자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.
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방법 논문
체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리
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이 논문에서
요약
초록
줄기 성인 췌장 전구 세포가 제 1 형 당뇨병 환자를 치료하기위한 치료제 베타 - 유사 세포의 잠재적 인 원인이 될 수있다. 줄기 및 전구 세포를 성인 췌장에 존재하는지 그러나, 아직 알려져 있지 않다. 성인 쥐 계통 추적 CRE-LOX를 사용하여 연구 전략 지원 또는 중 베타 세포 덕트 성인 췌장 전구 세포가 존재할 수있다 추정 위치에서 생성 될 수 있다는 생각을 반박한다는 결과를 수득 하였다. 이러한 생체 CRE-LOX 계보-추적 방법은, 그러나, 자기 갱신과 줄기 세포를 정의하는 데 필요한 멀티 혈통 분화 두 가지 기준의 질문에 대답 할 수 없습니다. 이 기술 격차를 해결하기 위해, 우리는 췌장 전구 세포에 대한 3 차원 식민지 분석을 고안했다. 곧 우리의 초기 발행 후, 다른 연구소는 독립적으로 organoid 분석라는 비슷하지만 동일하지, 방법을 개발했다. organoid 검정에 비해, 우리의 방법을 사용낮은 농도에서 세포 외 기질 단백질의 포함을 허용 점성 용액을 형성하는 메틸. 많은 성인 장기 줄기 세포의 경우, 상기 메틸 - 함유 분석은 쉽게 검출 및 선조 작은 서브 모집단을 구성 할 때 중요한 단일 세포 수준에서 선조 세포의 분석을 허용한다. 함께, 여러 실험실에서 결과는 마우스의 췌장 전구와 같은 세포의 체외 자기 갱신 및 멀티 혈통 분화에 보여줍니다. 현재의 프로토콜을 마우스 췌장 전구 세포의 특징을 두 메틸 계 콜로니 검정을 기술; 하나는 라미닌 하이드로 알려진 뮤린 세포 외 기질 단백질의 상업적 제조 및 다른 인공 세포 외 기질 단백질을 포함한다. 여기에 도시 된 기술은 1)은 췌장의 해리 CD133 + Sox9 / EGFP의 정렬 성체 생쥐 + 도관 셀은 S 2) 단일 세포 조작이다orted 세포, 3) 단일 콜로니는 자기 갱신 또는 차별화를 평가하기 위해 보조 식민지 분석에 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 단일 세포 현탁액 및 재 도금에 차 식민지 4) 분리를 사용하여 분석한다.
서론
췌장은 세 가지 주요 세포 계통으로 구성된다; 선포 세포는 소화 효소가, 덕트가 병원균을 방어하고 장내에 소화 효소를 수송하는 점액 분비 분비 및 내분비 세포는 포도당 항상성을 유지하는 인슐린과 글루카곤을 포함한 호르몬을 분비. 췌장의 배아 발달 동안 초기 도관 세포는 성체 동물의 1,2- pancreata에서 세 계통 상승을 제공 할 수있는 트라이 강력한 선조 세포의 근원이다. 골수 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포 및 선조 세포는 이미 성공적으로 각종 질병 (3)을 치료하는 데 사용되기 때문에, 성인 췌장 줄기 및 전구 세포를 찾는데 큰 관심이있다. 분리 및 성인 췌장 줄기 및 전구 세포의 조작이 가능하다면,이 세포는 인슐린 분비 세포가자가 면역에 의해 파괴되는 제 1 형 당뇨병 등의 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
배아 개발의 완료가 많이 과학계에서 논의되는 질문 후 트라이 강력한 전구 세포는 여전히 성인 췌장 관에 존재 여부. 이 토론에서, 그리고 사용하여 생체 CRE-LOX 계보 - 추적 기술을,이나 다와 동료 마커, 탄산 탈수 효소 II 표지 성인 쥐 도관 세포, 세 췌장 계통 (4)을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이러한 HNF....
