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방법 논문

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

15.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54078

⸱

2016년 7월 29일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

초록

근긴장 이상증 1 (DM1)는 근육 영양 장애의 일반적인 형태입니다. 여러 동물 모델이 DM1 설립되었지만 그들은 세포 및 분자 이벤트를 공부하기위한 효율적인 세포의 대안을 제공하기 때문에, 근원 세포 세포 모델은 여전히​​ 중요하다. C2C12 근육 모세포의 세포가 광범위하게 유전자 형질 전환, 형질 도입 또는 바이러스에 근육 생성, 저항을 연구하는 데 사용되었다하더라도, C2C12 세포의 연구를 방해한다. 여기, 우리는 C2C12의 근육 아세포 및 심근 분화의 유도에 유전자를 도입하는 일상적인 유지 보수, 형질 전환 및 전달 절차를 포함하는 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 종합적으로, 이러한 절차는 최선의 형질 전환 / 전달 효율뿐만 아니라 일관성있는 차별화 된 성과를 가능하게한다. 근긴장 성 이영양증의 연구뿐만 아니라 다른 근육 질환에 유익 할 DM1 근육 모세포 셀 모델 확립에 기재된 프로토콜.

서론

근긴장 이상증 (DM)는 여러 시스템, 특히 심장과 골격 근육 (1)에 영향을 미치는 염색체 우성 질환이다. 이 질병, DM1과 DM2의 두 하위 유형이 있습니다. DM1 더 일반적이며 DM2 2보다 더 심한 표현이 있습니다. DM1 근본적인 유전 적 변이는 3 '비 번역 영역 DM 단백질 키나제 유전자 (DMPK) 3 (UTR)에있는 CUG 삼중 반복의 확장이다. 영향을받지 않는 개인의 CUG 반복 수는 대조적으로 (37)에 5,은 50 개 이상으로 증가하고, 때로는 최대 DM1 환자 4 천에 달라집니다. 그 결과, 같은 RNA 결합 단백질, muscleblind 형 1 (MBNL1) CUGBP 및 Elav 같은 가정 한 (Celf1) misregulated이다. 때문에 확장 된 CUG 반복에 격리에 MBNL1 대체 스 플라이 싱 (5)을 조절하는 능력을 잃게된다. Celf1 반면에, 6,7-을 조절한다. Celf1 과발현 근육 손실과 연관된MBNL1 기능의 손실에 기인되지 않고 약점. DMPK 3'-UTR CUG 확장, MBNL1 상실 및 과발현 Celf1 포함 DM1 관련 변화를 시뮬레이션 동물 모델이 수립되었다. 그러나, 근육 아세포에서 DM1을 모델링 특히 DM1 관련 세포 및 분자 이벤트를 해부에 대한 효율적인 대안을 제공합니다.

C2C12 근육 모세포 세포주 제 부상 C3H 마우스 근육 분리 널리 근육 조직 분화 8,9을 연구하기 위해 사용되었다. C2C12 세포는 급속 소 태아 혈청 (FBS)을 함유 미디어 증식 용이 FBS가 소모 될 때 분화를 겪는다. 그러나,이 근육 모세포 분화 모델을 사용하여 두 가지 과제를 제시한다 : C2C12 세포는 종종 유전자 형질 전환 / 바이러스 형질 도입에 대해 내성이고; 세포 처리 및 분화 과정에 약간의 차이는 myotube 형성에 표시된 변경 될 수 있습니다.

우리 연구실은 정기적으로 교류 등 C2C12의 근육 아세포를 사용엘 모델과 효과적으로 C2C12 세포주 (10)에 플라스미드 형질 전환, 레트로 바이러스 전달 및 렌티 바이러스 전달에 의해 유전자를 제공하는 프로토콜을 개발했다. 비디오에서 우리는 / 형질 C2C12 세포를 형질 도입 및 DM1의 근원 세포 모델을 확립 차별화 일관성을 유지하기위한 최적화 과정을 보여줍니다.

