방법 논문

PGR - 블루 플라스미드와 골든 게이트 어셈블리를 사용하여 터미네이터의 신속한 확인

DOI:

10.3791/54064

⸱

2016년 4월 25일

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 Golden Gate Assembly와 plasmid pGR-blue를 사용하여 in silico에서 발견되는 터미네이터의 강도를 빠르게 정량화합니다.

초록

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이 프로토콜의 목표는 생물정보학적으로 식별된 종결자를 신속하게 검증할 수 있도록 하는 것입니다. 또한 플라스미드(pGR-Blue)는 이 프로토콜을 위해 특별히 설계되었으며 터미네이터 효율을 정량화할 수 있습니다. 개념 증명으로, 6개의 종결자가 마이코박테리오파지 Bernal13에서 생물정보학적으로 확인되었습니다. 일단 확인되면, 터미네이터는 적절한 끈적한 말단을 가진 올리고뉴클레오티드로 만들어지고 함께 어닐링되었습니다. 그런 다음 GGA(Golden Gate Assembly)를 사용하여 터미네이터를 pGR-Blue로 복제했습니다. 가시광선 아래에서 거짓 양성 콜로니는 파란색으로 나타나고 양성으로 변형된 콜로니는 흰색/노란색입니다. 아라비노스로 아라비노스 유도 프로모터(pBad)를 유도한 후, 생성된 적색 형광 단백질(RFP)에 대한 생성된 녹색 형광 단백질(GFP)의 비율을 측정하여 콜로니 강도를 결정할 수 있습니다. pGR-Blue를 사용하면 프로토콜이 3일 이내에 완료될 수 있으며 교육 환경에 이상적입니다. 또한, 결과는 이 프로토콜이 전사 조절과 관련된 터미네이터 효율의 인실리코(in silico) 예측을 이해하기 위한 수단으로 유용하다는 것을 보여줍니다.

서론

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대규모 합성생물학 프로젝트에서는 유전자 발현을 조절하는 데 도움이 되는 매우 효과적인 전사 종결 인자의 사용이 필요합니다. 새로운 종결 인자를 식별하려면 새로운 게놈의 생물 정보학적 분석이 필요합니다. 그러나 예측에 사용되는 고유한 알고리즘을 가진 생물정보학 소프트웨어의 양이 증가함에 따라 추정 결과 간에 더 많은 불일치가 발생합니다. 이 과정은 다소 주관적이고 인실리코(in silico)로 이루어지기 때문에 이러한 예측은 생물학적 확인이 필요합니다. 1 또한, 인실리코(in-silico) 분석을 통해 확인된 추정 종결자의 양은 비교적 짧은 시간 내에 완료할 수 있는 클로닝 전략을 사용해야 합니다.

PGR-Blue plasmid는 PGR plasmid의 변형체로, 하나의 micro-centrifuge tube에서 모든 반응 단계를 동시에 수행할 수 있도록 함으로써 클로닝 절차를 단순화하기 위해 GGA(Golden Gate Assembly)를 사용하도록 재설계되었습니다. 2,3 색상 선택은 양성 콜로니를 쉽게 식별할 수 있도록 플라스미드에 통합되었습니다. 성공적인 결찰은 가시광선에서 흰색/노란색이어야 하며 아라비노스를 포함하는 플레이트에서 자랄 때 파란색(450nm) 또는 자외선(UV) 아래에서 형광 녹색이어야 합니다. 절단되지 않은 pGR-blue는 파란색 염색체 단백질(amilCP)을 포함하기 때문에 변형되지 않은 플라스미드를 포함하는 콜로니는 가시광선 아래에서 파란색입니다. 간소화된 프로토콜과 함께 이러한 단순화를 통해 연구원들은 3-4일 만에 생물정보학적 식별에서 생물학적 확인까지 진행할 수 있습니다. 이 시스템의 설계 특성은 연구실과 교육 환경 모두에서 유용할 수 있습니다.

pGR-Blue 플라스미드는 종결자 강도를 정량화할 수 있습니다. 4 단일 아라비노스 유도성 프로모터는 녹색 형광 단백질(GFP)과 적색 형광 단백질(RFP)을 생산하는 데 사용됩니다. 터미네이터는 GFP 염기서열 이후 RFP 염기서열 이전에 플라스미드로 클로닝되어 RFP 단백질의 전사를 중단합니다. 터미네이터의 강도는 생산된 RFP에 대한 생산된 GFP의 비율에 의해 결정됩니다.

