방법 논문

PGR - 블루 플라스미드와 골든 게이트 어셈블리를 사용하여 터미네이터의 신속한 확인

DOI:

10.3791/54064

⸱

2016년 4월 25일

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 Golden Gate Assembly와 plasmid pGR-blue를 사용하여 in silico에서 발견되는 터미네이터의 강도를 빠르게 정량화합니다.

초록

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이 프로토콜의 목표는 생물정보학적으로 식별된 종결자를 신속하게 검증할 수 있도록 하는 것입니다. 또한 플라스미드(pGR-Blue)는 이 프로토콜을 위해 특별히 설계되었으며 터미네이터 효율을 정량화할 수 있습니다. 개념 증명으로, 6개의 종결자가 마이코박테리오파지 Bernal13에서 생물정보학적으로 확인되었습니다. 일단 확인되면, 터미네이터는 적절한 끈적한 말단을 가진 올리고뉴클레오티드로 만들어지고 함께 어닐링되었습니다. 그런 다음 GGA(Golden Gate Assembly)를 사용하여 터미네이터를 pGR-Blue로 복제했습니다. 가시광선 아래에서 거짓 양성 콜로니는 파란색으로 나타나고 양성으로 변형된 콜로니는 흰색/노란색입니다. 아라비노스로 아라비노스 유도 프로모터(pBad)를 유도한 후, 생성된 적색 형광 단백질(RFP)에 대한 생성된 녹색 형광 단백질(GFP)의 비율을 측정하여 콜로니 강도를 결정할 수 있습니다. pGR-Blue를 사용하면 프로토콜이 3일 이내에 완료될 수 있으며 교육 환경에 이상적입니다. 또한, 결과는 이 프로토콜이 전사 조절과 관련된 터미네이터 효율의 인실리코(in silico) 예측을 이해하기 위한 수단으로 유용하다는 것을 보여줍니다.

서론

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대규모 합성생물학 프로젝트에서는 유전자 발현을 조절하는 데 도움이 되는 매우 효과적인 전사 종결 인자의 사용이 필요합니다. 새로운 종결 인자를 식별하려면 새로운 게놈의 생물 정보학적 분석이 필요합니다. 그러나 예측에 사용되는 고유한 알고리즘을 가진 생물정보학 소프트웨어의 양이 증가함에 따라 추정 결과 간에 더 많은 불일치가 발생합니다. 이 과정은 다소 주관적이고 인실리코(in silico)로 이루어지기 때문에 이러한 예측은 생물학적 확인이 필요합니다. 1 또한, 인실리코(in-silico) 분석을 통해 확인된 추정 종결자의 양은 비교적 짧은 시간 내에 완료할 수 있는 클로닝 전략을 사용해야 합니다.

PGR-Blue plasmid는 PGR plasmid의 변형체로, 하나의 micro-centrifuge tube에서 모든 반응 단계를 동시에 수행할 수 있도록 함으로써 클로닝 절차를 단순화하기 위해 GGA(Golden Gate Assembly)를 사용하도록 재설계되었습니다. 2,3 색상 선택은 양성 콜로니를 쉽게 식별할 수 있도록 플라스미드에 통합되었습니다. 성공적인 결찰은 가시광선에서 흰색/노란색이어야 하며 아라비노스를 포함하는 플레이트에서 자랄 때 파란색(450nm) 또는....

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프로토콜

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1. 설계와 적절한 스티커 엔드와 주문 올리고 뉴클레오티드

  1. 자유롭게 사용할 수 온라인 프로그램을 사용하여 게놈 분석을 통해 잠재적 인 RHO 독립 종결을 확인합니다. (7)
  2. 이중 가닥 DNA로 작업 할 때, 터미네이터의 방향 테스트 할 결정합니다. 7 PGR - 블루 플라스미드는 상단 (정 가닥)의 방향 '3'이 5 결찰 터미네이터를 확인합니다.
    1. , 무료 온라인 소프트웨어를 사용하여 PGR - 블루에서 테스트를 위해 원숭이를 예를 순서 방향을 재 그 반대로 보수로 바닥 (역) 가닥 터미네이터를 변환합니다.
  3. 방향이 정확한 것으로 결정되면, 상부 가닥 '말단 (5)에 접착 단부 "5'- CGAC-3' '를 추가한다. . 바닥 가닥의 끝 '이 5 끈끈한 끝 "5'-CCGC-3"'추가 (8)이 그 결찰 삽입 적절한 삽입됩니다 보장합니다방향 GGA를 사용하여.
  4. 서열이 결정되면, 상업적으로 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로 주문한다.

2. 어닐링 올리고 뉴클레오티드는 (동결 건조하는 DNA를 만 적용)

  1. 100 μM의 농도로 클레아 유리수 개별....

