달라지는 뚜렷한 운동 모드를 나타냅니다. 더욱이, 3D로 배양된 세포는 유리나 플라스틱과 같은 단단한 표면에서 성장한 세포보다 응력 섬유와 초점 접착력이 점점 더 적어진다7.
그러나 상황별 3D 분석의 중요성은 세포 이동에만 국한되지 않습니다. 일부 다른 세포 신호 전달 이벤트는 3D 분석을 통해서만 조사할 수 있습니다. 조직과 세포가 분화되는 동안 세포 외 환경과 ECM의 강성은....
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프로토콜
1. 중화, 희석 및 3D 조사 및 세포 수축 분석 실험을위한 콜라겐 솔루션의 중합
- 무균 조직 배양 후드에서 얼음에, 콜라겐 (1 : 1) 중화 2 배 PBS에서 살균, 얼음처럼 차가운 100 mM의 HEPES, 15 ML 원뿔 튜브의 pH 7.4,와. 용액이 균질하지 않고 혼합 소용돌이가 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 플라스틱 피펫 충분히 섞는다. 혼합 과정에서 공기 방울을 소개 않도록주의하십시오. 얼음에 잠시 저장합니다.
- 세포 미디어와 적절한 농도 (등 RPMI, DMEM, 등)에 중화 된 콜라겐을 희석.
- N은 = (D은 V *), V는 / (S / 2), N이 필요 중화 콜라겐 양이고는 D 원하는 콜라겐 농도는 인 등식을 사용하여 목적하는 콜라겐의 농도를 확인하는 데 필요한 중화 콜라겐의 양을 계산하는데 바람직한 콜라겐 농도의 최종 부피 및 S는 t이며그는 재고 콜라겐 농도를 시작.
- 세포 및 세포 배지 용액을 첨가하여 부피로 중화 콜라겐의 양을 준비한다. 철저하게 혼합하고 주조 할 준비가 될 때까지 얼음에 저장합니다.
- 예 : (6 ....
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결과
3D 분석법 콜라겐 겔 강성 동일한 범위 내에서 실시 할 수 있지만, 겔 강도를 변화하는 세포들은 세포 미세 환경에서의 기계적 변화에 응답하는 방법을 결정하는데 사용될 수있다. 뻣 뻣 한 콜라겐 하이드로 겔이 포함 된 세포가 로컬 주변의 콜라겐을 수축에없는 젤로 정의된다. 상이한 세포 유형의 고유 수축 독특하고, 따라서 그것은 호환 단단한로 감지 될 콜라겐 농도를 설정하는 간단한 수축 곡선 시작할 최상이다.
셀 번호를 일정하게 유지하고 콜라겐 젤의 농도를 증가시킴으로써 시작합니다. 이전 10,20 바와 같이 겔 강도는 농도가 기하 급수적으로 확장 할 것이다. 수축성 분석의 대표적인 예는도 1에 도시된다. 여기서, 50,000 4T1 세포에 포함 된 eithe라 2 ㎎ / ㎖ 또는 5 일 동안 3.5 ㎎ / ㎖ .......
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토론
3D 콜라겐 젤은 세포가 해석하는 방법을 이해하고 지역의 미세 환경에 대응하는 우리의 도구 상자에 추가되었다. 이 원고는 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 세포를 포함하기위한 아주 기본적인 프로토콜을 제공하고, 재현성 랜덤 또는 정렬 된 콜라겐 섬유와 매트릭스를 생성 할 수 있습니다. 두 프로토콜은 다른 콜라겐 이성체, 가교제, 기타 매트릭스 단백질 잠재적 중합시에 첨가 할 수 있으므로 적응력 플랫폼 작동한다. 또한, 유전자 발현 및 단백질 생산을위한 다른 시간대 및 엔드 포인트를 평가하기 위해 플랫폼을 쉽게 수정할 수있다. 이미지 평가, 단백질 및 RNA 수준, 판독 대사 프로파일은 모든 3D 기법 매우 호환 가능하다.
모든 기술에 중요하기 때문에, 이는 젤 분석의 품질을 평가하는 것이 중요하다. 좋은 품질의 콜라겐 젤의 기호는 수동 조작을 처리 할 수있는 것입니다. 예를 들어, 1 ml의 [1 ㎎ / ㎖여섯 웰 플레이트가 쉽게 집게로 집어 조작해야합니다으로] 콜라겐 겔을 쏟.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어
감사의 글
저자는이 작품을 자금에 대한 허가 번호 UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 및 T32-GM008692-18을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 CT-화재 분석의 개발 및 지원 궤적의 제레미 Bredfelt 및 Yuming 리우를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 고농도 랫 테일 콜라겐 | 코닝 | 354249 | |
| SylGard184 엘라스토머 키트 | Corning | NC9285739 | 엘라스토머 PDMS 채널용 |
| HEPES | Fisher | BP310 | HEPES 중화 버퍼 |
| KCl | Fisher | BP366 | HEPES 중화 버퍼 |
| KH 2 < / sub>PO4 < / sub> | Fisher | BP362 | HEPES 중화 버퍼 |
| Na2 < / sub>HPO4< / sub> | Fisher | S374 | HEPES 중화 버퍼 |
| NaCl | Fisher | BP358 | HEPES 중화 버퍼 |
| 부과금 개선된 Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | 세포 계수 |
| 6-웰 비조직 배양 플레이트 | Corning | 351146 | |
| 50 mm 유리 바닥 접시 | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art 플라스틱 진공 탈착기 | Bel-Art | F4200-2021 | PDMS 투명 필름용 탈기 챔버 |
| 3M | pp2950 | pdms 채널 주입용 플라스틱 필름 | |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | PDMS 마이크로 채널 경화용 핫 플레이트 |
| 진공 레귤레이터 | 정밀 의료 | PM3100 | 콜라겐 마이크로 채널 용 진공 레귤레이터 |
| 8 "x 8"고무 시트 | 아마존 - 고무 칼 | PDMS 마이크로 채널 주입 용 | 60A |
| 8 "x 8"x 0.125 "아크릴 시트 | 아마존 | 플렉시 글라스 시트 | |
| 10 lb 무게 | Amazon | CAP Barbell | PDMS 마이크로채널 |
| 주입용 15 ml 원뿔형 튜브 | Fisher | 352097 | |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Fisher | 352098 | |
| 플라스틱 피펫 | Dot Scientific | 229202B, 229206B, 그리고 667225B | 2 ml, 5 ml 및 25 ml |
| 70% EtOH | 피셔 | NC9663244 |
참고문헌
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local in....
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재인쇄 및 허가