비전과 변화5 보고서는 과학, 기술, 공학 및 수학(STEM) 교육이 연구 기반 경험을 교실에 통합한다고 제안했습니다. 6 그러나 이를 위해서는 제한된 기술을 가진 학생들이 정의된 시간 내에 수행할 수 있는 프로토콜의 개발이 필요합니다. 프로토콜은 최소 3일 만에 완료할 수 있지만, 각 주요 단계를 별도의 주간(2-3시간) 랩 기간에 수행하여 CRE(Course Research Experience)를 생성할 수 있도록 설계되었습니다. 이러한 방식으로 사용하면 절차는 3주에서 6주 정도 소요되며 유전학, 세포 생물학 또는 생물 정보학의 입문 및 고급 과정 모두에 적합합니다.

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프로토콜

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1. 설계와 적절한 스티커 엔드와 주문 올리고 뉴클레오티드

  1. 자유롭게 사용할 수 온라인 프로그램을 사용하여 게놈 분석을 통해 잠재적 인 RHO 독립 종결을 확인합니다. (7)
  2. 이중 가닥 DNA로 작업 할 때, 터미네이터의 방향 테스트 할 결정합니다. 7 PGR - 블루 플라스미드는 상단 (정 가닥)의 방향 '3'이 5 결찰 터미네이터를 확인합니다.
    1. , 무료 온라인 소프트웨어를 사용하여 PGR - 블루에서 테스트를 위해 원숭이를 예를 순서 방향을 재 그 반대로 보수로 바닥 (역) 가닥 터미네이터를 변환합니다.
  3. 방향이 정확한 것으로 결정되면, 상부 가닥 '말단 (5)에 접착 단부 "5'- CGAC-3' '를 추가한다. . 바닥 가닥의 끝 '이 5 끈끈한 끝 "5'-CCGC-3"'추가 (8)이 그 결찰 삽입 적절한 삽입됩니다 보장합니다방향 GGA를 사용하여.
  4. 서열이 결정되면, 상업적으로 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로 주문한다.

2. 어닐링 올리고 뉴클레오티드는 (동결 건조하는 DNA를 만 적용)

  1. 100 μM의 농도로 클레아 유리수 개별 올리고 다시 중단.
  2. 1 M의 NaCl 100 mM 트리스 - 염산 pH가 7.4 : 10 배 어닐링 버퍼를 확인합니다. 어닐링 버퍼 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 어닐링 버퍼로 이루어지고, 올리고 뉴클레오티드는 다시 중단되면, 어닐링 8 시작한다.
  3. 각 테스트가 종료 될 때까지, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 초순수의 16 μL를 추가한다.
  4. 각 microcentrifuge 관에 10 배 어닐링 버퍼 2 μl를 추가합니다.
  5. 원하는 터미네이터에서 상단 가닥 올리고 뉴클레오티드의 1 μL (100 μM)를 추가합니다.
  6. 원하는 터미네이터에서 바닥 가닥 올리고 뉴클레오티드의 1 μL (100 μM)를 추가합니다.
  7. 끓는 물 바 만들기핫 플레이트 수돗물 장소 약 400ml를 함유하는 1000 ml의 비이커를 사용 번째.
  8. 부동의 단계 2.6에서의 microcentrifuge 튜브를 넣고 4 분간 끓인다. 4 분 후, 열판을 해제하지만, 튜브를 남겨 수조 천천히 차가운 O / N (18 시간) 8 로트. -20 ° C에서 열처리 터미네이터를 저장합니다.