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프로토콜

1. C2C12 세포 배양

  1. 성장 배지에서 100mm 플레이트 C2C12 마우스 근육 아세포를 유지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 20 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 L- 글루타민. 60 % 합류 - C2C12 계대 세포는 약 50이 될 수 있습니다.
  2. 성장 배지를 버리고 3 ㎖을 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 C2C12 세포를 세척 하였다. PBS를 제거하고 세포를 분리하기 위해 500 ㎕를 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가합니다. 5 분 - 3 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.
  3. 3 ml의 성장 배지를 첨가함으로써 트립신을 중성화. 세포를 일시 중단 8 회 - 6 피펫. 새로운 100mm 판에 일시 중단 된 세포의 1 ML을 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2 부화.

2. C2C12 세포 형질 / 전달 및 선택

  1. C2C12 플라스미드 형질
    1. 24 시간 이전에 형질 전환, 페이지에각 형질에 대한 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 늦게 7.0 × 10 5 C2C12 세포.
      참고 :이 50 리드 - 형질 전환시 60 %의 합류.
    2. 형질 시약은 사용 전에 실온에 올 수 있습니다.
    3. 간단히 미리 예열 무 혈청 배지와 소용돌이 200 μL에 플라스미드 DNA (GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200)의 2 μg의 추가. 중간에 6 μl를 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이를 사용하여 30 초 즉시 섞는다. 실온에서 30 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
    4. 2.5 ml의 무 혈청 성장 미디어 C2C12 세포의 미디어를 변경합니다. 배양 한 후 세포에 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다.
    5. 4 시간 또는 야간까지 형질 전환 혼합물 / 무 혈청 성장 배지에서 세포를 유지합니다. 다음 날 다시 성장 미디어 매체를 변경하거나 독성이 명백한 경우.
      참고 : 세포 독성은 CE의 현미경 검사로 평가된다LLS. 세포 형태 및 세포 분리의 변화를 관찰한다. 한은 어떠한 명백한 독성이없는 한, 무 혈청 성장 배지에서 밤새 배양 한 형질을 향상시킨다.
    6. (플라스미드없이 형질) 제어 문화가 살아있는 세포를 가지고 있지 않을 때까지 십일 ~ 1.6 ㎎ / ㎖의 G418 - 1.2을 추가하여 세포를 형질 전환 후 48 시간을 선택합니다. G418 보충 성장 미디어 매 2 일 매체를 변경합니다.
    7. 후속 실험을 37 ℃에서 성장 배지 및 5 % CO 2에서 G418 내성 세포를 유지한다.
  2. 레트로 바이러스 제제와 C2C12의 레트로 바이러스 전달
    1. 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민으로 DMEM 고 글루코스 보충하여 HEK 293 배지를 준비한다.
      1. 약 24 시간 형질 전환 이전에, 100 밀리미터 판 (형질에서 80 % 합류)에 4.0 × 10 6 ecotropic HEK 293 기반의 포장 세포를 플레이트 Containing 세포 배양 배지.
    2. 형질 시약은 사용 전에 실온에 올 수 있습니다.
    3. 1 ml의 무 혈청 성장 배지에서 15 μg의 플라스미드 DNA (pMSCV-또는 순수하지 않아 pMSCV-Celf1Flag - 순수하지 않아)를 섞는다. 소용돌이 짧게. DNA를 / 무 혈청 성장 매체 튜브에 단계 2.2.2에서 30 ㎕를 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 30 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션.
    4. ecotropic의 HEK 293 기반 패키징 세포로 형질 전환 혼합물 적가를 추가합니다. 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 다시를 반환합니다. 24 시간 후, 10 ml의 사전 예열 신선한 성장 매체에 미디어를 변경합니다.
    5. 상층 액 (포함하는 레트로 바이러스) 피펫을 이용하여 형질 전환 후 48 시간을 수확하고 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 판에 새로운 따뜻한 매체의 10 ML을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 4 ° C에서 뜨는을 유지합니다.
      참고 : 용지가 T로 부드럽게 추가그는 또한 측면 세포 단층을 방해하지 않도록.
    6. 형질 전환 후 상층 액을 60 시간의 두 번째 배치를 수확 및 2.2.5에서 뜨는와 함께 수영장. 500 XG, 7 분 4 ° C에서 원심 분리기 세포 파편을 제거합니다.
