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방법 논문

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

8.2K 조회수

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DOI:

10.3791/54058

⸱

2016년 4월 7일

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

인간 당뇨병 장기 배양 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료의 예는 이러한 각막에서 지연된 상처 치유와 현저히 감소된 상피 줄기 세포 마커 발현의 정상화를 위해 제시됩니다. 또한 줄기세포가 풍부한 윤부 상피 배양에서 이 과정의 최적화를 설명합니다.

초록

이 프로토콜의 목적은 인간의 당뇨병 각막 분자 변화를 설명하고 그들이 장기 배양 각막의 아데노 바이러스 유전자 치료에 의해 완화 될 수있는 방법을 설명하는 것입니다. 당뇨병 각막 질환은 각막 신경 및 상피 창상 치유의 빈번한 이상과 당뇨병의 합병증이다. 우리는 또한 인간의 당뇨병 각막의 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 대폭 변경 식을 설명했다. 이러한 변화를 완화하기 위해, 아데노 바이러스 유전자 치료가 성공적 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) 발현의 상향 조절 및 / 또는 단백질 분해 효소의 기질 금속-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F.이 치료의 하향 조절을 사용하여 구현 된 당뇨병 각막 상처 치유를 가속화 만 윤부 줄기 세포 구획 형질 때에도. 가장 좋은 결과는 복합 치료를 얻었다. 정규화 된 줄기 세포의 이식 가능한 환자의 경우, 예를 들어도 optimizati의 제시폴리 양이온 강화제를 사용하여 줄기 세포 농축 문화 유전자 전달의에. 이 방법은 선택된 유전자뿐만 아니라, 각막 상피​​의 상처 치유의 다른 매개체를 위해 단지 유용한 세포 기능 줄기있다.

서론

당뇨병 각막 질환은 주로 퇴행성 상피 (각막)과 신경 (신경 병증) 변경을 초래한다. 그것은 종종 상피 상처 치유 및 각막 신경의 감소 1-4의 이상에 의해 명시된다. 추정 60-70%의 당뇨병 환자는 다양한 각막 문제 1,3- 있습니다. 우리의 연구는 변경된 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) (간세포 성장 인자 수용체)의 하향 조절을 포함하여 인간 당뇨병 각막에서의 발현 및 매트릭스 메탈-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F (5, 6)의 상향 조절 여러 마커 단백질을 확인 하였다. 또한 상당히 설명 인간 당뇨병 각막 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 발현이 감소하고있다.

이전의 연구에서는 당뇨병 느린 상처 치유를 보여준다 인간 당뇨병 각막 기관 배양 시스템을 사용하여, 당뇨병 변경 마커의 수준을 정상화 아데노 바이러스 계 유전자 치료제를 개발마커의 변화 및 생체 각막 -7,8- 유사한 세포 마커의 발현 감소 줄기. 변경이 지속성은 후생 유전 학적 대사 메모리 (9)의 존재로 인해 나타납니다. 이 문화 시스템은 유전자 치료에 대한 더 사용했다. 이 치료의 목표는 당뇨병 각막 (C-충족 프로토 종양 유전자) 또는 발현 증가 (MMP-10, 카 텝신 F)에서 감소 된 표현 중 하나와 마커에서 선택되었다.

아데노 바이러스 (AV) 치료는 전체 장기 배양 각막 또는 만 공막 윤부 주변 구획에 사용 하였다. 이 구획은 각막 상피를 갱신 적극적 4,10-15 상처 치유에 참여 상피 줄기 세포 항구. 여기에서, 프로토콜은 정상과 당뇨병 인간의 각막 기관 배양 상피 상처 치유, 분리 및 줄기 세포 농축 윤부 세포 배양의 특성, 및 아데노 바이러스 세포와 각막 전달 제공됩니다. 우리의결과는 향후 이식 당뇨 각막에 마커 표현과 상처 치유를 정규화이 치료의 가능성을 보여줍니다. 또한 병용 치료는 당뇨병, 각막 16-18 정상 마커 패턴 상피를 복원 할 수있는 가장 효과적인 방법임을 시사한다.