3. 골든 게이트 총회 (표준 믹스 - 비용 효율적인)

  1. 어닐링 터미네이터의 40 nM의 희석을 확인합니다. 어닐링 터미네이터 믹스 (100 μM) 1 μL에 뉴 클레아없는 물 124 μl를 추가합니다.
    1. 얼음에 30 만 XG에 초 및 저장을위한 원심 분리기 샘플.
  2. 열 순환기에 대한 새로운 튜브의 적절한 사용되는로, 클레아없는 물 6 μl를 추가합니다.
  3. 1 상업 DNA 리가 버퍼의 μL [300 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.7-7.8), 100 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 DTT, 10 mM의 ATP]를 추가합니다. 얼음에 모든 후속 단계를 수행합니다.
  4. 더하다PGR - 블루 (35-50 NG / μL)에 microcentrifuge 관에 대상 플라스미드의 1 μL.
  5. microcentrifuge 관에 40 nM의 어닐링 터미네이터 1 μl를 추가합니다.
  6. microcentrifuge 관에 0.5 μL 상업 고성능 BsaI의 제한 효소를 추가합니다.
  7. microcentrifuge 관에 상업 DNA 리가 아제의 0.5 μl를 추가합니다.
  8. 120 초 동안 10,000 × g으로 반응 혼합물을 원심 분리기. 그런 다음 열 순환기에 직접 튜브를 배치합니다.
  9. 37 ° C에서 15 분의 1주기 다음 16 ℃에서 1 분 뒤에 37 ° C에서 1 분 20주기, 상기 열 순환기 프로그램을 실행합니다. 사용 샘플을 즉시 또는 -20 ° C에서 동결 및 저장. (8)

4. 골든 게이트 총회 (상용 마스터 믹스 - 시간 효율적인)

  1. 이 40 nM의에 터미네이터 DNA 농도를 희석 2 단계에서 만든 터미네이터를 어​​닐링 100 μM의 1 μL에 뉴 클레아없는 물 124 μl를 추가합니다.새로운에서이 단계를 수행, 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 표시.
  2. 열 순환기에 대한 새로운 튜브 적절한로, 클레아 무료 물을 14 μl를 추가합니다. 새로운 튜브를 따라 표시되어 있는지 확인합니다.
  3. microcentrifuge 관에 상용 마스터 믹스 버퍼 2 μl를 추가합니다.
  4. microcentrifuge 관에 PGR - 블루 플라스미드의 1 μL (35-50 NG / μL)를 추가합니다.
  5. microcentrifuge 관에 40 nM의 어닐링 터미네이터 2 μl를 추가합니다.
  6. microcentrifuge 관에 상업 마스터 믹스 1 μl를 추가합니다.
  7. 120 초 동안 10,000 XG에 40 나노 튜브를 원심 분리기. 그런 다음 열 순환기에 직접 튜브를 배치합니다.
  8. 55 ° C에서 15 분의 1주기 다음 37 ° C에서 60 분의 1주기 다음 열 순환기 프로그램을 실행합니다. 사용 샘플 -20 ° C에서 즉시 또는 동결 및 저장.

5. 변환 및 식민지 선택

  1. 준비 1 ㎜의 정광을 포함하는 페트리 접시 한천 루리아 자료 (LB)암피실린의 이온 (앰프) 및 ​​아라비 노스 (ARB)의 10 mM의 농도. 이 스톡 용액은 이후 단계에서 사용되기 때문에 1 M의 L -arabinose 원액의 적어도 10 ㎖를 준비한다.
  2. 어떤 높은 효율적인 사용 (8월 10일부터 9월 10일까지 형질 전환 / μg의)를 화학적으로 유능한 E. 형질 전환 대장균 (JM109) 세포. 최상의 결과를 얻으 9 유능한 세포의 50 μL에 연결 반응의 3-5 μl를 추가합니다. 화학적 적격 세포를 사용하는 경우, 세포가 사용되는 특정 변환 프로토콜을 따른다.
  3. 멸균 L 자형 "하키 스틱"을 사용하여 판 한천 미리 예열 LB (앰프 / ARB)에 형질 전환 세포의 절반 (25 μl를) 확산 및 37 ° C에서 O / N을 품어. 때문에 분해의 암피실린의 빠른 속도로 24 시간 동안 37 ° C에서 부화하지 않습니다.
  4. 육안 검사에 의해 색상에 따라 식민지 선택을 수행합니다. 성공적인 내고는 / 흰색 가시 광선에 노란색하고 운데 녹색 형광한다R 블루 (450 ㎚) 또는 자외선. 20 시간 - 실패 결찰 (18) 후 가시 광선 아래에서 색 파란색 식민지를 생성합니다.

