침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

Summary

여기에 표시된 것은 탈세포화된 심장 조직에서 세포외 기질 미세 구조를 시각화하는 방법입니다.

Abstract

섬유증은 병인에 관계없이 모든 형태의 심장 질환의 구성 요소이며, 심장 기질 생물학 분야에서 많은 진전이 이루어졌지만 기질이 형성되는 방식, 생리학적 및 병리학적 리모델링이 어떻게 다른지, 그리고 가장 중요한 것은 치유를 촉진하고 섬유증을 억제하기 위해 기질 역학을 어떻게 조작할 수 있는지와 관련된 주요 격차가 여전히 있습니다. 현재 심장 섬유증을 조절, 예방 또는 되돌릴 수 있는 치료 옵션은 없습니다. 그 이유 중 하나는 심근경색 후 죽거나 죽어가는 심근세포를 즉시 대체하기 위해 발생하는 것과 같은 심장 흉터 형성의 순전한 복잡성일 수 있습니다. 세포외 기질 자체는 상주 세포를 활성화하고 침투 세포를 소멸된 병변으로 안내하는 데 도움을 줌으로써 리모델링에 참여합니다. 기질은 또한 정상적인 기질 회전율과 섬유성 신호 전달에 중요한 모세포 단백질을 위한 일종의 저장 사물함입니다. 매트릭스는 또한 심장 조직에서 전기 기계적 역할을 하는 것으로 입증되었습니다. 섬유증을 평가하기 위한 대부분의 기술은 본질적으로 정성적 기법이 아니며, 두 그룹을 비교하는 데 유용하지만 기본 매트릭스 구조와 관련된 정보를 제공하지 않는 정량적 결과를 제공합니다. 여기에서 강조된 것은 심장 매트릭스 미세 구조를 시각화하는 기술입니다. 탈세포화된 심장 조직의 주사 전자 현미경은 기존의 정량적 연구 방법으로는 놓칠 수 있는 구조의 현저한 차이를 보여줍니다.

Introduction

섬유증은 정상적인 심근 콜라겐 네트워크를 파괴하는데, 이는 심근세포의 정상적인 기계론적 기능에 매우 중요하며^{, 1,2} 세포 간 통신, 세포 내 신호 전달 및 세포 생존에 매우 중요합니다 ³. 섬유증의 발병은 심장 기능의 주요 결정 요인이며, 다양한 병인으로 인해 발생하는 심장 간질의 섬유화 리모델링은 좌심실 경직 증가와 이완기 기능 장애를 유발한다 ⁴. 심근 섬유증은 또한 부정맥을 유발할 수 있으며, 섬유화 재형성의 진행이 일반적인 현상이든 국소 현상이든 상관없이 허혈성 및 비허혈성 심근병증 환자의 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있다 ⁵. 마찬가지로, 심근 섬유증이 없는 것은 심실 기능 회복과 장기 생존에 대한 강력한 예측 변수이다 ⁶.

섬유증의 특징은 과도한 콜라겐의 침착이며, 이는 강철 ⁷의 인장 강도를 가지며 여러 수준에서 심근 세포 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 과도하게 콜라겐 기질로 인한 기계적 힘은 심근세포 위축 ^8,9, 수동 조직 경직 ¹⁰, 긴장 수축으로 인한 심근 경직 ^11-13, 나머지 심근세포 집단에 대한 산소 전달 감소를 유발할 수 있습니다. 심근세포와 myoFbs의 간극연접 결합은 또한 심장의 전기적 특성을 손상시켜 부정맥 ^14-16의 발병 위험을 높일 수 있습니다. 혈관주위 섬유증은 벽내 관상동맥과 세동맥의 혈관 운동 반응성을 변화시키며, ¹⁷ 산소 공급을 감소시켜 심근세포의 생존을 감소시키는 내강 협착에 기여한다 ^17-22. 허혈성 손상 또는 에너지 불균형의 초기 부위에서 발생하는 병원성 섬유화 및 전기 리모델링은 필연적으로 심부전으로 진행됩니다.