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프로토콜
윤리 정책 : 우리는 품질 및 결과의 무결성을 보장하기 위해 연구를 수행에서 널리 윤리적 기준을 준수. 동물 실험은 희망의 도시에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행된다.
1. 성인 쥐 Pancreata에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다
주 : 앞서 공보 7,11에서는 CD-1 또는 배경 B6 마우스가 사용되었다; 모두 배경이 유사한 결과를 얻었다. Sox9 궤적 (19, 20)에 의해 구동 강화 된 녹색 형광 단백질 (Sox9 / EGFP 지정) 형질 전환 마우스 라인은 CD-1 배경에서 만든.
- 1-2 분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 가스의 CO 2를 사용하여 3 ~ 5 성인 쥐를 안락사. 다음으로, 각 마우스의 자궁 전위를 수행합니다.
- 해부 및 Pancreata를 준비합니다.
참고 : 안락사 후 가능한 한 빨리 쥐를 해부하다. 이는 췌장의 자동 소화를 방지하는 것이 중요사후 변경.- 가위를 사용하여 마우스의 복부 벽의 중간 선에 세로 절개를하고 복강을 엽니 다. 비장을 찾아 조심스럽게 들어 올려 집게를 사용합니다. 비장과 위 췌장의 비장 엽 사이의 결합 조직을 잘라.
- 췌장의 십이지장과 ....
- 가위를 사용하여 마우스의 복부 벽의 중간 선에 세로 절개를하고 복강을 엽니 다. 비장을 찾아 조심스럽게 들어 올려 집게를 사용합니다. 비장과 위 췌장의 비장 엽 사이의 결합 조직을 잘라.
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결과
성인 췌장 전구 세포는 형광 활성화 세포 분류 (도 1)에 의해 농축 될 수있다. ~ Sox9 20 75킬로바이트 상류 ~ 150킬로바이트 하류 서열을 여기서 사용 Sox9 / EGFP 유전자 변형 마우스 선 먼저 GENSAT 뇌 아틀라스 프로젝트 (19)의 결과로 생성하고, EGFP 리포터를 함유하는 세균 인공 염색체가 제어 . 이러한 쥐, EGFP 효율적 특히 22 췌장 관 라벨. 췌장 조달 및 단일 세포 현탁액 내로 해리 및 STV - APC와 접합 이차 항체로 염색 하였다 비오틴과 접합 항 CD133 항체로 염색 하였다. 생성 된 세포는 적절한 게이팅 파라미터들 (도 1)와 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 다른 게이팅 매개 변수를 사용하여 얻은 세포 분류와의 메틸 셀룰로오스 함유 식민지 분석에 도금 될 수있다콜로니 형성. 이전 연구에서,.......
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토론
췌장 식민지 분석 및 단일 콜로니는 여기에 설명 분석 지난 수십 년 23 조혈 전구 세포의 생물학을 해독에서 중요한 역할을 한 메틸 셀룰로오스 함유 조혈 식민지 분석에 의해 영감을했다. 이 분석에서 (그림 5), 췌장 세포로 도금 해리 메틸 셀룰로오스 함유 링, 밀도 또는 내분비 / 선포 식민지 (7)의 형성을 지원하는 적절한 성장 인자와 ECM 단백질과 반 고형 미디어를. 세포 콜로니에 상승을 부여 할 수있는 하나의 전구 세포는 PCFU 불린다. 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색을 사용하여 개별 식민지를 특징으로, 원래 PCFUs의 계보 잠재력을 추론 할 수있다. 그것은 성인 쥐 PCFUs의 대부분은 트라이 강력한, 체외 7,9에 도관, 선포하고, 내분비 계통 세포에 상승을 제공 할 수 있다는 사실을 발견했다. MUR 동안오프라인의 ECM 단백질 덕트 계통으로 트라이 강력한 PCFU의 분화를 촉진, 라미.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 정렬에 도움을 희망의 도시에서 분석 세포 계측법 코어에서 루시 브라운과 알렉산더 Spalla 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 DAT 지지대에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 R01DK081587 및 R01DK099734 HTK, 그리고 ADR에 U01DK089533 및 부여에 의해 부분적으로 지원 HTK 푸에르 테 재단과 엘라 피츠 제럴드 재단의 조셉 J. 제이콥스 DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소, 이들로부터 감사 인정도 있습니다.
