액적 미세유체역학에서 다색 형광 검출은 일반적으로 부피가 크고 복잡한 에피 형광 현미경 기반 검출 시스템을 포함합니다. 여기에서는 단일 광검출기에서 수집한 다색 데이터를 시간적으로 인코딩하기 위해 광섬유 어레이를 사용하는 소형 모듈식 다색 검출 체계에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 분석은 밝은 신호와 빠른 시간 응답으로 인해 액적 미세유체역학에 사용되는 가장 일반적인 판독입니다. 멀티플렉스 분석법(multiplex assay), 효소 진화(enzyme evolution) 및 분자 생물학 강화 세포 분류(molecular biology enhanced cell sorting)와 같은 응용 분야에서는 두 가지 이상의 형광 색상을 검출해야 합니다. 자유 공간 레이저를 epifluorescence microscope에 결합하는 표준 multicolor 검출 시스템은 부피가 크고 비용이 많이 들며 유지 관리가 어렵습니다. 이 논문에서는 광섬유에 결합된 레이저가 있는 미세유체 채널의 이산 영역을 여기시켜 다색 검출을 수행하는 계획을 설명합니다. 방출된 빛은 단일 광검출기에 연결된 광섬유에 의해 수집됩니다. 여기(excitation)는 서로 다른 공간적 위치에서 발생하기 때문에 방출된 빛의 정체성을 시간적 변화로 인코딩할 수 있으므로 더 복잡한 광 필터링 체계가 필요하지 않습니다. 이 시스템은 4가지 고유한 염료 조합을 포함하는 액적 집단을 검출하고 플루오레세인의 나노몰 미만 농도를 검출하는 데 사용되었습니다.
서론
마이크로 유체 방울은 캐리어 오일에 현탁 한 수용액 방울 다수의 실험으로 구획하여 높은 처리량 생물을위한 플랫폼을 제공한다. 물방울은 단일 세포 분석이 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 3 등의 다양한 용도에 사용하고, 진화 4 효소되었다. 밝고 신호 빠른 시간 응답 헤르쯔 레이트로 서브 - 나노 리터 액적 부피를 검출 호환되는 형광 분석법, 마이크로 유체 방울의 검출의 표준 모드이다. 많은 애플리케이션은 동시에 두 개 이상의 색상을위한 형광 검출을 필요로한다. 예를 들어, 우리의 실험은 흔히 분석의 결과를 검출 한 채널을 사용하여 액적 분류 실험은 PCR 활성화 행하고, 5 분석 음성 적이 가산 있도록 보조 배경 염료를 사용한다.
액적 미세 유체에 대한 일반적인 탐지 스테이션 바있다표면 형광 현미경에 나오지도, 샘플에 집중 될 현미경에 여유 공간이 레이저에서 여기 광을 소개하는 빛을 조작 체계를 복잡 필요합니다. 형광 액적으로부터 출사 된 후, 각 검출 채널 파장 대역의 중앙에 하나의 광전자 증 배관 (PMT)를 사용되도록 형광을 방출되는 광을 여과한다. 표면 형광 현미경 기반 광 검출 시스템은 그들의 비용, 복잡성 진입 장벽을 제공하....
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프로토콜
1. SU8 마스터 제작
- 디자인 소프트웨어를 사용하여 세 개의 층 제조를위한 미세 유체 구조를 설계하고 10 μm의 해상도 회로 기판 필름의 공급 업체가 인쇄 된 디자인을 가지고있다. 장치 설계의 세부 사항은 첨부 된 문헌 6에 제시되어 채널 형상은도 1에 도시한다. 층은 각 층의 제조 (8)로부터 특징을 배치 할 수 있도록 정렬 마크를 포함한다.
- 스핀 코터에 미리 청소 3 인치 직경의 실리콘 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 80 ㎛의 층 두께를 제공 한 다음 1750 rpm에서 30 초, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심에 SU8-3050 1 ㎖을 적용한다.
- 웨이퍼를 제거하고, 30 분 동안 135 ° C의 열판에서 굽는다. 웨이퍼는 다음 단계로 이동하기 전에 실온으로 냉각 할 수있다.
- 평행 190m에서 1 차 레이어 마스크에 코팅 된 웨이퍼를 노출3 분 동안 LED nm의 W, 365. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 1 분 동안 RT에 다음 시원한를 135 ° C 형 열판에 웨이퍼를 배치합니다.
- 스핀 코터에 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니....