심근세포 괴사는 섬유화 반응을 시작하며, 이후 섬유화 재형성은 병인에 관계없이 발생할 수 있습니다. 심장 섬유증을 조절하는 방법을 찾는 것은 허혈성 및 특발성 심근병증, 고혈압성 심장병증, 비후성 심근병증, 판막 심장 질환 및 이영양증의 치료에 임상적으로 도움이 될 것이다 ^23-42. 섬유성 질환 진행이 어떻게 시작되는지에 관계없이, 용해성 profibrotic factor는 간질공간을 통과하여 초기 섬유성 흉터에서 멀리 떨어진 부위에서 간질성 및 외측성 섬유아세포의 활성화를 유발하여 궁극적으로 심부전으로 이어지는 연쇄 효과를 생성할 수 있습니다. 최적의 시나리오는 수축기 펌프 부전, 이완기 심부전 또는 기타 말기 결과로 진행되기 전에 심근병증의 보상적 비대 단계에서 적용할 수 있는 표적 치료법을 사용하여 섬유질 생성 과정을 활용하는 것입니다. 궁극적인 목표는 섬유증을 역전시켜 죽은 심근세포를 대체하고 심장 기능을 완전히 회복하는 것입니다.

매트릭스의 중요성은 널리 알려져 있지만, 매트릭스를 연구하는 방법은 주로 주요 구조 구성 요소, 특히 콜라겐의 정량적 측정과 다른 매트릭스 및 모세포 단백질의 상대적 수준으로 제한됩니다. 이 프로토콜은 심장 매트릭스의 질적 차이를 평가하는 데 유용한 거의 사용되지 않는 기술을 강조합니다. 이 기술은 최근 심장 질환의 다양한 병인(인간 이식에서)으로 인한 심장 매트릭스의 근본적인 차이를 비교 및 대조하고, 치료되지 않은 동물과 비교하여 신경교세포성장인자(GGF) 뉴레굴린-1β 동형으로 처리된 경색 후 돼지의 심장을 검사하고(⁴³), MDX의 심장 조직 매트릭스 차이를 조사하는 데 사용되었습니다 다양한 연령대의 생쥐(Duchenne Muscular Dystrophy의 일반적으로 사용되는 동물 모델)를 야생형 대조군과 비교했습니다. 이 기법은 1979년 콜필드(Caulfield) 박사와 보그(Borg) 박사에 의해 처음 소개^{되었지만, 45-47} 이 강력한 기법을 사용한 연구는 거의 없었으며, 여기에서 약간의 수정만으로 다시 도입되었다. 이 방법론은 단순히 기질 성분 함량 및/또는 섬유증 수준을 측정할 때 간과될 수 있는 세포외 기질 미세 구조에 대한 정성적 정보를 제공하기 때문에 귀중한 연구 도구입니다.

Protocol

윤리 문 : 동물 처리를위한 프로토콜 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC에 의해 승인 된, AAALAC-국제 표준에 따라 수 M / 1백17분의 10 (돼지) 및 M / 219분의 10 (마우스) 및 실시를 프로토콜. 뱅크 인간의 심장 조직의 사용법은 밴더빌트 대학 의료 센터 IRB (프로토콜 번호 100887)에 의해 승인되었다.

1. 시료 채취 및 보관

1. 0.1 M 인산 완충액 (PB) 용액에 신선한 4 % 글루 타르 알데히드를 확인합니다.
   주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 흄 후드에서 작업용 장갑을 착용하십시오.
   1. 1,000 ml의 DH ₂ O 21.8 _g이 나 HPO _4, 6.4 g의의 NaH ₂ PO _4. 양자 satis (품질 평가 점수)를 사용하여 PB, 산도 7.4의 0.2 M 원액을
   2. PB 원액 2.5 mL 및 2.1 ml의 DH ₂ O.에 50 % 글루 타르 알데히드 400 μl를 추가
2. 덩어리를 담가 (더 큰 이상이 C 없다4 %의 글루 타르 알데히드 용액에 조직의 평방 ^미터). 주 : 작은 조각들도 사용될 수 있지만 쉽게 프로토콜 이후의 단계를 용이하게하기 위해 눈에 의해 가시화 될 수있는 충분한 크기 (NO 미만 5mm ^{2)이어야한다.}
3. 4 ℃에서 무한히 저장 후, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.