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프로토콜

국립 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, PA는) 합의 된 사후 건강하고 당뇨병 인간의 눈과 각막을 공급했다. NDRI의 인체 조직 수집 프로토콜은 건강 감독의 국립 연구소에 경영위원회와 제목에 의해 승인된다. 이 연구는 승인 된 시더 - 시나이 의료 센터 임상 시험 심사위원회 (IRB) 면제 프로토콜 EX-1055에 따라 진행되고있다. , 박사를 각막 외과 공동. E. Maguen와 Y 라 비노 위츠는 줄기 세포가 풍부한 각막 상피​​ 문화의 분리를 위해 폐기 공막 바퀴를 공급했다. 이 연구는 승인 된 IRB 프로토콜 Pro00019393에서 진행되고있다.

1. 인간 각막 오르간 문화

참고 : 정상과 당뇨병 각막 또는 전부의 눈은 냉장 각막 저장 매체에 수신 (예를 들어, Optisol GS) 국가 공급 업체 NDRI 사망 후 48 시간 이내에.

  1. 집게와 저장 용기에서 각막을 제거하고 난 그들을 두 번 씻어n은 항생제 항진균제 (ABAM) 혼합물. 전체 눈의 경우, 곡선 가위로 글로브에서 각막을 잘라. 적어도 5mm 결막 림을두고도 ABAM의 각막을 씻는다.
  2. 각막 오목 부에 배치 할 수있는 혼합물을 제조한다. 이는 혈청의 최소 필수 배지 (MEM)를 포함 ABAM 1 밀리그램 / (0.1 N 아세트산 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액으로부터 제조) 용액 송아지 피부 콜라겐, 1 % 한천, 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌 이루어져 (7)을 보충합니다.
  3. 전자 레인지 살균과 한천 용해 비등이 혼합물. 모든 용해하는 것은 1 분까지 걸릴 수 있습니다. 끓을 때 혼합물이 쉽게 오버 플로우 때문에 부분적으로 개방 된 튜브의 캡을 둡니다. 이러한 이유로, 여러 사이클 비등 10-15 초 동안 각각 필요할 수있다. 37 ~ 39 ° C의 혼합물을 냉각.
  4. 멸균 60mm 요리에 각막을 아래로 상피면을 놓습니다. 1.2에 설명 된 혼합물의 약 0.5 ml의와 각막 오목를 입력합니다. 그만큼혼합물을 2 분 이내에 각막에 굳은.
  5. 아래로 멸균 60 mm 요리의 각막을 한천 측면을 놓고 ABAM와 MEM을 포함하는 전체 매체를 추가하고, 인슐린 트랜스페린 - 셀렌 보충 7 (37 ° C)는 공기 - 액체 인터페이스 문화에 대한 윤부에서 대략 그 수준을 유지. 중간 볼륨은 접시 당 7-8 ml 인 것을.
  6. 물 팬과 가습 5 % CO 2 배양기로 각막과 접시를 놓고 35 ° C (정상 각막 온도)에서 (이런 식으로, 습도 레벨 또는 95 % 이상으로 유지된다). 각막을 습하게하는 상피 세포에 매일 100 ㎕의 매체 (2 방울)를 추가합니다.
  7. 각막 형태 및 4X의 목적으로 표준 현미경을 사용하여 전송 된 빛 아래 현미경 상피 세포 생존을 모니터링합니다. 하루 그래서 한 번 수행합니다.
  8. 3 일 매체를 변경합니다. 각막는 적어도 3 주 동안 배양 될 수있다. 3~5일 유전자 치료 실험 배양 각막 다음 transduc관심 (4.1-4.4)의 유전자를 가진 전자는 상처 치유 프로토콜 (2.1-2.4)에 형질 전환 유전자 및 피사체에 따라 다른 3-5일 떠난다.

2. 상피 상처 치유

주 : 허약 상피 기저막이 정상 각막에서 발생하지 않는 프로세스에서 분리되기 때문에, 당뇨병 각막, 기계적 연삭에 의한 상피 조직 제거가 가능하지 않다. 따라서, 상처 치유와 유사한 조건 하에서 정상 및 당뇨병 각막을 유지하기 위해, N 헵탄과 상피의 화학적 제거는 19을 사용한다. 이 절차는 상피를 제거하지만 모두 정상 및 당뇨 각막에 손상 기저막 뒤에 떠난다.