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결과
광섬유의 삽입을 허용하는 PDMS 소자의 제조는 다양한 높이 (도 1)의 채널을 만들 수있는 여러 단계의 포토 리소그래피 절차를 필요로한다. 먼저, SU-8 80 μm의 높은 층은 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 및 유체 핸들링 형상을 작성하는 마스크를 이용하여 패터닝된다. 다음, SU-8의 부가 40 ㎛의 층이 웨이퍼 상에 방사하고, 120 ㎛의 높이 레이저 광 삽입 채널을 형성 할 것이다 형상을 생성하는 제 2 마스크를 사용하여 패터닝된다. 마지막으로, 100 ㎛의보다 SU-8은 웨이퍼 상에 방사하고, 220 ㎛의 높이 검출 광섬유 삽입 채널을 제공하기 위해 패터닝된다. 마스터 개발 차례로 유리 슬라이드에 결합 된 PDMS 소자를 몰드하기 위해 사용된다. 최종 조립은 측면을 통해 액세스 디바이스 120 ㎛ 내지 220 ㎛의 높이 광섬유 채널의 상부에 천공 구멍을 통해 액세스 80 μm의 높이 유동 형상을 포함장치.
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토론
광섬유 검출 유체 채널에 대해 광섬유의 정렬을 필요로한다. 우리 장치 다층 포토 리소그래피로 제조 된 가이드 채널을 이용하기 때문에, 서로에 대한 마스크의 위치가 매우 중요하다. 섬유 가이드 채널은 유체 채널에 너무 근접하면, 유체 누출 가능성이있다; 상기 가이드 채널이 너무 멀리 위치하거나 오정렬되는 경우, 검출 섬유에 의해 수집 된 형광 신호는 크게 감소 될 수있다. 적절한 정렬은 사진 패터닝 동안 함께 배치되는 마스크에 같은 동심원으로 정렬 마크를 디자인하여 도움을받을 수 있습니다. 또한, 장치에 광섬유를 수동으로 삽입 사용할 수 없게 그들을 렌더링, 장치 내에서 섬유의 끝을 깰 수있는 잠재력을 가진 섬세한 과정이다. 현미경으로 관찰하면서 키 된 PDMS 장치에 결합 된 유리 슬라이드에 대해 섬유 억제 천천히 섬유를 삽입하기 SUCCessful 섬유 삽입. 미리 형성된 에멀젼의 마지막 재 주입 취급의 최소 발생한다. 유화가 만든 빈 주사기로 직접 입금되면이 방울 재 주입에 사용되는 때까지 이상적으로, 그것은 양도 할 수 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국방고등연구계획국(DARPA) 보조금 번호 84389.01.44908, NSF CAREER 상(DBI-1253293), NIH 탐색/개발 연구 보조금(CA195709), NIH New Innovator Awards(HD080351, DP2-AR068129-01) 및 UCSF 자원 할당 프로그램의 New Directions 보조금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 포토 마스크 | CadArt Servcies | ||
| 3 "실리콘 웨이퍼, P 형, 버진 테스트 등급 | 대학 웨이퍼 | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml 주사기 | BD | ||
| 10ml 주사기 | BD | 309604 | |
| 27 게이지 바늘 | BD | 305109 | |
| PE 2 폴리에틸렌 튜브 | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | 일반적으로 HFE 7500 |
| Ionic Krytox 계면활성제로 | 지침, 참조 #10 | ||
| Dextran-conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| 플루오레세인 나트륨염 | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| 파이버 포트 | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| 렌즈 튜브 | Thorlabs | SM1L05 | |
| 패치 케이블, 200 μ M 코어 / 225 μ 하나의 벗겨진 끝과 하나의 FC/PC 커넥터가 있는 m 클래딩 광섬유 | Thorlabs | 사용자 정의 | |
| 패치 케이블(105 μ); M 코어 / 125 μ 한쪽 끝이 벗겨지고 FC/PC 커넥터가 하나씩 있는 m 클래딩 광섬유 | Thorlabs | Custom | |
| 125 μ m 섬유 스트리핑 도구 | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 μ m 섬유 스트리핑 도구 | Thorlabs | T10S13 | |
| 레이저 섬유 어댑터 | OptoEngine | FC/PC 어댑터 | |
| 405 nm CW 레이저 at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | CNI 레이저 |
| 473 nm CW 레이저 디스트리뷰터 at 50 MW | 광엔진 | MLL-FN-473-50 |
참고문헌
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, ....
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재인쇄 및 허가