심장 조직의 2. 탈세 포화

1. 10g의 수산화 나트륨 펠렛 / 100 ㎖ DH ₂ O.을 사용 신선한 10 % NaOH 수용액을
   주의 : 수산화 나트륨 용액은 부식성 및 알칼리 화상을 입을 수, 장갑을 착용하십시오.
2. DH ₂ O.에서 조직을 씻어
3. 6 실온에서 10 % NaOH 용액에 품어 - 십일 (까지에 붉은 갈색의 조직 변경 오프 흰색 또는 흰색).
4. 조직이 투명하게 될 때까지 DH ₂ O에 씻어.
5. 실온에서 4 시간 동안 1 % 탄닌산의 조직을 담근다. 4 ML의 DH ₂ O. 당 1 ml의 5 % 원액을 사용하여
   주의 : 타닌산강한 자극은, 장갑을 착용하십시오.
6. 밤새 DH ₂ O에 씻어.

3. Osmication과 (안전을위한 연기 후드에서) 심장 조직의 탈수

1. 21.4 g 나트륨 cacodylate, 10.0 g의 염화 칼슘 및 450 ml의 ₂ O. DH를 사용 cacodylate 나트륨 완충액, 0.2 M 스톡 용액을 제조 7.4의 pH를 조정하기 위해 필요에 따라 혼합 한 후 염산. Qs를 500 ml의 DH _(2)와 O.
   주의 : 나트륨 cacodylate 염산은 독성 흄 후드에서 작업용 장갑을 착용하십시오.
2. 50 ㎖ DH ₂ O. 1g의 산화 오스뮴 결정을 용해시켜 안전 흄 후드에서 산화 오스뮴의 2 % 수용액 스톡 용액을 제조
   주의 : 오스뮴 화이이 심한 흡입의 위험이 있습니다; 점막이나 안구의 증기 고정이 가능, 따라서 만 장갑과 흄 후드에서 처리합니다. 스플래시 가드를 권장합니다.
3. DH와 1 : 원액 1을 혼합 (0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 조직을 씻어 _{2 O) 5 회에 분 (또는 부드러운 교반 용).}
4. 세 개의 버퍼 린스 총 두 번 이전 단계를 반복합니다.
5. 회에 1 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 (1 재고 나트륨 cacodylate 및 주식 산화 오스뮴 (1) 혼합)에 1 % 산화 오스뮴의 조직을 담가.
6. 5 분, 회 전자의 각 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액을 3 회 조직을 씻어.
7. 회에 15 분간 각각의 에탄올 농도를 증가 (30 %, 50 %, 75 %, 85 %, 95 %, 마지막으로 100 %)를 사용하여 조직을 헹군다.

SEM 4. 단면 표면 준비

1. 또한, 100 %의 에탄올을 함유하는 얕은 페트리 접시에 100 % 에탄올에 조직을 옮긴다.
2. 양쪽의 플랫 시험편 위에 정삼각형의 양쪽을 형성하기 위해 서로 절단 날 크로스와 접촉되도록 두 개의 매우 날카로운 면도날을 잡아. 이를 달성하기 위해, 샘플의 오른쪽 측면에 하나의 블레이드를 배치 왼손 사용컷 좌측. 동시에, 지금까지 샘플 조각 우측의 좌측의 2 블레이드를 배치 오른손을 사용한다. 따라서, 상기 블레이드는 단일 부드러운 컷을 반대 방향에서 서로에 대해 활주한다.
3. 시험편을 손상시키지 않고 바람직하게는 가능한 한 큰 면적을 노광, 왜곡을 최소화 또는 강제 찢어와 시험편의 매우 깨끗한 컷을 만들기 위해 서로 플랫 블레이드 양측 활주.
4. 주사 전자 현미경의 검사를 위해 가장 깨끗한 가능한 단면 표면을 노출 각 시료에 대해 반복합니다.

