방법 논문

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

DOI:

10.3791/54077

⸱

2016년 7월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

이 논문에서

요약

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미니피그의 활액과 골수에서 분리하고 주사기 흡인을 사용하여 비침습적으로 채취한 중간엽 줄기세포(MSC)를 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 세포 표현형분석은 세포 분리 후 유세포 분석을 사용하여 수행되었으며 MSC에서 유래한 골수 및 활액의 체외 배양을 수행했습니다.

초록

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중간엽 줄기세포(MSC)는 골수 및 활액을 포함한 다양한 조직 공급원에서 분리한 후 확립되었습니다. 최근에는 활액 유래 MSC가 다중 계통 분화 가능성과 면역 조절 기능을 가지고 있는 것으로 보고되었으며, 이는 이러한 세포가 조직 공학 및 전신 치료에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 연구는 세포 표현형 분석 및 체외 배양을 위한 세포 표면 마커를 분석하기 위해 미니돼지의 골수 및 활액에서 유래한 MSC의 간단하고 비침습적인 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 성적으로 성숙한 6개월 된 미니피그를 사용하여 골수 추출기를 사용하여 장골능 뼈에서 골수를 추출하고 대퇴골 관절에서 활액을 흡인했습니다. 두 출처에서 샘플을 수집하는 절차는 비침습적이었습니다. 수확된 세포 공급원에서 MSC를 효과적으로 분리하고 미니피그에서 안정적인 MSC를 확장하기 위한 체외 배양 조건을 만들고 전신 자가 처리법을 적용하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 세포 표현형 분석을 위해 두 세포의 세포 표면 마커를 유세포 분석을 사용하여 분석했습니다. 그 결과, MSC는 미니돼지의 활액에서 분리되었으며 활액 유래 MSC가 골수 유래 MSC와 유사한 형태 및 세포 표현형을 가지고 있음을 보여주었습니다. 따라서 비침습적으로 얻은 활액은 MSC의 귀중한 공급원입니다.

서론

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다분화능 중간엽 줄기세포(MSC)는 중간엽 세포 계통으로 분류할 수 있으며, MSC는 골수, 탯줄, 태반, 지방 조직, 피부 피부, 골격근, 모낭, 활액막 및 치아1-5와 같은 다양한 조직 공급원에서 확립 및 분리되었습니다. 현재 활막 유래 MSC는 뼈 분획, 골관절염 및 류마티스 관절염(RA)과 같은 관절 질환 치료에 도움이 될 수 있으며, 손상된 연골이나 뼈에서 MSC의 재생 잠재력으로 인해 면역 조절 또는 자가면역 질환 치료에도 도움이 될 수 있기 때문에 현재 활막 유래 MSC에 주목하고 있습니다6-8. 활액 공급원에서 유래한 MSC에 대한 대부분의 연구는 활액이 아닌 활액막에서 MSC를 사용했습니다2,9; 따라서 활액 유래 MSC에 대한 생물학적 이해는 제한적입니다.

활액은 쉽게 접근할 수 있는 MSC 공급원으로, 환자의 진단 또는 치료 중에, 그리고 골관절염이나 RA와 같은 침습적 시술이 필요하지 않은 다양한 관절염 상태의 진단 확인 중에 흡인할 수 있습니다. 활액강에서 활액 유래 MSC의 개체군은 관절염 환자가 없는 환자에 비해 관절염 환자에서 유의하게 증가한다10-12. 따라서 활액은 MSC에 대한 훌륭한 공급원 후보이며, 특히 관절에 염증이 있거나 손상된 환자의 자가 줄기 세포 치료에 적합합니다. 또한 활액 유래 MSC는 연골형성 능력, 면역조절 능력 및 높은 증식 속도를 가지고 있습니다. 이 연구는 비침습적 방법을 사용하여 미니돼지에서 골수 추출 및 활액 흡인과 분리된 세포의 체외 확장 및 세포 표현형 분석을 위한 프로토콜을 수립했습니다.

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프로토콜

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동물 실험은 경상 대학교에서 생물 의학 실험을위한 동물 센터에 의해 승인되었다.