6. 확인과 터미네이터의 정량화

  1. 1 ㎜의 암피실린 및 아라비 노스 10 mm의 5 ml의 멸균 LB-국물 튜브를 준비합니다. 필요한 튜브의 수는 테스트되는 터미네이터 플러스 컨트롤 (셀 암피실린 내성과 형광 않으며 미가공 PGR 블루 플라스미드를 함유하는 세포)의 수에 의존한다.
  2. 가시 광선에서 멸균 루프를 사용하여 2-3 흰색 / 노란색 식민지 (단계 5.4)을 선택합니다. 샘플은 37 ° C 및 16 ~ 18 시간 동안 160 rpm으로 진탕에 국물에 품어 할 수 있습니다. 이상 24 시간 동안이 샘플을 품어하지 마십시오.
    1. 선택적으로, 적당한 세포의 성장을 보장하기 위해 600 nm의 (OD 600)에서 광 세포 밀도를 결정하는 분광 광도계를 사용한다. 일반적으로, 0.8 ~ 600의 OD 성장의 16 ~ 18 시간 후에 관찰되었다.
  3. 용도나머지 단계에 대한 멸균 96 웰 플레이트. 무균 환경에서와 세중에서 다음 단계를 실시한다. 물론 각 멸균 LB + 앰프 / 아라비 노스 국물 (1 MM의 암피실린 / 10 MM의 아라비 노스)의 199 μl를 추가합니다. 세 개의 개별 컨트롤의 접시에 방을 포함합니다.
    1. 다음과 같은 세 가지 컨트롤을 사용하여 잘 (1)를 포함하는 LB + 앰프 / 아라비 노스 국물 만 잘 (2) (공백) 변환되지 않은 유능한 세포는 빈 역할을 위해. 정량 (3) 종결 강도 비 종결 서열에 결찰 미가공 원래 PGR 또는 함유 PGR 블루를 함유하는 세포 (정량 기준 제어)을 포함한다. 플레이트 리더 레이아웃 그림 1을 참조하십시오.
  4. 피펫 오에서 세포 용액을 1 μL / 96- 웰 플레이트의 각각의 웰에 N 브로스.
  5. 통기성 커​​버 인감 접시와 37 ° C에서 18 ~ 20 시간, 160 rpm으로 흔들어.
  6. 플레이트 리더를 사용하여 읽어 OD (600)를 결정600 nm에서의 흡광도. 다음과 같이 GFP의 형광을 측정 : 여자 (395) 및 배출 (509) 측정 RFP 형광을 다음과 같이 여자 (575) 및 배출 (605)을 18 ~ 20 시간 후, OD (600)는 약 0.5이어야한다.
  7. 성장에 변화를 정상화하려면 방정식을 사용 : figure-protocol-1 GFP 및 RFP 모두.
  8. 정규화 한 후, 수학 식을 이용하여 상대 터미네이터 강도를 결정 figure-protocol-2

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결과

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이 프로토콜은 골든 게이트 조립 (그림 2)를 사용하여 GFP 및 RFP 사이에 결찰 터미네이터와 PGR - 블루를 포함하는 세포를 생성합니다. 결찰 삽입물을 함유하는 포지티브 콜로니 색에 기초하여 선택 될 수있다. 가시 광선에서 긍정적 인 식민지 / 흰색, 노란색되며 오탐 (false positive)은 37 ° C (그림 3)에서 배양의 18 ~ 20 시간 후 푸른 식민지를 생성합니다.