5. 임​​계점 건조 (CPD) 심장 조직의

1. 조직이 항상 100 % 에탄올에 남아 있도록, 임계점 건조기 (CPD)의 샘플 홀더에 조직을 전송 주걱이나 핀셋을 사용한다. 홀더는 에탄올 및 전송이 몇 초 이상 더 이상 공기에 노출 된 조직으로 달성되도록 침지되어 있는지 확인합니다.
2. 우리 당 CPD를 작동ER 서 액체 이산화탄소와 에탄올을 대체 사이클 충전 및 퍼지-3을 작성한다.
3. 샘플의 임계점 건조를 달성하고 CO _2의 제어 배기와 대기압에 반환하기 위해 사용 설명서에 따라 CPD를 운영하고 _{있습니다.}

SEM에 대한 심장 조직 표본 6. 장착

1. 알루미늄 스터브의 상면에 탄소 접착제 탭을 접착하여, 각 시험편에 대한 SEM 샘플 스텁을 준비한다.
2. 실체 현미경의 도움으로 조심 (멀리 보이는 탭)에서 위를 향 관심 단면 표면과 접착 탭 시험편을 부착 한 최대한 가까운 샘플 스텁 표면의 평면과 평행하도록. 조사 또는 관심의 표면을 만지지 마십시오.
3. 페인트 응용 프로그램에 대한 이상적인 테이퍼 브러쉬를 달성하기 위해 나무 주걱 스틱을 휴식. 스터브에 부착을 향상시키기 위해, 기지국 및 시험편의 측면에은이나 카본 페인트를 적용한다.
4. 접지 관심 표면으로부터 충전 경로를 제공하기 위해, 관심의 표면의 가장자리까지 칠은 또는 탄소의 매우 얇은 라인을 확장한다.
5. 접지에 따라서 금속 스터브 탄소 탭 표면으로부터 도전로를 제공하는 탄소 탭 둘레은이나 카본 페인트 2-3 작은 덧 입힐 적용 후.
6. 전도성 페인트가 두 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
7. 금 - 팔라듐 합금 또는 금 - 상대적으로 무거운 코팅 (40 내지 30 nm의 목표 범위)를 적용하기 위해 사용 설명서에 따라 스퍼터 코터를 운영하고 있습니다. 0.1 밀리바에 시료 챔버 펌프; 40 초에 타이머를 설정합니다. 8:00 위치 (보통 아르곤 가스 유량)에 오픈 세트 밸브. 를 눌러 시작 30mA에서 스퍼터 코팅을 시작합니다. 퍼플 글로우 방전은 시료 챔버에 표시해야한다.

심장 조직 표본의 7 SEM 시험

1. 화상 (P)을 최소화하도록 비교적 낮은 가속 전압에서 주사 전자 현미경 수행샘플에서 가난한 전하 손실과 관련된 먹는데는 (충전). 제안 된 초기 영상 조건은 다음과 같습니다 5 kV로는 10mm 작동 거리, 가속 전압.
2. 숙련 된 작업자의 도움으로, 고용은 Z 차원에서 상당한 기간 동안 연장하는 다수의 초점면에 섬유 또는 섬유의 초점을 필요로하는 이미징 조건에서 피사계 심도를 확장 할 거리를 작동 증가했다.
   1. 여기에 사용되는 현미경의 사용자 인터페이스 액세스에, 오른쪽 상단에있는 탐색 탭 (재료의 표 참조).
   2. 스테이지 메뉴에서 좌표 탭에 액세스 할 수 있습니다. 다음 입력 된 작업 거리에 샘플 단계를 이동하는 탭에 이동을 클릭 좌표 Z에 대한 밀리미터에 더 큰 값을 입력, 작동 거리를 늘립니다.
3. 숙련 된 오퍼레이터의 도움으로, 전자선에 관심 직교의 표면 위치를 검지 기울기 및 회전을 이용한다. 10 degr 30의 추가 기울기EES이 위치에서 매트릭스 구조의 관찰과 문서를 향상시킬 수 있습니다.
   1. 포커스 작동 거리를 지적, 여기에 사용되는 현미경의 경우, (재료의 표 참조) 사용자 인터페이스에 관심 준비된 표면 평면의 주변 근처의 표본을 집중하고 왼쪽 또는 오른쪽으로 슬라이드를 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 누르고 .
   2. 표면 반복 초점 반대 가장자리 근처에 이동하는 수동 사용자 인터페이스 조이스틱으로 이동합니다. 거리 작업하는 첫 번째 위치와 대략 동일하지 않은 경우, 경사 시편 (7.2 참조) 및 T의 기울기 값이 좌표 입력 스테이지 메뉴의 좌표 탭을 사용하여 두 위치에서 대략적인 합의를 달성했다.
   3. 시편을 90도 회전 (필드 좌표 R에 값을 입력) 및 모든 위치가 거의 동일한 작동 거리에서 초점을 맞추고 때까지 과정을 반복합니다.
      주 : 변압 SEM은 전하 소산을 개선하기 위해 사용될 수있다가능한 경우. 높은 진공 주사 전자 현미경의 표준 동작 모드이다.