    7. 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 2.2.9 또는 나누어지는 단계로 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 뜨는을 저장하기 위해 진행하여이 시점에서 C2C12 세포를 형질 도입하는 레트로 바이러스를 사용합니다.
    8. 냉동 재고가 여기에 사용되는 경우, 실온에서 2.2.7에서 레트로 바이러스를 녹여.
      참고 : 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오.
    9. 합류의 40 % - 30을 목표로 전달의 같은 날에 C2C12 세포를 플레이트.
      1. 성장 배지를 버리고 3ml를 실온으로 PBS C2C12 세포를 세척 하였다. 의 PBS를 제거 500 ㎕를 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가하고, 3 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시를 품어 - 5 분.
      2. 3 ㎖ 성장 의대를 추가하여 트립신을 중화IUM. 세포를 일시 중단 8 회 - 6 피펫. 혈구를 사용하여 세포를 계산하고, 60mm 판에 8.0 × 10 5 C2C12 세포를 추가합니다.
    10. 3 ㎖ 성장 배지에서 세포의 하나 60mm 판을 감염 0.5 ml의 레트로 바이러스를 추가합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
    11. 감염 후 48 시간 - 선택 항생제 (3 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신 1)로 보충 3 ㎖ 새로운 미디어로 교체하십시오. untransduced C2C12 제어 문화가 밖으로 죽을 때까지 5 ~ 일 동안 매일 항생제와 3 ㎖ 매체를 교체합니다.
  3. 렌티 바이러스 준비와 C2C12의 렌티 바이러스 전달
    참고 : 바이오 안전성 레벨 2 캐비닛을 모든 렌티 바이러스 관련 절차를 수행하고 생물 안전 지침을 따르십시오. 바이러스를 포함하는 액체 폐기물은 폐기하기 전에 소독해야합니다.
    1. 10 %의 태아 보충 HEK 293 세포 배양 배지 (DMEM 높은 포도당과 함께 100mm 접시 (~ 형질의 날에 80 % 합류)에 판 4.0 × 10 6 293T 세포,소 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민) 형질 감염 전 24 시간.
    2. 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. 8 μg의의 렌티 바이러스 전송 벡터와 함께 렌티 바이러스 포장 벡터 (4 μg의 pMD2.G 6 μg의 psPAX2) 혼합 (Celf1의 shRNA 또는 제어 shRNA를 스크램블) 1 ml의 무 혈청 세포 배양 배지에서. 소용돌이 짧게.
    3. DNA를 / DMEM 튜브에 36 μL 사전 예열 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞는다. 30 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션.
    4. 인큐베이터에서 293T 세포를 제거하고 판에 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 플레이트 소용돌이 다시 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 반환. 24 시간 후, 10 ml의 신선한 배양액으로 형질 전환 혼합물을 교체합니다.
    5. 형질 전환 후 상층 액을 포함 렌티 바이러스 48 시간을 수집하고 50 ml의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 접시에 10 ml의 새로운 따뜻한 미디어를 추가하고 반환인큐베이터합니다. 4 ° C에서 뜨는을 저장합니다.
    6. 형질 전환 후 상층 액을 60 시간의 두 번째 배치를 수집하고 2.3.5에서 뜨는와 결합. 500 XG, 7 분 4 ° C에서 원심 분리기 잠시.
    7. 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 신선한 바이러스를 사용하는 경우, 2.3.9 단계로 진행합니다. 향후 사용을 위해, 매장 10 ㎖를 분취에서 -20 ° C에서 뜨는 바이러스 함유.
    8. 동결 스톡이 사용되는 경우, 사용하기 전에 실온에서 2.3.7에서 바이러스를 해동.
      참고 : 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오.
    9. 전달의 같은 날 2.2.9에 기술 된 바와 같이 (2.1 절에서 얻은) 플레이트 C2C12-CUG200 세포.
      참고 : 30 목표 - 합류의 40 %.
    10. C2C12-CUG200의 60mm 판을 감염 인큐베이터에 접시를 반환하는 0.5 ml의 바이러스를 추가합니다.
    11. 전달 후 72 시간 - 선택 항생제 (3 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신 1)와 보충 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다.모든 untransduced C2C12 - CUG200 제어 문화가 밖으로 죽을 때까지 5 ~ 일 동안 선택 항생제와 문화 매체 일상을 새로 고칩니다.
    12. GFP-CUG200 형질 세포에서 Celf1 최저를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 사용합니다.