  1. 중앙 상피 변연 절제술 (20)를 수행하려면, 75 초 동안 중심 각막 전방 표면에 n 형 헵탄에 적신 5mm 여과지 디스크를 넣습니다.
  2. 필터를 제거하고 전체 매체의 각막을 씻는다. 0.5 ml의 한천 - 콜라겐과 오목 채우기1.4에서와 같이 혼합물과 문화. 변연 절제술 후 상피 세포는 일반적으로 죽고 현미경 그대로 기저막 (7)를 뒤에 남겨 내놓고.
  3. 만 윤부 유전자 치료와 실험에 큰 상피 상처를 만들기 위해 8.5 mm 디스크를 사용합니다. 이는 치유 과정에서 윤부 줄기 세포의 참여를 확인한다.
  4. 현미경으로 각막 치유를 모니터링합니다. 상피 결함이 완전히 치유 될 때까지 매일 4 배 및 10 배에서 사진을 확인합니다. 치유 과정은 (정상 또는 당뇨병) 상태와 상처 크기에 따라 2 ~ 15 일 걸릴 수 있습니다.
    참고 치유 과정 동안 흑색 거미 유사 세포가 정상 초점면에서 관찰된다. 이 세포는 상피 제거 4 사망 사멸 간질 간질하다. 치유는 이러한 죽은 세포는 치유 상피 세포에 의해 자란 없습니다 더 이상 볼 (그림 2, 삽입) 때 완료된 것으로 결정된다.
  5. 치료 후완성은 반으로 각막을 잘라 저온 유지 장치 섹션에 간접 면역 형광 또는 웨스턴 블롯 16,21에 대한 간섭 단층 화합물 및 프로세스를 포함.

줄기 세포 농축 문화의 윤부 세포 및 유지 보수 3. 분리

참고 : 공막 림에서 기본 윤부 상피 줄기 세포 (LESC) 풍성 문화를 준비합니다. 각막 이식은 표준 각막 저장 매체 (예를 들어, Optisol)의 협력 외과 의사로부터받은 후 건강한 기증자에서 나오는 폐기 림. 그렇지 않으면, LESC 농후 배양 정상 및 당뇨병 전체 각막로부터 절단 테두리로부터 얻어 질 수 있거나 각막 기억 매체로부터 수신 NDRI 글로브.

