여기에서는 쥐 대식세포 내에서 자라는 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로부터 박테리아 RNA를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 다른 세포 내 병원체 및 포유류 숙주 세포와 함께 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 감염 중 박테리아 병원체의 전사체 분석은 감염을 매개하는 유전자와 요인을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 감염된 세포나 조직에서 박테리아 RNA를 분리하는 것은 포유류 RNA가 대부분 감염된 세포의 용해물을 지배하기 때문에 어려운 작업입니다. 여기에서는 골수 유래 대식세포 내에서 자라는 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아의 RNA 분리를 위한 최적화된 방법을 설명합니다. 감염 시 세포는 약하게 용해되고 빠르게 여과되어 대부분의 숙주 단백질과 RNA를 버리고 온전한 박테리아는 유지합니다. 다음으로, 고온 페놀-SDS 추출 후 DNase 처리를 사용하여 박테리아 RNA를 분리합니다. 추출된 RNA는 여러 기술에 의한 유전자 전사 분석에 적합합니다. 이 방법은 대식세포 감염 중 리스테리아 모노사이토제네스 유전자 조절에 대한 연구에서 성공적으로 채택되었습니다 1-4. 이 프로토콜은 다른 박테리아 병원체 및 세포 유형을 연구하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.
서론
세포 내 세균 병원체 ─ 전염병 성장과 인간의 호스트의 내부 세포를 재생할 수있는 원인이 박테리아는 ─ 전세계 주요 건강 문제 5입니다. 침입 포유 동물 세포 내에서 복제하는 세포 내 병원체는 병원성 정교한 메커니즘 요인을 취득했다. 이러한 메커니즘은 질병을 일으킬 수있는 능력에 기초하지만, 우리는 그들의 규제와 역학에 대해 조금 알고있다. 액체 배지에서 자란 균의 유전자 발현 프로파일을 숙주 세포 내에서 실제 환경을 반영하지 않기 때문에, 이들의 세포 내 틈새에서 자란 균 사체 분석에 대한 필요가 커지고있다. 이러한 분석은 호스트에 의해 트리거 특정 세균 적응의 해독을 가능하게 할 것이다 및 치료 설계를위한 새로운 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 포유 동물의 RNA가에 의한 세균의 RNA를 능가하기 때문에 세포 내 성장 세균의 사체 분석은 매우 도전최소 10 배. 이 논문에서 우리는 쥐의 대 식세포의 세포 안에 성장 리스테리아 박테리아에서 세균의 RNA를 분리하는 실험 방법을 설명합니다. 추출 된 RNA는 세포 적응 및 RT-PCR, RNA-SEQ 마이크로 어레이 혼성화 및 다른 기반 기술로서 전사 분석의 다양한 기술에 의해 병원균의 독성 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
리스테리....
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프로토콜
주 : 전체 실험 동안, 대식 세포는 5 % CO 2 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션 단지 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되는 실험 조작을위한 인큐베이터 취출. L. 작업 모노 사이토 박테리아는 생물 안전 수준이 규정에 따라입니다.
1. 셀 준비 및 세균 감염 (주 1, 2)
- 1 일
- 30 ml의 BMDM + 펜 연쇄상 구균 미디어 (표 2)에서 145mm 접시에 씨앗 2.0 × 10 (7) 골수 유래 대 식세포 세포 (BMDM). 각 균주에 대한 종자 3 판을 분석한다. 5 % CO 2 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션.
- 야생형 (WT) L.의 하룻밤 세균 배양을 시작합니다 표준 인큐베이터에서 30 ° C에서 뇌 심장 주입 (BHI) 배지 10ml에 변형 10403S 모노 사이토 겐. 지역 문화 튜브는 흔들림없이 경사. 노트:이러한 성장 조건은 효율적인 감염을 촉진 편모 유전자의 발현을 상향 조절한다.
- 2 일
- 37 ° C에서 사전 따뜻한 BMDM의 (펜 연쇄상 구균의 항생제없....
