이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.
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방법 논문
상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는
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이 논문에서
요약
초록
상세한 프로토콜은 이전에 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 섹션 아밀로이드 Aβ 플라크를 식별하기 위해 여기에서 제공되는 미리 매립 면역 및 조직 처리 (구체적으로는 이온화 된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1), 미세 아교 세포에 의해 발현되는 칼슘 결합 단백질) 전자 현미경 (EM). 메 톡시 X04은 고밀도 코어 Aβ 플라크에서 발견 된 β-주름 시트에 바인딩 선택적으로 혈액 - 뇌 장벽을 통과하고 형광 염료입니다. 메 톡시 X04과 동물의 주입 전에 희생 뇌 고정 미리 선별하고 시간 소모적 인 조작으로 추가 처리를 위해 플라크 함유 뇌 구간 선택을 허용한다. 섹션의 작은 분획에 존재하는 거의 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 콩고 레드, Thioflavin S, 및 Thiofl와 조직 섹션의 사후 처리AVIN의 T (또는 메 톡시 X04과)는 β-주름 시트 레이블을하지만, 여분의 염료를 제거하기 위해 에탄올 광범위한 청산이 필요하며 이러한 절차는 미세 보존과 호환되지 않습니다 수 있습니다. 또한 단지 올바른 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 부분을 산출하기 위해, Aβ (및 IBA1 같은 다른 세포 마커) 관심있는 지역의 모든 뇌 부분에 대한 표시를 수행하는 비효율적 인 것입니다. 중요한 것은, Aβ 플라크는 전자 현미경으로 검사 할 영역의 정확한 식별 (일반적으로 몇 평방 밀리미터에 이르기까지)을 허용, EM을위한 조직 처리 후에도 볼 수 있습니다.
서론
아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크 형성은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 신경 병리학 적 특징이다. 그러나 증거가 증가 질병 진행 1,2-에서 면역계의 중요한 역할을 시사한다. 특히, 전임상 및 임상 시험의 새로운 데이터는 AD 병리에 대한 기본 드라이버와 기여 면역 기능 장애를 설립했다. 이러한 연구 결과를 통해, 중추 및 말초 면역 세포는 AD 3으로 유망한 치료 목표를 등장했습니다. 다음 프로토콜은 아밀로이드 베타 플라크 증착 및 AD에서 소교 표현형 변화 사이의 관계에 대한 새로운 통찰력을 생성하는 빛과 전자 현미경 (EM)을 결합한다. 이 프로토콜은 형광 염료 메 톡시 X04의 생체 내 주입에 사용 AD의 마우스 모델에서 Aβ 플라크의 표시를 할 수 있습니다. 메 톡시 X04 쉽게 뇌 실질을 입력 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 높은 β-와 주름진 시트를 결합 할 수있는 콩고 레드 유도체ffinity. 형광 염료이기 때문에, 두 개의 광자 현미경 4 Aβ 플라크 침착의 생체 내 검출을 위해 사용될 수있다. 일단 Aβ에 결합, 메 톡시 X04은 해리 또는 플라크에서 멀리 재배포, 그것은 시간이 지남에 따라 그 형광을 유지하지 않습니다. 일반적으로 뇌 역학 (5)의 비 침습성 영....
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프로토콜
참고 : 대학 라발의 동물 관리위원회에 의해 관리로 모든 실험 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 부합에서 기관 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 4 세 사이 21개월 APP-PS1 수컷 마우스를 사용 하였다. 음식과 물을 무료로 이용할와 25 °의 C -이 동물은 22에서 12 시간 명암주기에서 보관 하였다.
1. 메 톡시 - X04 솔루션 준비
- 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 45 % 프로필렌 글리콜 및 45 % 인산 나트륨 완충 용액 (100 mM의 인산 완충액에서 0.9 % NaCl을 함유하는 용액에 메 톡시 X04 용해 톡시 - X04 (9)의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 , 산도 7.4).
- 마이크로 저울을 사용하여 메 톡시 X04 화합물 5 mg의 무게. 흄 후드에서 DMSO에 톡시 - X04 녹이고 투명한 녹색 용액이 얻어 질 때까지 교반한다. 이어서 프로필렌 글리콜 pH를 추가각 추가로 교반하면서 생리 식염수를 버퍼 osphate.
- 회 전자의 O / N 4 ° C에서 솔루션을 저어. 황색 녹색 에멀젼을 얻습니다. 용액을 저하없이 두 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
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결과
이 섹션은 프로토콜의 다른 중요한 단계에서 획득 할 수있는 결과를 나타낸다. 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare : 특히 결과는 뇌 메 톡시 X04 스테인드 특정 지역에 플라크와 관심 층을 포함하는 섹션의 예를 보여줍니다. 플라크 및 해마의 라멜라 / 지방 조직은 연속 UV 밝은 필드 필터 (도 1)의 조합을 사용하여 가시화된다. 선택된 뇌 섹션 이후 면역 염색 및 Aβ 플라크의 트랙을 유지하면서 그들은 여전히 형광 다음 면역 염색 것을 고려, EM에 대한 처리 및 산화 오스뮴 및 포함 (그림 1) 치료 다음과 주변 neuropil보다 어둡게 될 수 있습니다. 이것은 로카에 기초하여, 전자 현미경으로 검사 한 영역을 (일반적으로 몇 밀리미터 제곱)를 식별 할 수 있도록플라크의 기. 또한, IBA1와 미세 아교 세포의 사전 내장 면역 염색을위한 개선 된 프로토콜은 여기에.......
