맥락막신경총(CP)의 상피 세포는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 형성합니다. BCSFB의 시험관 내 모델은 인간 맥락막 신경총 유두종(HIBCPP) 세포를 사용합니다. 이 기사에서는 세포 배양 필터 삽입 시스템을 사용한 HIBCPP 세포의 배양 및 기저측 감염에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌의 심실계에 위치한 맥락막총(CP)의 상피 세포는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 형성합니다. BCSFB는 혈액에서 뇌척수액(CSF)을 분리하고 분자 교환을 최소한으로 제한하는 기능을 합니다. BCSFB의 시험관 내 모델은 인간 맥락막 신경총 유두종(HIBCPP)에서 유래한 세포를 기반으로 합니다. HIBCPP 세포는 밀착연접(TJ)의 형성, 경상피 전기 저항(TEER)의 발달, 거대분자에 대한 미미한 투과성을 포함한 전형적인 장벽 기능을 나타냅니다. BCSFB를 통해 중추신경계(CNS)에 침투하여 뇌수막염과 같은 심각한 질병을 유발할 수 있는 여러 병원체가 있습니다. 이러한 병원체 중 하나는 인간 특이적 박테리아인 Neisseria meningitidis(N. meningitidis)입니다. 역 세포 배양 필터 삽입 시스템에서 HIBCPP 세포를 사용하면 기저측 세포 측에서 BCSFB 세포와 병원체의 상호 작용을 연구할 수 있으며, 이는 생체 내와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 세포 배양 삽입물에서 HIBCPP 세포의 파종 및 배양에 대해 설명합니다. 또한, 이중 면역형광을 통한 침입 및 부착 박테리아의 분석과 함께 N. meningitidis에 의한 세포의 감염이 입증되었습니다. CP의 세포는 종양 세포의 뇌 전이뿐만 아니라 알츠하이머병 및 다발성 경화증과 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다른 질병에도 관여하기 때문에 모델 시스템은 다른 연구 분야에도 적용될 수 있습니다. 이는 분자 메커니즘을 해독하고 새로운 치료 표적을 식별할 수 있는 잠재력을 제공합니다.
서론
혈액 - 뇌척수액 장벽 (BCSFB)은 혈액과 뇌 (1) 사이의 세 가지 장벽 사이트 중 하나입니다. 그것의 형태 학적 상관 관계가 맥락막 신경총 (CP) 2,3의 상피 세포이며, 강력하게 혈관과 뇌의 뇌실에 위치하고있는 내피 - 상피 컨볼. 제어 포인트는 뇌척수액 (CSF)를 생산뿐만 아니라 혈액에서 후자를 분리하는 역할을한다. 장벽 기능을 달성하기 위해, CP 상피 세포는 낮은 pinocytotic 활성을 나타내는 특정 전송기를 표현하고 조밀 기밀 접합 (TJS) 2,3-의 연속적인 네트워크에 의해 접속되어있다.
일본인 여성 4 악성 맥락막 신경총 유두종 유래의 인간 맥락막 신경총 유두종 (HIBCPP) 세포의 BCSFB의 시험 관내 모델의 기능을 구성하는 데 사용 하였다. HIBCPP 세포는 TJ의 형성 등의 기능 BCSFB의 특성 몇 가지를 보여스트랜드 transepithelial 전기 저항 (티이)로 판정 할 수있는 높은 transepithelial 막전위의 개발 및 거대 분자를위한 작은 투과성. 또한, HIBCPP 세포는 이온 성 미세 환경을 조절하는 역할을하고, 기저 / 혀끝 극성 5,6,7를 표시 할 수 있습니다....
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프로토콜
1. 거꾸로 모델 시스템에서 시드 HIBCPP 세포에 대한 세포 배양 필터 삽입을 준비
- 5 μg의 / ㎖ 인슐린 보충 전 따뜻한 DMEM / F12 (HAM), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 10 % 소 태아 혈청 (FCS).
- 거꾸로 12 웰 플레이트 (도 1E)로 3 ㎛의 공극 크기 0.33 cm² 성장 영역 세포 배양 필터 삽입 배치 무균 핀셋을 사용한다.