동물 절차 1. 준비

  1. 골수 및 활액에서 중간 엽 줄기 세포의 비 침습적 수집 성인에게 여성 minipigs를 준비합니다. 마취 및 샘플 컬렉션에 일일 전에 minipigs의 임상 검사를 수행합니다.
    1. 완전한 혈액 카운트 테스트를 사용하여 체온, 호흡 및 심장 박동, 그리고 돼지의 행동 및 혈액 학적 상태의 관찰을 포함 신체 검사, 임상 적 정상적인 동물을 제공합니다.
      참고 : 임상 적으로 건강한 minipigs에 대한 매개 변수 간격은 11입니다 - 호흡 속도 29 / 분, 68 - 심박수 98 / 분, 37 - 체온 38 ° C.
  2. 12 시간 프리 오 - (6)의 수술 전 금식 기간 동안 케이지에서 모든 식용 침구를 제거젊은 성인 minipigs을위한 마취 관리에 r은 금식의 3 시간은 신생아 관찰해야한다. 마취 시간까지 식수 제공합니다.

마취에 대한 동물의 2. 준비

  1. 아세 프로 마진 (0.1 ㎎ / ㎏), 메데 토미 (0.03 ㎎ / ㎏) 및 아트로핀 (0.04 ㎎ / ㎏)으로 마취의 투여 전에 minipigs을 의료를 베풀다.
    1. 성인 minipigs 적어도 30mm 길이의 21 G 바늘을 사용하는 약물의 모든 근육 내 (IM)를 주입한다. 측면 자궁 근육이나 허벅지 근육에 IM 주입을 귀 뒤에 1-3cm를 수행합니다.
      참고 : 동물의 두려움이나 스트레스를 유도하거나 안전하게 전 처치를 주입 거친 취급을 필요로하지 않고 모든 절차를 수행합니다.
  2. 지느러미 - 누운 위치에 minipigs를 놓습니다.
  3. 다섯 분 전 처치의 투여 후, 1.5 % 이소 플루 란 관리자를 사용하여 마취를 시작흡입을 통해 istered.
    1. 산소를 캐리어 가스로 2.5 %의 농도가 증가 하였다 기관 내 튜브를 통해 이소 플루 란 (1.5 %)의 흡입, (1.5 L / 분)을 계속한다.
  4. 계속 마취 동안 minipigs의 심박수, 체온, 경피 혈중 산소 포화도 (SPO 2)를 모니터링한다. 체온을 유지하기 위해 39 °의 C - (38)의 온도에서 순환 블랭킷을 사용한다. 마취 동안 건조로부터 눈을 보호하기 위해 안과 연고를 적용합니다.
  5. 마취 (13)의 깊이를 평가하는 Guedel의 분류를 따르십시오.

세포 분리 및 배양 3. 준비

  1. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 고급 둘 베코 변성 이글 배지 (ADMEM), 1 % 루타 500 ㎖, 염기성 섬유 아세포 성장 사실상에게 10ng의 / ㎖을 제조 골수 및 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포를 배양하는 방법R (bFGF를), 1.0 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (각각 10,000 IU 10,000 μg의의 / ㎖, 펜 연쇄상 구균).
    1. 공동 인큐베이터 내에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 3,850 ℃에서 ADMEM 부화.
  2. 세포의 분리 및 세척은 제조업체의 지시에 따라 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 500ml의 준비.

4. Minipigs에서 골수를 수집

  1. 지역 장골의 문장 (그림 1)의 크기는 약 15 X 15cm를 선택하고 살균 면도기 나 전기 면도기를 사용하여이 영역에서 머리를 제거합니다. 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올 다음 미니 피그가 위치되면, 교대 순서 사이트를 다음 멸균 제 3 회 문질러. 영역이 완전히 건조 후, 멸균 커튼을 적용합니다.
  2. 프리 코트 (3)으로 세정하여 헤파린 100 U / ㎖로 10 ML의 주사기 - ejec 전에 헤파린의 4 ml의팅 항 응집제.
    참고 : 골수 흡인 동안 주사기에 응고를 방지하기 위해이 단계를 수행합니다.
  3. 단단히 헤파린 미리 코팅 된 10 ML의 주사기에 부착 된 골수 추출기 (3.0 × 100mm)를 사용하여, 마취에서 미니 피그의 장골 뼈에서 골수 5 ㎖의 최소한의 압축을 풉니 다.