Results

강조 표시된 기술은 사용하지 않는 인간의 심장 이식 기증자 (그림 1), 이식, 야생형과 이영 마우스 (그림 3)에서 마음에서 외식 조직에서 심장 조직에, 그리고 돼지에서 후 심근 경색 심장 샘플에 적용되었다 심장 손상 모델 (그림 2). 도 1에 도시 된 바와 같이, 인간의 심장 행렬은 단면에서 보았을 때, 벌집 형 패턴을 표시 가교 된 단백질의 복잡한 직조이다. 각 '벌집'구조는 그림 1의 평면도를 고려할 때 인터 디스크로 연결하면로드 할 때 은유 '터널'을 통해 길이 실행으로 약 40 μm의 폭, 일반적으로 단일 심근 세포를 우회,., 여러 심근 구상 할 수있다 세 차원으로 확장된다. 또한 1 하이라이트도절삭 가공 (그림 1, 오른쪽) 중 "분쇄"하는 부...

Discussion

단면 표면 처리 프로토콜 중 가장 중요한 단계입니다. 임계점 건조 공정에 도입 될 때까지 미세 구조를 보존하기 위해 탈수 시험편은 항상 100 % 에탄올에 남아 있어야한다. 따라서 표본의 슬라이스는 표본이 얕은 접시에 에탄올에 잠겨있는 동안 EM 시험을위한 표면을 수행해야합니다 달성했다. 노출 된 표면이 접촉 또는 후속 처리 중에 프로브되지 않는 것이 중요하다. 프로토콜의 SEM 부분에 관계없이 샘플 기원의 기본 전자 현미경 문제 해결이 필요할 수 있지만 더 중요한 수정은 유사한 매트릭스 관측 다른 조직 유형에이 기술의 응용 프로그램에 대한 예상되지 않습니다. 섬유 샘플에서 수집 한 이미지 ( "충전") 나쁨 전하 소산에 의해 도입 된 유물하는 경향이 있습니다. 충전의 문제는 일반적으로 주사 속도를 증가, 가속 전압 (또한 정지 시간을 감소시킴으로써 최소화 될 수있다) 및 전자 빔의 스폿 사이즈를 감소시킨다. 여러 스캔 통합 저속, 높은 품질의 단일 스캔 이미지에 전하 아티팩트없이 잡음 품질 비교 신호의 화상...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
염화칼슘	전자 현미경 과학	12340	100g
탄소 접착제	전자 현미경 과학	12664	30g
탄소 접착제 탭	전자 현미경 과학	77825	스텁에 맞추기 위해
양면 면도날 스테인레스 스틸	Ted Pella, Inc	121-6	250/pkg
에탄올	전자 Microscopy Sciences	15055	450ml
글루테알데히드, 50% 용액	전자 현미경 Sciences	16310	EM 등급, 증류 정제
염산	전자 현미경 과학	16760 또는 16770	100ml
인산일나트륨 NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250g
오스뮴 Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	1 g
은 전도성 접착제	전자 현미경 Sciences	12686-15	15 g
수산화나트륨 (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500g
탄닌산, 5% 수성	전자 현미경 과학	21702-5	500 ml
트리하이드레이트 나트륨 카코딜레이트	전자 현미경 과학	12300	100 g
금-팔라듐 합금 또는 금	정제 시스템, Inc.	스퍼터 코터 제조사 및 모델에 따라	다름
임계점 건조기	전자 현미경 과학	850
일반 목재 애플리케이터	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 환경 SEM	FEI	Q250 SEM
스퍼터 코터	Cressington Scientific Instruments Ltd.	모델 108
Alluminum SEM Sample Stubs	Electron Microscopy Sciences	75220-12	miscroscope 특이적