자금 조달 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다 HTK에 R01DK081587 및 R01DK099734을 부여하고, ADR에 U01DK089533, 그리고에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 DAT는 조셉 J. 제이콥스에서 지원DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소와 옥스 나드 재단과 HTK에 엘라 피츠 제럴드 재단들도 기....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 쥐 ECM 단백질(Matrigel) | Becton Dickson(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크) | 354230 | 재고 -20 ° C |
| 라미닌 하이드로겔 | 제공: David Tirrell (Pasadena, CA, USA) | 재고는 -20 °으로 유지되었습니다. C | |
| 메틸셀룰로오스 | Shinetsu Chemical (일본 도쿄) | 1,500 센티포이즈 (15 g/cm/sec와 동등한 동적 점도 단위) (고점도) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, 미국) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm 현탁 배양 접시 | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | 재고는 -20 °으로 유지되었습니다. C |
| 안티-마우스 CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | 저내독소, 아지드 프리 |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (미국 캘리포니아주 샌디에이고) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (미국 캘리포니아주 샌디에이고) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (미국 캘리포니아주 샌디에이고) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (미국 캘리포니아주 샌디에이고) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (미국 캘리포니아주 샌디에이고) | 405207 | |
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌 | 인비트로겐 ( 매사추세츠주 월섬, USA) | 3571 | 재고는 -20 °으로 유지되었습니다. C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | 재고는 -20 °으로 유지되었습니다. C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| 파라포름알데히드 | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| 염소 혈청 | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | 재고 유지 -20 ° C |
| 당나귀 혈청 | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | 재고 유지 -20 ° C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, 미국) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 13-678-8B | |
| 40 μ m Filter Mesh | Fisher Scientific (미국 펜실베니아 주 피츠버그) | 08-771-1 | |
| 70 μ m filter mesh | Fisher Scientific (미국 펜실베이니아 주 피츠버그) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 well suspension | Sarstedt | 83.3924 (previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (샌프란시스코, 캘리포니아, 미국) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 동적 어레이 샘플 및 Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm(미국 캘리포니아주 샌프란시스코) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master | Mix Applied Biosystems(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) | 4304437 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 | 시그마(미국 미주리주 세인트루이스) | P7949 | |
| 유리 바닥 접시 | MatTek(미국 매사추세츠주 애쉬랜드) | P35G-1.5-14-C | 유리 바닥 |
| 이 있는 35mm 페트리 접시마우스 피스/고무 튜빙 | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| 니코틴아미드 | 시그마(미국 미주리주 세인트루이스) | N0636 | 재고 -20 ° 유지; C |
| 혈관 내피 성장 인자 | R& D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | 재고는 -80 °으로 유지되었습니다. C |
| 액티브뱅 B | R& D Systems(미국 미네소타주 미니애폴리스) | 659-AB | 재고는 -80 °으로 유지되었습니다. C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | 재고는 -20 °으로 유지되었습니다. C |
| Rspondin-1 | R& D Systems(미국 미네소타주 미니애폴리스) | 3474-RS | 재고는 -80 °으로 유지되었습니다. C |
| Falcon 5 ml 폴리스티렌 라운드-바텀 튜브 | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | 평평하고 투명한 바닥과 뚜껑. 검은색 폴리스티렌 TC 처리된 마이크로플레이트 |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M 도립 현미경 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (샌프란시스코, 캘리포니아, 미국) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1%(중량/부피) BSA 펜스트렙 (49 단위/ml 페니실린, 49 μ g/ml 스트렙토마이신) | ||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1%(중량/부피) BSA 펜스트렙 (49 단위/ml 페니실린, 49 μ g/ml 스트렙토마이신) Dnase 1 (췌장당 2,400 단위/ml) |
참고문헌
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al.
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재인쇄 및 허가