뼈 골수로부터 체외 배양에서 추출 된 세포의 5. 분리

  1. 추출 된 골수로부터 세포를 분리.
    1. 실온에서 15ml의 원뿔형 튜브 DPBS 같은 부피로 추출한 골수 희석.
    2. 15 ML 원뿔 튜브 밀도 원심 분리 미디어 (피콜 - 페이크)의 3 ML을 추가합니다.
    3. 실온에서 40 분 동안 400 × g에서 4 mL를 혼합하지 않고 밀도 원심 매체에 배치 DPBS 함께 골수의 층, 및 원심 분리기를 희석.
    4. 단핵 세포 층 수확플라즈마 (상층)과 밀도 원심 분리 매체 (바닥 층)을 포함하는 두 층 사이에 버피 코트로부터 (다국적)과, 15ml의 원뿔형 튜브에 다국적 옮긴다.
    5. 7 전사 다국적 희석 - DPBS 8 ml를 실온에서 10 분 동안 500 × g에서 원심 분리하여 그들을. 뜨는을 취소하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
    6. ADMEM 2 ㎖의 세포 펠렛을 일시 중단하고, 35mm 조직 배양 접시에 옮긴다. 5 % CO 2의 가습 분위기에서 38.5 ° C에서 배양 접시를 품어.
  2. 골수에서 분리 한 세포의 체외 배양합니다.
    1. 48 시간 후, 접시에 부착되지 않은 세포와 배지를 흡인하고 ADMEM 2 ㎖를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C로하여 배양한다. 세 번째마다 일 매체를 변경합니다.
    2. 70 - 80 % 컨 플루 0.25 % 1 ㎖ 그들을 해리, DPBS로 세포를 씻어세포가 분리 될 때까지 5 분 - 트립신 / EDTA, 그리고 (3) 37 ℃에서이를 부화.
    3. ADMEM 10 ㎖를 사용하여 세포를 수확 15 ml의 원추형 튜브로 전송하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 그들을. 상층 액을 버린다.
    4. 신선한 ADMEM 1 ㎖에 수확 된 세포를 일시 중단하고 혈구를 사용하여 계산합니다.
    5. 5의 셀 배치 - ADMEM 4 mL를 함유 7.5 × 105 / 25T 플라스크 및 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C에서 그들을 부화. 세 번째마다 일 매체를 변경합니다.

Minipigs에서 유체 활액의 6. 컬렉션

  1. 골수 흡인하는 절차와 유사하게, 대퇴 관절을 통해 약 15 X 10cm (길이 / 폭)의 적절한 영역을 선택하고 살균 면도기 나 전기 면도기를 사용하여 머리를 제거, 살균 절차 (단계 4.1)에 의해 수행합니다.
  2. 23 G와 3 ML의 주사기를 삽입촉진 랜드 마크 (슬개골 및 경골 크레스트) 후 관절에 바늘.
    1. 관절의 활액의 흡입 용 주사기에 부드러운 흡입을 적용합니다. 1 ㎖, 그러나 이것은 미니 피그 또는 관절의 크기에 따라 변화 - 관절 활액에서 수집의 대략 부피는 0.5이다. 활액의 회수 용적이 너무 작 으면 활막 캐비티 DPBS 통해 세척.
    2. 즉시 혈액 오염을 방지하기 위해 주사기를 철회.

수집 된 활액에서와 체외 재배 7. 세포 분리

  1. 흡입 된 활액에서 세포를 분리.
    1. 실온에서 15ml의 원뿔형 튜브 DPBS 같은 부피로 흡입 활액 희석.
    2. 파편을 제거하기 위해, 40 ㎛의 나일론 세포 여과기를 사용하여 희석 활액 필터.
    3. 필터링 된 활액을 포함하는 튜브에 DPBS 10 mL를 추가액을 실온에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리하여. 뜨는을 취소하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
    4. 2의 셀을 배치 ADMEM 2 ㎖의 세포 펠렛을 일시 - ADMEM 2 ㎖로 3 × 105 세포 / 35mm 조직 배양 접시에, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C에서 그들을 부화 .
  2. 격리 된 활액 - 유래 중간 엽 줄기 세포의 체외 배양 단계를 반복 5.2.