콜로니의 선택 후, 플레이트 리더 터미네이터 강도를 결정하는데 사용될 수있다. 개념의 증거로, 여섯 추정 터미네이터 (T1- 6)을 bioinformatically mycobacteriophage Bernal13에서 확인되었다. 도 4의 결과는 대조군으로 미가공 / 변성 PGR을 발현...

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토론

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이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 순서에 적절한 올리고 뉴클레오티드 디자인 사전이다. 올리고 뉴클레오티드는 적합한 접착 말단은 GGA의 혼입이 가능하도록 상부 및 하부 두 가닥의 5 '말단에 추가한다. 또한, 오른쪽에 직면의 왼쪽에 직면 터미네이터 (하단 가닥에 전사를 중지 터미네이터)의 방향을 전환하는 것이 중요하다 GFP 및 RFP 발현이 직면 오른쪽에 있기 때문에 (위의 가닥을 터미네이터 (상단 가닥에 전사를 종료) ) 방향.

두 개의 분리 된 프로토콜 및 GGA 완충액 믹스는 PGR-블루 터미네이터를 테스트하는데 사용될 수있다. 표준 경제 믹스 개별적으로 다음 실험실 (8)에 혼합 재료 구입으로 구성되어 있습니다. 두 번째 프로토콜은 상업 미리 만들어진 GGA 마스터 믹스를 사용합니다. 모두 잘 작동하는 동안, 상업 마스터 믹스는 시간이 더 효율적이지만 표준 믹스에 비해 상대적으로 비싸다.교육 설정에서, 사전에 표준 GGA 믹스를 확인하고 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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유전체학 및 진화 과학을 전진 파지 사냥꾼 (SEA-파지) 프로그램 - 저자는 액티브 교육에 대한 게놈 컨소시엄 (GCAT)와 HHMI - 과학 교육 얼라이언스와 말콤 캠벨 토드 Eckdahl을 인정하고 싶습니다.

이 프로젝트는 연구 자원을위한 국립 센터 (P20RR016460)와 국립 보건원에서 일반 의료 과학 국립 연구소 (P20GM103429)에서 보조금에 의해 지원되었다. 이 연구는 부여 번호의 IIA-1457888 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 부분적으로 지원되었다. 또한 기관 (우아 치타 침례 대학) 기금은 JD 패터슨 여름 연구 활동을 통해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pGR-블루 플라스미드추가진68374
pGR-플라스미드추가진46002
AeraSeal-(멸균 시트)엑셀 사이언티픽BS-25멸균 시트만
10x T4 DNA 리가제 버퍼NEB
BsaI-HFNEBR3535S비-HF 효소는 작동하지만 열에 덜 안정적입니다. 
NEB 골든 게이트 어셈블리 믹스NEBE1600S프로토콜에서 언급되는 상용 마스터 믹스.
T4 DNA 리가제NEBM0202S
원형 마이크로 원심분리기 플로팅 랙Nova Tech InternationalF18875-6401
암피실린 나트륨 염시그마 알드리치A9518
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA-3256D-Arabinose는 pBAD 프로모터를 유도하지 않습니다.
Luria Base(LB) - 육수, MillerSigma AldrichL1900
루리아 베이스(LB) - 한천, 밀러시그마 알드리치L2025
Tecan-Infinite M200 플레이트 리더Tecan
Mix & Go Competent Cells - Strain JM109Zymo ResearchT3005회사 권장 변환 프로토콜 ApE
: 플라스미드 편집기-소프트웨어http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Molecular GradePromegaH5121
Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified)Fisher ChemicalS671
Comercial Oligonucleotidesynthesis Integrated DNA Technologies (IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile)Falcon35-3072
mycobacteriophage "Bernal13"GenebankKJ510413
Nuclease Free WaterIntegrated DNA Technologies (IDT)IDT004
sterile, L-shaped Hockey-Stick CellLife Science Products6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis 분광계Thermo Scientific2000c
ARNold: Rho 독립 전사 종결자 예측을 위한 웹 도구.
http://rna.igmors.u-psud.fr/

참고문헌

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