3. C2C12 세포 분화

  1. 플레이트 분화 개시 전에 2.5 ml의 성장 매체 24 시간에서 6 웰 플레이트 잘 하나에 2 × 10 6 세포.
    주 : 전체 합류 24 시간에 도달되도록 도금 밀도를 조정할 수있다.
    1. PBS로 융합 세포를 씻어 낮은 혈청 분화 배지 2.5 ㎖ (둘 베코 이글 배지는 2 % 말 혈청 개질 100 U가 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 1 μM의 인슐린)을 추가 . 매 2 일 매체를 교체합니다.
      참고 : 냉동 재고 인슐린을 유지하고 각각의 매체 변화에 미디어에 추가합니다.
  2. C2C12 차별화하는 동안, 콴에 대한 샘플을 수집titative 다음 시점에서 RT-PCR (섹션 4 참조) Day0, 1, 2, 4, 6 일째에 대한 면역 염색 배양 공정 6 - 8 (섹션 5 참조).

4. RNA의 분리 및 정량 RT-PCR

  1. RNA 분리에 대한 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다. 분리 후, 30 μL의 RNase가없는 물에 RNA 펠렛을 재현 탁하고 다운 수회 피펫을하고.
    주의 : 샘플을 정량적 RT-PCR을 진행 또는 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
  2. 정량적 RT-PCR (10)에 대한 RT qPCR에 키트를 사용하여 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. 표 1에 따른 반응 혼합물을 준비한다.
구성 요소 볼륨 (μL) 최종 농도
2 × 반응 버퍼 (10) 1 배
앞으로 프라이머 0.5 200 nm의
역방향 프라이머 0.5 200 nm의
조사 0.5 200 nm의
효소 및의 RNase 억제제 역 0.1 0.25 U / ㎖
주형 1 100 NG 총 RNA
의 RNase없는 물 7.4 NA
총 믹스 (20)

표 1. 정량적 RT-PCR 마스터 믹스 준비

  1. 열 프로파일 표 2를 사용하여 20 ㎕의 RT-qPCR에 반응을 실행합니다.
역전사 단계 30 분, 48 ° C
DNA 폴리머ASE의 활성화 / 비활성화 역전사 10 분, 95 ° C
(40) 사이클 15 초, 95 ° C
1 분, 60 ° C

표 2. 정량적 RT-PCR 열 프로파일

5. 면역 염색

  1. 2.5 단층 배양 해결 갓 실온에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 / PBS를 제조 ㎖로.
  2. 실온에서 30 분 동안 2.5 ml의 0.1 % 트리톤 X-100 / PBS에서 샘플 Permeabilize 하시려면.
  3. 가습 챔버에 샘플을 전송합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 완충액 (0.1 % 비이 온성 계면 활성제 / PBS 10 % 정상 염소 혈청)을 차단하는 2.5 ml의 샘플을 차단.
  4. 차단 버퍼를 취소하고 버퍼 (1 : 100)를 차단에 희석 마이 오신 무거운 사슬에 800 μL 차 항체를 적용합니다. 상온에서 습윤 챔버에서 밤새 인큐베이션.
  5. 판 3 팀을 씻으십시오ES 2.5 ml의 세척 버퍼 2 일에 (0.1 % 폴리 소르 베이트 20 / PBS)와 (10 분마다).
  6. 세척 완충액을 제거하고 800 ㎕의 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 1 : 500 희석 된 PBS)을 적용한다. 실온에서 1 시간 동안 습윤 챔버에서 인큐베이션.
  7. 2.5 ml의 세척 버퍼로 2 회 (10 분마다)를 씻으십시오.
  8. 5 분 (증류수 탈 H 2 O에 희석 1 μg의 / ㎖) 800 ㎕를의 DAPI로 품어.
  9. 10 분 동안 다시 2.5 ml의 세척 버퍼로 씻으십시오.
  10. 2.5 ml의 PBS로 세척 버퍼를 변경하고 이미지를 캡처하는 형광 현미경을 사용합니다.