  1. 전체 각막 또는 글로브가 사용되는 경우, 먼저 윤부 영역을 격리. 이렇게하려면, 상피면 멸균 플라스틱 접시에 각막을 배치하고 9 mm의 트레 (원형 각막 칼)와 중앙 영역을 제거합니다.이 중앙 부분을 폐기하십시오. 그런 다음 13mm의 트레를 사용하여 윤부 영역을 절제하고 외부 결막 부분을 폐기합니다. 분리하는 세포는 베이글과 같은 윤부 림을 사용합니다. 세포 분리 전에 멸균 면봉으로 표면 상피 반대 각막의 내측으로부터 내피 세포와 홍채 부착 잔재를 제거한다.
  2. 디스 파제 처리를 사용하여 각막 윤부 세포 시트를 분리합니다. 2 시간 22 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 1.5 ㎖의 각질 세포를 무 혈청 배지 (KSFM) 2.4 U / mL의 디스 파제 II와 함께 각 공막 림 부화.
  3. 부드럽게 집게 해부 스테레오 현미경 림 오프 윤부 상피 세포 시트를 용이하게하고, 0.25 % 트립신 1 ㎖로 세포를 해리 - 실온에서 30 분 동안 0.02 %의 EDTA 용액.
  4. 매체 (예 Epilife) 10ml에 세포를 세척하고 실온에서 5 분간 탁상용 원심 분리기 (300)에서 그들을 XG 펠렛.
  5. 재현 탁 일배양 배지에서 세포 E : N2, B27과 인간 각질 세포 성장 보충제, 10 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF)와 매체.
  6. KSFM에서 0.5 μg의 / cm 2에서 피브로넥틴, 유형 IV 콜라겐, 라미닌 (FCL)을 포함한 인간 기저막 단백질의 혼합물로 코팅 된 플라스크 3,000-5,000 세포 / ml 또는 60mm 접시에서 세포를 종자 매질.
  7. 배양은 37 ℃에서 습윤 (95 % 이상의 습도) CO 2 인큐베이터에서 세포는 완전히 융합 단층을 형성 할 때까지. 이 1 ~ 2 주 정도 소요될 수 있습니다.
    참고 : 정기적으로 PAX6, 각질 (K) 14, K15, K17, 및 ΔNp63α를 포함하여 추정 LESC 마커에 대한 긍정적 인 면역 세포 화학 염색에 의한 세포의 신원을 확인합니다. 차 항체를 포함하는 염색 세부 사항은 8,16-18,22을 발표했다.
  8. 37 ° C에서 10 분 동안 (0.25 % 용액 5 희석 1) 세포 합류 통로, 1 ㎖의 0.05 % 트립신 용액을 처리한다. 5 ml의 대두 그럴 추가3.5과 매질 (4) 및 원심 셀 : ypsin 억제제 용액 (/ ㎖의 10 ㎎)을 1 희석.
  9. 희석 된 대두 트립신 억제제 용액 3 ml의 세포 펠렛을 세척 하였다. 2 × 104 세포 / ml에서 FCL 피복 상 세포 (3.7 참조) 또는 유리 접시 챔버 슬라이드 접시.

장기 배양 각막 4. 아데노 바이러스 형질 도입

참고 : 재조합 아데노 바이러스 (AV)는 AV-벡터 (어떤 유전자가 삽입되지 ()는 C-충족 유전자 오픈 리딩 프레임), AV-cmet (MMP-10의 shRNA)와 AV-shM10 및 AV-shCF 포함 ( shRNA를 포함) F를 카 텝신합니다. 그들은 큰 즉각적인 초기 사이토 메갈로 바이러스 프로모터의 조절하에 유전자를 발현 E1 / E3 결실 형 5 AV이다. 는 AV-cmet 바이러스는 AV 벡터 패드 / CMV / V5-DEST (16)를 사용하여 생성됩니다. 는 AV-shRNA를 바이러스는 사용자 정의 복제 - 무능한 (-E1 / -E3) 구호 물자로 iLenti-EGFP 벡터에서 H​​H1 프로모터 및 GFP 태그 시퀀스와 함께의 shRNA 서열의 서브 클로닝에 의해 생성되는n 개의 AV 형 아데노 4 발현 시스템 (17)을 사용하여 5 게놈.

  1. 유전자 발현 변조 AV와 AV-벡터와 다른 각막과 각 쌍 중 하나 장기 배양 각막을 형질 도입. 24 잘 접시의 잘의 매체면에서 각각 각막을 유지 37 ℃에서 48 시간 동안 배양 배지에서 각막 당 0.8 8 10 × 1.25 플라크 형성 단위 (PFU)에서 AV-cmet를 사용합니다. 각막 당 1-2 × 10 8 PFU에서 AV-shRNA를 바이러스를 사용합니다.
  2. 75 μg의 / ㎖ 실데나필 시트 레이트 보충 전체 매체에 전달에 대한 바이러스를 사용합니다. 이 시약은 상피 세포 (21)에 의해 바이러스의 흡수를 촉진 카베 올린 전송을 활성화합니다. 때문에 수용액에서 비아그라의 짧은 반감기로, 나중에 매체 4-5 시간에 동일한 금액을 다시 추가 할 수 있습니다. 표준 치료는 48 시간입니다.
  3. 윤부에서 중간 수준을 유지 AV 않고 중간에 둥근 끝 멸균 주걱과 문화와 새로운 요리에 각막을 전송합니다. 추가 후itional 액체 - 공기 계면에서 4~8일, 공정 상피 상처 치유에 대한 다양한 분석 또는 시험을위한 AV 처리 각막 (위 참조). 정기적으로 각막의 상단에 100 μl의 매체 (2 방울)를 추가하여 문화 동안 각막을 적시고.
  4. 만 윤부 세포의 형질 도입의 경우, 중앙 상피의 전달을 피하기 위해, 윤부에서 중간 수준의 공기 - 액체 계면에서의 각막과 바이러스를 배양한다.