- 세포 배양 필터 인서트의 하부 구획실 (약 3 mL) 및 필터 인서트의 상부에 100 ㎕의 배지를 채운다. 플레이트뿐만 아니라 매체와 낮은 구획 홍수. 필터 인서트의 하부 구획 (도 1E)를 충전 상태로 유지하는 방식으로 과도한 매체 기음.
참고 :이 단계에 대한 혈청 학적 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. - , 뚜껑을 12 웰 플레이트를 커버하고 인큐베이터에 준비된 세포 배양 필터 삽입을 전송 37 ° C,세포에 첨가 할 때까지 5 % CO 2.
2. 재배 및 HIBCPP 세포의과 Passaging
- 5 μg의 / ㎖, 100 U / ㎖ 페니실린, 100....
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결과
여기에서 우리는 역 세포 배양 삽입 시스템에서 배양 및 HIBCPP 세포의 감염을 설명합니다. 이 모델은 우리가 (도 1)을 전파하고, 혈류를 통하여 상피 세포에 진입 박테리아의 생리 학적 상태를 재생 상기 기저 셀 측으로부터 침입 메커니즘 기본 분자 신호 경로를 연구 할 수있다.
HIBCPP 셀 최소 레벨에 대한 분자 교환을 제한 할 수 있도록 소정의 배리어 기능을 표시. 이것은 adherens 접합 (AJ) 꽉 접합 (TJ) 단백질의 발현에 의해 달성된다. TJ 관련 단백질 occludin은, 클라우딘 및 ZO-1의 면역 형광 분석은 세포 TJS의 연속 가닥 (그림 2A, B, C)에 의해 서로 연결되어 있음을 입증, 세포 - 세포 접촉의 사이트에 중단없이 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. t의 상.......
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토론
제어 포인트의 상피 세포는 혈액 2,3-에서 CSF를 분리 BCSFB을 형성한다. 우리는 최근 BCSFB의 기능적 인간 모델로 HIBCPP 세포주를 확립. 세포는 높은 막 전위의 개발 고분자에 대해 낮은 투과성뿐만 아니라 TJS 5 연속 스트랜드의 존재를 포함하여 시험 관내 BCSFB 중요한 장벽 기능을 표시. TJ 단백질은 세포의 기저 / 혀끝 극성에 기여한다. 극성 표면 수용체에 관한 지역화 높은 중요성뿐만 아니라 특정 수송 체 단백질이다. 우리는 CNS 6,7 내에서 높은 제어 미세 환경을 유지하는 ATP 바인딩 카세트의 수용체 ECAD와 만난뿐만 아니라 회원 (ABC) 트랜스 포터 가족의 극성 현지화를 보여 주었다.
BCSFB을 극복하여 CNS에 항목을 얻을 수있는 여러 가지 미생물 지도자로있다수막염 (8)을 포함한 중증 질병에 g. CP 상피 세포에 침입 할 수있는 병원체의.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 전자 현미경을 수행해 주신 Hartwig Wolburg 교수에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12웰 플레이트 | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24웰 플레이트 | Starlab | CC7682-7524 | |
| 안티 Neisseria 수막염 &알파;-OMP | 이 항체는 H. Claus 박사와 U. Vogel 박사(University of Wü rzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (닭 토끼 방지) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (닭 토끼) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| 초콜릿 한천 플레이트 | Biomerieux | 43109 | |
| 사이토칼라신 D | 시그마 | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-글루트 + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-글루트 + 15 mM HEPES w/o 페놀레드 | Gibco | 11039-047 | |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마 | D2650 | |
| 태아 송아지 혈청 (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| 인슐린 | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| 프로테오스 펩톤 | BD | 211684 | |
| 무혈청 배지 | Gibco | 10902-096 | |
| 24웰 플레이트용 Thincert 세포 배양 인서트, 공극 크기 3 &마이크로; m | Greiner | 662630 | |
| 조직 배양 플라스크 75 cm² 레드 캡 멸균 | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 볼트-옴 미터 Millicell-ERS2 MERSSTX01 전극 | Millipore | MERSSTX00 |
참고문헌
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., So....
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