Minipigs 8. 이후 절차 케어

  1. 필요한 경우, 골수 컬렉션 후, 피부 스테이플러를 사용하여 하나의 봉합사와 골수 추출기 주사 부위 피부를 닫는다.
  2. 절차가 완료된 후 3 일 동안 하루에 한번 minipigs enrofloxacin (5 ㎎ / ㎏) 및 멜 록시 캄 (0.2 밀리그램 / kg)을 근육 주사를 투여.
  3. 절차가 완료된 후, 골수 및 활액 수집 사이트 소독0.1 % 포비돈 요오드 번 3 일간 하루에. 조심스럽게 합병증의 징후 (예를 들어, 부종, 고름, 또는 적색)를 모니터링 매일 관찰한다.

유동 세포 계측법을 사용하여 9 셀 표현형

  1. 유로 (3) 80 % 합류 - - 5, DPBS로 세포를 씻어 0.25 % (v / v)의 트립신 / EDTA 1 ml의 그들을 대하는 중간 엽 줄기 세포는 70 때. 세포가 분리 될 때까지 5 분 - 그럼, 3, 37 ° C에서 그들을 품어.
  2. DPBS 10 ㎖를 사용하여 세포를 수확 15 ml의 원추형 튜브로 전송하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 그들을. 상등액을 버리고.
  3. 세포를 해결하려면, 3.7 %의 포름 알데히드 용액 10 ㎖의 세포 펠렛을 중단하고 분석하기 전에 하루 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
    1. 어느 날 고정 후, DPBS 두 번 5 분마다 300 × g에서 원심 분리를 이용하여 세포를 씻는다. 상등액을 버리고.
    2. 4 ㎖ 중의 세포 펠렛을 정지1 % 소 혈청 알부민 (/ V w) (BSA)을 첨가하고, 비특이적 된 Fc 매개의 상호 작용을 차단하는 4 ° C에서 1 시간 동안 펠렛을 부화되어 DPBS의.
    3. 1.5 ml의 튜브에 세포 현탁액 500 ㎕를 분취를 배포합니다.
    4. 비공 항체 (CD29 및 멘틴)의 경우, 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 세포를 세척 하였다. 상등액을 버리고.
    5. 1의 500 μL의 세포 펠렛 일시 : 차 항체의 100 희석 4 ° C에서 1 시간 동안 그것을 품어.
    6. 각 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 1 % 소 혈청 알부민 회 세포를 세척 하였다. 상등액을 버리고.
    7. 차 항체를 π 공역 계 플루 오레 신 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 희석 4 ° C에서 어둠 속에서 1 시간을 품어 : 1의 500 μL의 세포 펠렛을 일시 중단합니다.
  4. FITC - 복합 항체 (이소, CD34, CD44 및 CD45)의 경우, centrifu로 세포를 씻어3 분 동안 300 × g에서 gation. 상등액을 버리고.
    1. 1 500 μL의 세포 펠렛을 일시 중단 : 100 FITC - 복합 항체를 4 ℃에서 어둠 속에서 1 시간을 품어.
    2. 모두 염색 조건 5 분마다 300 × g에서 원심 분리에 의해 DPBS 두 번 세포를 씻어. 상등액을 버리고.
    3. , DPBS 500 μL의 세포를 일시에 5 mL의 둥근 바닥 튜브로 전송하고, 8 플로우 사이토 미터를 사용하여 결과를 분석한다.

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결과

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뼈 골수 및 Minipigs의 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포의 수립

중간 엽 줄기 세포가 성공적으로 (도 2) 골수 및 minipigs의 관절 활액 관절로부터 단리 및 시험 관내에서 확장시켰다. 활액 주사기 흡입은 ​​간단하고, 일차 세포의 체외 배양시에 충분한 부착 성 세포를 얻을 수있다. 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 형태는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 - 유사하고, 모두 중간 엽 줄기 세포가 섬유 아세포 스핀들 형상을 균일하게 부착된다. 세번째 계대 배양 종료 후 그들은, 알칼리 포스파타제 (AP) 염색 양성 발현이 관찰되었다.