배양 된 윤부 세포의 5 아데노 바이러스 형질 도입

  1. 0.5 μg의 / cm 2에서 FCL 혼합물로 코팅 된 플라스틱 접시에 10 NG / ㎖ EGF와 매체에 LESC 농후 배양 (3.5 참조)를 유지한다.
  2. 녹색 형광 단백질 유전자 (AV-GFP) 또는 AV 스크램블 감염 다중도의 범위에서 shRNA를-GFP를 (: 1-300 PFU / 세포 MOI)를 형질는 AV와 70-80%에 포화 상태에 도달 한 배양 세포를 형질 도입 2 NG / ㎖ EGF와 매체이다. transductio를 수행N, 0.5 mL의 배지에서 20 시간 뒤에 최소 부피 (0.2 ml) 중, 37 ℃에서 4 시간 동안. 카베 올린 반송 활성제 실데나필은 세포 배양 전달을 위해 필요하지 않다.
  3. 중 폴리 양이온 (1 μg의 / ㎖ 폴리 -L- 리신, 5 μg의 / ㎖ 폴리 브렌) 또는 6 μL / mL를 전달 시약 (다음 AV 전달 효율을 향상시키기 위해 세포 표면에 결합하는 AV 용이 다음의 시약을 사용하여 예 ViraDuctin) 20 μL / mL를 전달 증강제 (예 ibiBoost).
  4. 는 AV없이 하나 배지를 교체 한 후, 가습 된 CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 배양 한 세포를 부화 및 반전 형광 현미경을 이용하여 GFP 발현 수준을 평가한다.
  5. 는 AV-형질 문화에서 세포 이동을 평가하기 위해 스크래치 상처 치유 분석을 사용합니다. 멀티 웰 챔버 슬라이드에 세포를 성장. 200 μL의 PI와 함께 선형 직선 운동으로 세포를 긁어서 단층의 상처 만들기pette 팁. 부상 후, 분리 된 세포를 제거하는 새로운 하나의 매체를 변경합니다.
  6. 4X 배율 거꾸로 현미경에 부착 된 디지털 카메라로 매일 상처 사진. 치료가 완료 될 때 시간을 기록 (상처 가장자리 전체 상처 따라 접촉).

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결과

우리는 각막 기관 배양 물에서, 당뇨병 성 마커 (예, 기저막 단백질과 인테그린 α3β1) 정상 및 당뇨병 사이 각막 창상 치유의 발현의 차이가 유지되도록 미리 보여 주었다. 이 배양 시스템은 유전자 변형 당뇨병 마커, C-MET, MMP-10의 수준을 정상화 치료를 목적하고, 카 텝신 F.시켰다

전체 각막 상피​​는 MMP-10, 카 텝신 F (개별적으로 또는 조합)에 AV-cmet 또는 AV-shRNA를 형질 도입되었을 때, 상피 상처 치유 속도가 매우 빠르고 완료되었다 (P <짝 스튜던트 t 테스트로 0.03에 비해 같은 기증자 (16, 17)에서 AV-벡터 형질 동료 각막에 비해 AV-벡터). 는 AV-cmet 크게 정상적인 각막의 치료에서 차이가 없었다 절반에 의해 치유 시간 (Figu 감소