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결과
모델 시스템은도 1에 도시 L. 감염 대 식세포를 포함 대 식세포의 세포질에서 복제 박테리아, 모노 사이토 겐. (2) 실험 방식을 나타내는 그림. 그림 3은 WT L. 동안 독성 유전자의 예 RT-qPCR에 분석의 전형적인 결과를 나타냅니다 풍부한 실험실 매체 BHI의 성장에 비해 식세포의 성장 모노 사이토 겐. 결과는 L. 두 주요 독성 인자의 전사 수준을 보여준다 모노 사이토; hly LLO 독소를 코딩하고 ACTA는 견고 식세포 감염시 유도 조립체 액틴 단백질을 코딩.
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토론
여기에 설명 된 프로토콜은 L.에서 세균 RNA의 분리를위한 최적의 방법을 나타냅니다 대식 세포에서 세포 내 성장 세균 모노 사이토 겐. 이 프로토콜은 세포 용해 차분에 기초하여 세균 RNA의 농축을위한 두 가지 주요 단계를 포함한다 : 원심 분리 및 여과에 의해 박테리아의 신속한 수집을 사용하여 대 식세포 핵 침강. 이 단계는 표준 RNA 추출 과정 뒤 따른다. 이 프로토콜은 listerial RNA의 정제를 설명하지만, 쉽게 다른 세균성 병원체에 변형 될 수있다. 이 방법은 전사 분석을 위해 RNA 정제에 초점을 맞추고 있지만, 호스트로부터 세포 내에서 성장하는 박테리아를 분리하는데 사용되는 원칙은 등 DNA, 단백질, 세포 벽 같은 유전체와 같은 다른 박테리아 성분의 정제에 적용 할 수있다 생화학 적 분석은 세포 내 병원체에 대한 이해 및 특성화를 제공 할감염의 과정 동안 라이프 사이클.
총 세균 RNA의 ~ 100 NG의.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Herskovits 실험실의 연구는 335400 ERC 및 R01A/109048 NIH 보조금으로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| C57B/6 암컷 마우스 | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC 처리수를 |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| 글루타민 사용 가능 | Gibco | 25030081 | |
| 피루브산 나트륨 | Gibco | 11360-088 | |
| β-메르캅토에탄올 | Gibco | 31350010 | |
| 펜/스트렙 | Gibco | 15140-122 | |
| 겐타마이신 | 시그마-알드리치 | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수-PBS | 시그마-알드리치 | D8537 | |
| 뇌 심장 주입 (BHI) | 머크밀리포어 | 1104930500 | |
| 페놀 포화 pH 4.3 | 피셔 | BP1751I-400 | |
| 클로로포름 | 피셔 | BP1145-1 | |
| 이소아밀 알코올 | 시그마-알드리치 | W205702 | |
| 아세트산나트륨 | 시그마-알드리치 | ||
| EDTA | 시그마 알드리치 | EDS | |
| DNaseI | 발효 | EN0521 | |
| SDS 10 % | 시그마 알드리치 | L4522 | |
| 에탄올 절대 | 머크 밀리 포어 | 1070174000 | |
| 37 ° C, 5% CO2 강제 공기 인큐베이터 | Thermo Scientific | 모델 3111 | |
| 셀 스크래퍼 | Nunc | 179693 | |
| Kontes 유리 홀더 45 mm 필터용 | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore 필터 45 mm, 0.45 &마이크로; m | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac 시스템 | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm 세포 배양 접시 | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml 튜브, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 > C 인큐베이터 | Thermo Scientific | ||
| 65 ° C 열 블록 | Thermo Scientific | ||
| 4 ° C 테이블 원심분리기 | Eppendorf | 5417R | |
| 멸균 피펫, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon 튜브, 50 ml | Greiner | ||
| 액체 질소 |
참고문헌
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A.
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재인쇄 및 허가