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결과

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이 프로토콜은 골든 게이트 조립 (그림 2)를 사용하여 GFP 및 RFP 사이에 결찰 터미네이터와 PGR - 블루를 포함하는 세포를 생성합니다. 결찰 삽입물을 함유하는 포지티브 콜로니 색에 기초하여 선택 될 수있다. 가시 광선에서 긍정적 인 식민지 / 흰색, 노란색되며 오탐 (false positive)은 37 ° C (그림 3)에서 배양의 18 ~ 20 시간 후 푸른 식민지를 생성합니다.

콜로니의 선택 후, 플레이트 리더 터미네이터 강도를 결정하는데 사용될 수있다. 개념의 증거로, 여섯 추정 터미네이터 (T1- 6)을 bioinformatically mycobacteriophage Bernal13에서 확인되었다. 도 4의 결과는 대조군으로 미가공 / 변성 PGR을 발현.......

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토론

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이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 순서에 적절한 올리고 뉴클레오티드 디자인 사전이다. 올리고 뉴클레오티드는 적합한 접착 말단은 GGA의 혼입이 가능하도록 상부 및 하부 두 가닥의 5 '말단에 추가한다. 또한, 오른쪽에 직면의 왼쪽에 직면 터미네이터 (하단 가닥에 전사를 중지 터미네이터)의 방향을 전환하는 것이 중요하다 GFP 및 RFP 발현이 직면 오른쪽에 있기 때문에 (위의 가닥을 터미네이터 (상단 가닥에 전사를 종료) ) 방향.

두 개의 분리 된 프로토콜 및 GGA 완충액 믹스는 PGR-블루 터미네이터를 테스트하는데 사용될 수있다. 표준 경제 믹스 개별적으로 다음 실험실 (8)에 혼합 재료 구입으로 구성되어 있습니다. 두 번째 프로토콜은 상업 미리 만들어진 GGA 마스터 믹스를 사용합니다. 모두 잘 작동하는 동안, 상업 마스터 믹스는 시간이 더 효율적이지만 표준 믹스에 비해 상대적으로 비싸다.교육 설정에서, 사전에 표준 GGA 믹스를 확인하고 .......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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유전체학 및 진화 과학을 전진 파지 사냥꾼 (SEA-파지) 프로그램 - 저자는 액티브 교육에 대한 게놈 컨소시엄 (GCAT)와 HHMI - 과학 교육 얼라이언스와 말콤 캠벨 토드 Eckdahl을 인정하고 싶습니다.

이 프로젝트는 연구 자원을위한 국립 센터 (P20RR016460)와 국립 보건원에서 일반 의료 과학 국립 연구소 (P20GM103429)에서 보조금에 의해 지원되었다. 이 연구는 부여 번호의 IIA-1457888 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 부분적으로 지원되었다. 또한 기관 (우아 치타 침례 대학) 기금은 JD 패터슨 여름 연구 활동을 통해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pGR-블루 플라스미드추가진68374
pGR-플라스미드추가진46002
AeraSeal-(멸균 시트)엑셀 사이언티픽BS-25멸균 시트만
10x T4 DNA 리가제 버퍼NEB
BsaI-HFNEBR3535S비-HF 효소는 작동하지만 열에 덜 안정적입니다. 
NEB 골든 게이트 어셈블리 믹스NEBE1600S프로토콜에서 언급되는 상용 마스터 믹스.
T4 DNA 리가제NEBM0202S
원형 마이크로 원심분리기 플로팅 랙Nova Tech InternationalF18875-6401
암피실린 나트륨 염시그마 알드리치A9518
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA-3256D-Arabinose는 pBAD 프로모터를 유도하지 않습니다.
Luria Base(LB) - 육수, MillerSigma AldrichL1900
루리아 베이스(LB) - 한천, 밀러시그마 알드리치L2025
Tecan-Infinite M200 플레이트 리더Tecan
Mix & Go Competent Cells - Strain JM109Zymo ResearchT3005회사 권장 변환 프로토콜 ApE
: 플라스미드 편집기-소프트웨어http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Molecular GradePromegaH5121
Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified)Fisher ChemicalS671
Comercial Oligonucleotidesynthesis Integrated DNA Technologies (IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile)Falcon35-3072
mycobacteriophage "Bernal13"GenebankKJ510413
Nuclease Free WaterIntegrated DNA Technologies (IDT)IDT004
sterile, L-shaped Hockey-Stick CellLife Science Products6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis 분광계Thermo Scientific2000c
ARNold: Rho 독립 전사 종결자 예측을 위한 웹 도구.
http://rna.igmors.u-psud.fr/

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability....

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재인쇄 및 허가

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태그

GFP RFP

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