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토론

각막 인해 유전자 전달뿐만 아니라 효과와 부작용의 평가가 쉽게 그 표면 위치를 유전자 요법을위한 이상적인 조직 것으로 보인다. 그러나,이 방법의 강력한 임상 번역으로 인해 유전 각막 질환의 원인 및 유전자 치료 대상 24 부족한 정보를 여전히 느리다. 각막 변경을 포함하는 당뇨병 합병증은 신진 대사 메모리 (9)로 번역 자연의 대부분 성적인 될 수있다. 그 때문에, 당뇨병 조직 및 세포는 생체 외에서 그 이상을 유지하고, 장기 및 조직 배양에서 연구 될 수있다. 또한, 당뇨병 환자는 유전자 치료에 의해 보정 될 수있는 유전자 발현 수준 및 패턴의 특정 변화를 야기한다. 우리가 정상화 각막 기관 배양 7,8 줄기 세포 구획 5,6,8 포함한 당뇨병 각막 상피에서 변경 여러 마커를 식별하고 사용했다유전자 치료 마커 발현과 당뇨 각막 상피​​ 손상된 상처 치유.

우리 때문에 강한 유전자 ...

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공개 사항

저자는 금전적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

NIH/NEI R01 EY13431(AVL), CTSI 보조금 UL 1RR033176(AVL) 및 재생 의학 연구소, Cedars-Cedars Medical Center의 보조금의 재정 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
최소 필수 매체Thermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS 바우쉬 & Lomb50006-OPT
ABAM 항생제-항진균 혼합물Thermo Fisher Scientific15240062
송아지 피부 콜라겐 시그마-알드리치 C9791
한천, 조직 배양 등급시그마-알드리치 A1296
n-헵탄올시그마-알드리치 72954-5ML-F
O.C.T. 컴파운드 VWR 인터내셔널25608-930
Dispase II Roche Applied Science4942078001
각질 세포 무혈청 배지(KSFM) Thermo Fisher Scientific17005042
칼슘이 함유된 EpiLife 배지Thermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 배지 보충제, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 배지 보충제, 50xThermo Fisher Scientific17504-044
인간 각질 세포 성장 보충제, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
트립신 0.25% - EDTA 0.02% 페놀 레드Thermo Fisher Scientific25200056
트립신 0.25% 페놀 레드 ThermoFisher Scientific15050065
대두 트립신 억제제 시그마-알드리치 T6414
소 태아 혈청Thermo Fisher Scientific26140079
인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충제 (ITS)Sigma-Aldrich I3146-5ML
케라틴 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253
케라틴 15Santa Cruz Biotechnologysc-47697
케라틴 17Santa Cruz BiotechnologySC-58726
Δ NP63&알파;Santa Cruz Biotechnologysc-8609
PAX6BioLegendPRB-278P-100
항체 nidogen-1R& D SystemsMAB2570
인테그린 &알파에 대한 항체; 3&베타; 1EMD MilliporeMAB1992
인간 피브로넥틴BD Biosciences354008
인간 라미닌Sigma-Aldrich L4445
인간 유형 IV 콜라겐시그마-알드리치 
아데노바이러스
아데노바이러스 발현 GFPKeraFASTFVQ002
실데나필 시트레이트, 25 mgPfizer, 약국
표피 성장 인자에서 Thermo Fisher ScientificPHG0311
폴리-L-라이신시그마-알드리치 P4707
폴리브레네Sigma-Aldrich 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Germany50301
인산염 완충 식염수 (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Corning 라운드 엔드 주걱 Dow Corning3005
60 mm 페트리 접시Thermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II 멀티웰 챔버 슬라이드 시그마-알드리치C6807
200 μ l 피펫 팁BioexpressP-1233-200다른 공급업체에서 사용 가능한
도립 현미경 NikonDiaphot기타 공급업체/모델 사용 가능
가습 CO2 인큐베이터 Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)사용 가능한 다른 공급업체/모델 형
광 현미경Olympus, 일본BX-40기타 공급업체/모델 사용
dissecting stereo microscopeLeica, GermanyS4 E기타 공급업체/모델 사용 가능
항체 MMP-10 shRNA Capital BioSciences를 발현하는 C6745-1ML cathepsin F를 발현하는 맞춤형 아데노바이러스 shRNA Capital BioSciences 스크램블 shRNA를 발현하는 맞춤형 아데노바이러스 및 GFP Capital BioSciences의 c-met OriGene(플라스미드)을 발현하는 맞춤형 아데노바이러스SC323278 가능

참고문헌

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425(2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

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