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토론
이 프로토콜은 EM과 고밀도 코어 Aβ 플라크를 대상에 대한 상호 접근 방법을 설명합니다. 생체 내 주입에 톡시 - X04은 예를 들어, 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare을 Aβ의 특정 지역 내 플라크와 관심의 층을 포함하는 뇌 부분을 신속하게 선택할 수 있습니다. 본 예에서, 메 톡시 X04 사전 심사는 소교 표현형은 고밀도 코어 Aβ 플라크의 존재 하에서 미세 수준에서 시냅스와 상호 작용하는 방법을 다른 연구 IBA1에 대한 면역 염색 미리 내장과 결합되었다.
미세 아교 세포는 주위에 엄청나게 반응이 염증 활성 및 긴 정상적인 뇌 기능 저해와 AD의 발전을 개선의 맥락에서 검토되고있다. 특히, 이들 세포는 CHR 선도, 그들의 광범위한 활성화 및 염증성 사이토 카인의 방출에 신경 변성 과정에 연루되었다onic 신경 염증, 정상 뇌의 중단은 15 항상성. 최근에는, 그러나, 이들 상주 면역 세포는.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
퀘벡 센터 de recherche du CHU de Québec의 바이오이미징 플랫폼의 Sachiko Sato 박사와 Julie-Christine Lévesque의 기술 지원에 감사드립니다. 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) RGPIN-2014-05308, 밴팅 연구 재단 및 캐나다 스코틀랜드 라이트 자선 재단(Scottish Rite Charitable Foundation of Canada)이 M.E.T에 제공한 보조금이 이 작업을 지원했습니다.
H.E.H.는 레바논 교육 및 고등 교육부로부터 장학금을 받았으며, Faculté de médecine of Université Laval로부터 K.B.를 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg 기질, |
| 정제당 프로필렌 글리콜 | Sigma Aldrich | W294004 | |
| 디메틸 설폭 시드 (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | 주의 : 독성 |
| 염화나트륨 NaCl | 시그마 | S9625 | |
| 인산나트륨 일염기성 일수화물 | 시그마 | S9638 | |
| 인산나트륨 이염기성 | 시그마 | S0876 | |
| 트리스 염산염 | 피셔 시약 | BP153500 | |
| 아크롤레인 | 시그마 | 110221 | 주의: 독성 |
| 파라포름알데히드 과립 전자 | 현미경 과학 | 19210 | 주의: 독성 |
| 여과지 | Fisher | 09-790-14F | |
| 튜빙이 있는 연동 펌프 | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel 날개 달린 혈액 수집 세트 바늘 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | 팁 모양 : 곡선 |
| 가위 | FS T | 14090-09 | 팁 모양 : 직선 |
| Hartman 지혈 | T 13003-10 | 팁 모양 : 곡선 | |
| 수술 용 가위 | FS T | 14004-16 | 팁 모양 : 직선 |
| 마이크로 해부 가위 | ROBOZ 외과 상점 | 5818 | |
| 유리 섬광 바이알 | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| 진동 블레이드 마이크로톰 Leica VT1000 S | Leica Biosystems | ||
| 진동 블레이드 | 전자 현미경 과학 | 71990 | |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24웰 조직 배양 플레이트 | Fisher Scientific | 353047 | |
| 에틸렌 글리콜 | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| 글리세롤 | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| 과산화수소, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| 수소화붕소나트륨 | 시그마 | 480886 | |
| 트리스 HCl | 피셔 | BP153-500ML | |
| 소 태아 혈청(FBS) | 시그마 알드리치 | F1051 | |
| 소 혈청 알부민(BSA), 분획 V | 토마스 사이언티픽 | C001H24 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | T8787 | |
| 안티 IBA1, 토끼 | WAKO | 019-19741 | |
| 염소 안티 토끼 IgG | Jackson 면역 연구 | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | 주의: 독성 |
| 오스뮴 테트록사이드, 4% 용액 | 전자 현미경 과학 | 19150 | 주의: 독성이 있는 |
| Durcupan™ ACM 단일 구성 요소 A | Sigma | 44611 | 수지 주의: 독성 |
| Durcupan™ ACM 단일 구성 요소 B | 시그마 | 44612 | 경화제 주의: 독성 |
| Durcupan™ ACM 단일 구성 요소 C | Sigma | 44613 | 가소제 주의: 독성 |
| Durcupan™ ACM 단일 구성 요소 D | Sigma | 44614 | 가속기 주의: 독성 |
| 에탄올 | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| 프로필렌 옥사이드 | 시그마 | 110205 | 주의: 부식성 |
| 알루미늄 무게 접시 | 전자 현미경 과학 | 70048-01 | |
| ACLAR® – 불소 중합체 필름 | 전자 현미경 과학 | 50425 | |
| 오븐/인큐베이터 | VWR |
참고문헌
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher,....
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재인쇄 및 허가