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토론

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Minipigs 골수 및 활액에서 중간 엽 줄기 세포의 분리를 확립하는데 사용 하였다. 연령, 성별, 질환 등 다양한 생리 학적 조건을 제거하기 위해, 동종 배경 기증자 minipigs 정확하게 셀 소스 의존 특성을 평가하기 위해 선택되었다. 피그 것으로 알려진 해부학 적, 생리 학적 및 유전자 인간과 유사한 것으로, 특히 크기가 일치 장기를 생산할 수 minipigs; 따라서 이들은 이종 14,15 대용 도너 종으로서 사용할 수있다. 돼지와 사람에서 중간 엽 줄기 세포는 동일한 IDO이 있지만 MSC들, indoleamine 2,3- 디옥 시게나 제 (IDO) 및 산화 질소 합성 효소 (NOS)의 최근 제안 면역 속성에 관해서는, 종 - 특이 면역 억제를 중재하는 중간 엽 줄기 세포로 사용했다 (9) . 따라서, 중간 엽 줄기 세포 기증자로 돼지 모델은 인간의 치료를위한 중간 엽 줄기 세포의 면역 반응의 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 돼지 줄기 연구세포는 시험관 ...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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차세대 BioGreen 21 프로그램(No. PJ007969), 농촌개발청(Rural Development Administration) 및 국립연구재단(National Research Foundation, 보조금 번호. NRF-2015R1D1A1A01056639)에 의해 채택되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고급 Dulbecco' s 변형된 독수리 배지 (ADMEM)Gibco12491-023MSC 배양 배지
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)Gibco14190-144세포 세척 배지, Ca2+/Mg2+
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000-044MSC 배지
GlutamaxGibco35050-061MSC 배지
페니실린/스트렙토마이신Gibco10378-016MSC 배지 구성 요소
기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)SimgaF0291MSCs 중간
소 혈청 알부민 (BSA)요소SigmaA6003MSCs 중간 구성
요소 Trypsin-EDTAGibco25200-072세포 해리 시약 
β-메르캅토에탄올SigmaM7522MSC의 구성 요소
매체 이소타입 항체BD PharmingenBD 550616Isotype Control
CD29 항체BD PharmingenBD552369 Integrin beta-1 MSC 마커
CD44 항체BD PharmingenBD 553133세포 표면 당단백질 MSC 마커
CD45 항체BD PharmingenBD 340664조혈 줄기 세포 마커
CD34 항체BD PharmingenBD 555821조혈 줄기 세포 마커
CD90 항체BD PharmingenBD 555595Thy-1 막 당 단백질 MSC 마커
MHC 클래스 II 항체Santa CruzSC-32247항원 제시 세포 마커
Vimentin 항체Sigma Sigma-S6389유형 III 중간 필라멘트 MSC 마커
알칼리성 인산가수분해효소PromegaS38415-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)
의 혼합물Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02밀도 구배 원심분리
세포 여과BD Falcon35234040 µ m 나일론 세포 여과기
15ml 폴리스티렌 원추형 튜브BD Falcon351095샘플 수집 및 세포 분리
35mm 접시Nunc153066세포 배양 접시
골수 추출기GmbH Medizintechnologie, Germany1145-1W010TrokaBone, 3.0 x 100 mm
HematocritchamberMarinfeld640130세포 계수 챔버
아트로핀제일제약, 한국아트로핀, 황산염, 하이드레이트
, 아세프로마진,사무, 메디안, 한국제 및 항구토
메데토미딘화이자마취제 및 진
엔로플록사신바이엘 헬스케어, 독일항생제,
멜록시캠수의학, 항염증 및 진
IsofluraneHana pharm, 한국흡입 마취제
포비돈 요오드 한국 제약, 한국살균제
에탄올시그마E7023살균제
헤파린시그마H3393항응고제
포름알데히드시그마F8775세포 고정제
안과 연고 화이자옥시테트라사이클린 HCl과 폴리믹신 B 황산염
순환수 담요Gaymar 산업마취 중 및 마취 후 온난화 시스템
피부 스테이플러Covidien, 미국봉합사 피부 폐쇄
CO2 인큐베이터Thermo Forma3111세포 배양 장비
유세포 분석기BD Biosciences세포 분석기
MinipigPWG Genetics Korea, Ltd.T형미니어처 돼지
없음 구성 요소 의 구성 기 , , 마취제, 진정제, , , 통제, , , , 아르헨티나 통제

참고문헌

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