표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

요약

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

초록

바이러스 유사 입자 (VLP를) 및 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)은 살아있는 병원체의 사용을 통해 증대 바이오 안정성의 이점을 제공하는 바이러스 백신 디자인에 대한 대체 방법이다. 비 감염성 및자가 조립 VLPs를 살아있는 병원체 또는 항원 전달을위한 재조합 바이러스 벡터의 필요성을 우회 면역원으로 구조 단백질을 제공하는 데 사용된다. 이 글에서, 우리는 전임상 동물 실험에서 미래의 애플리케이션을위한 VLP 설계 및 개발의 여러 단계를 보여줍니다. 절차는 다음 단계를 포함 항원 투여에 대한 항원의 선택, 선택의 세포주, VLP를 / SVPs의 정제 항원의 발현 및 정량화. 우리는 우리의 항원의 발현 모두 포유 동물 및 곤충 세포 라인의 사용을 설명하고 방법은 수율이 다른 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 병원체의 종류에 적용 할 수있는 면역 원성 항원 STR로 대체함으로써 달성 될 수있다관심 사용자 미생물 uctural 단백질. VLP를하고 SVPs는 항원의 특성과 최고의 백신 후보의 선택에 도움이됩니다.

서론

바이러스 유사 입자 (VLP를)은 인간의 예방 접종에 대한 승인 된 기술입니다. 실제로, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 간염 Β 포함한 더 현대적 허가 백신의 일부 (HepΒ) 백신이 방법을 사용한다. VLP를이 자기 ​​조립이 가능한 구조 단백질로부터 형성된다. 조립 된 입자는 바이러스 모폴로지을 모방하지만, 감염 또는 바이러스 성 게놈이 부족하기 때문에 복제 할 수 없습니다. VLP를가 표현 원핵 생물과 진핵 생물 시스템의 수와 정제 할 수있다. - 28 %, 효모 - 20 %, 식물 - 9 %, 곤충 - 28 %, 그리고 포유류 - 15 % ¹ 박테리아 : 문헌의 검토는 서로 다른 발현 시스템은 다음과 같은 비율로 사용되는 것으로 나타났습니다. 참고로, L1 캡시드 단백질을 기반으로 HPV 백신은 효모 (가다실) 또는 곤충 전지 시스템 ^{(서바릭스)이} 생산됩니다. HepΒ 백신, 및 Recombivax Engerix-Β 또한 효모에서 생산 한 HepΒ 표면 항원 ^(3)로 구성되는4.

우리는 여러 조립 구조 단백질의 공동 발현을 요구하는 VLPs를 생성하는 포유 동물 및 곤충 세포 발현 시스템을 사용한다. 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 뎅기열 ....

프로토콜

인플루엔자 H3N2 VLP의 생성 1.​​ 포유 동물 발현 시스템

1. 이러한 서브 클론 전술 pTR600 진핵 발현 벡터 내로 구조적 바이러스 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 개그 P55. ⁷
2. 화학적 능력 대장균 (예 DH5α)에서 DNA를 증폭하고 제조자의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 형질 급 플라스미드를 분리. DNA의 양 수율 및 사용자의 필요에 따라 달라집니다.
3. 가습 인큐베이터에서 5 % CO _2, 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 성장 배지에서 포유 동물 세포주 293T를 유지한다.
4. 은 T-150 조직 배양 플라스크 플라스크 다음 하루 전체 세포 부착 및 85-95% 세포 포화 상태를 취득하도록 플라스크 당 45-75 × 10 ⁶ 세포를 포함하도록 세포를 성장. 원하는 conflu에 대한 현미경으로 세포를 검사ency.
   참고 : 높은 세포 밀도는 전형적 그러나 과도한 컨 플루 세포 부산물 폐기물의 축적의 결과 및 세포 생존을 감소 상업적 형질 전환 시약을 사용하는 경우 최소한의 세포 독성을 최적 단백질 발현을 생성 ....

결과

VLP 수익률은 바이러스 항원 구조 설계에 의한 변수했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 초 원심 분리하여 상층 액의 SVP 또는 VLP를 생산 및 정제를위한 곤충과 포유 동물 세포의 사용을 증명하고있다. DENV PRM / E 구조 유전자 발현 카세트의 네 아형 표 1 (1-4으로 경계가) DENV SVPs의 버전을 구성하고 0.6 ml의 양으로 총 단백질 mg을 1.1-2.6의 범위를 보여주기 위해 사용되었다. HA에 대한 2 : 1 : 세 개의 유전자 구조가 필요 VLPs를 들어, 우리는 (1)의 최적화 된 DNA를 형질 전환 비율을 발견 NA : 개그 각각 인플루엔자 VLPs를 합성하는 단계; 대조적으로, 다중 chikungunya 바이러스 단백질을 발현하는 하나의 플라스미드를 재조합 배큘로 바이러스 및 포유류 CHIK VLP의 생성에 적합 하였다. 또한, 듀얼 플라스미드 형질 전환 절차는 형질 1 RSV F 및 개그와 같은 포유 동물.......

토론

우리는 성공적으로 SVPs 다양한 병원균에 대해 여러 구조 단백질로 구성 VLP를 표현하고 정화 위에서 설명한 기술을 사용했다. 일반적으로, 우리는 VLPs를 생성하는 포유류 발현 시스템을 사용한다. 그러나, 우리의 손에, 포유 동물 세포는 CHIK의 VLP 수익률이 낮았다 산출했다. 재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 시스템을 사용하는 경우 CHIK VLP의 수율은보다 강력했다. 일반적으로, 배큘로 바이러스 곤충 세포 시스템은 동안 제어하에, 또한 때문에 외래 유전자의 발현 수준에서 높은 수준의 조직 배양 플라스크 대 스피너 플라스크에서 배양 될 수있는 더 높은 세포 밀도에서 발생할 수 재조합 단백질의 더 많은 양을 수득 바큘로 바이러스 폴리 헤드린 프로모터. ¹⁶ 그러나, 배큘로 바이러스를 사용하는 단점은 보조적 활성을 갖는 VLP 제제에서 배큘 매우 존재하고 백신 스큐 면역 결과 우리는 인플루엔자 V의 수율에 변화가 발견 ¹⁷ 연구이며사용 된 HA와 NA의 조합에 따라 LP의; H3N.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스미드 맥시 키트	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus 발현 시스템	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 다중점 교반기 플레이트	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear 초원심분리기 튜브	Seton	7025	초원심분리기 및 버킷 크기에 적합한 튜브 확인
Micro BCA 단백질 분석 키트	ThermoFisher Scientific	23235
인산염 구연산염 완충액	Sigma	P4922
o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드	시그마	P8287
0.22 & m 진공 필터 상단 (500 ml)	Nalgene	569-0020
글리세롤	시그마	G5516
H2SO4	Sigma	339741
SF-900 II SFM	써모피셔 사이언티픽	10902-096