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결과

C2C12 세포는 GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200로 형질했다. 약제 내성의 선택 후, 안정한 풀을 GFP 발현 (도 1a)에 의해 시각화 될 수있는 확립 하였다. 차별화 된 근육 아세포에서 Myotube 형성은 10 (그림 1B)를 면역 염색 중쇄를 미오신에 의해 검출되었다. myotube 형성의 정량은 융합 지수는 2.6 ± 1.1 %로 35.4 ± 4.1 %로 감소하고, myotube 영역이 GFP-CUG200 (그림 1C)에 이상 CUG 확장에 의해 2.7 ± 0.8 %로 35.6 ± 2.2 %로 감소되었음을 보여 주었다. 융합 인덱스 및 myotube 영역 핵의 총수 및 각각 myotubes 의해 덮여 전체 화상 영역의 비율로 나눈 myotubes (≥ 2 핵)의 핵의 총 개수로 계산 하였다. 실시간 RT-PCR (10)는 ...

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토론

C2C12 세포주 11-14 근육 생성을 연구 모델로서 이용되어왔다. 이러한 세포는 섬유 아세포와 같은 모양을 유지, 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 증식 신속 용이 2 % 말 혈청 (15)를 포함하는 배지에서 분화. 빠른 성장 및 분화는 근육 생성 세포 모델에서 유리한 특성이다. 여기서는 C2C12 세포 내로 cDNA의 3'-UTR, 및 shRNA를 소개하는 플라스미드, 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 벡터의 사용을 입증한다. 형질 전환 / 전달 및 분화의 일관성 유지를위한 중요한 포인트는 아래에 강조 표시됩니다.

매일 셀 유지 보수의 세포 밀도가 매우 중요하다. 70 % 합류 - 이들 세포는 50 이하로 배양 할 필요가있다. 밤새 떠날 때 때문에 짧은 인구 배가 시간에 높은 합류 (> 70 %) C2C12 문화는 자발적으로 구별합니다. 자발적으로 분화 된 세포의 비율을 작게 할 수 있지만,...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

시약을 제공해 주신 베일러 의과대학의 톰 쿠퍼(Tom Cooper) 박사님, 위스콘신-매디슨대학교(University of Wisconsin-Madison)의 마니 S. 마하데반(Mani S. Mahadevan) 박사님, 제네바 대학교(University of Geneva)의 디디에 트로노(Didier Trono) 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 휴스턴 대학교 스타트업 펀드(YL), 미국심장협회 보조금(YL, 11SDG5260033) 및 중국 국립자연과학재단(XP, 81460047)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM, 고포도Life Technologies11965-084배양 배지
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150배양 배지
페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (100x)Life Technologies10378-016배양 배지
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qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xfor qRT-PCR
TriPure 분리 시약Roche11667165001RNA 분리용
CUG-BP1 항체 (3B1)santa cruzsc-20003primary Ab western blot
Actin 항체santa cruzsc-1615goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack클론텍631507레트로바이러스 제제를 위한 세포
pMSCV-puro클론텍634401레트로바이러스 제제를 위한 빈 레트로바이러스 벡터
pMSCV-Celf1Flag-puro하우스 구성트로바이러스 제제에 사용되는 Celf1Flag를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터사용 불가
디에 트로노의psPAX2렌티바이러스 제제에사용할 수 없음
디디에 트로노로부터의pMD2.G렌티바이러스 제제에사용할 수 없습니다
M.S. 마하데반으로부터GFP-CUG5참조 10에서사용할 수 없습니다
M.S. Mahadevan의GFP-CUG200참조 10 에서 사용할수 없습니다
트리톤  X-100시그마 AldrichX100면역 염색
파라포름알데히드Sigma AldrichP6148면역 염색
TWEEN  20면역염색을 위한Sigma AldrichP9416
DAPI염색을 위한Sigma AldrichD9542
당 웨스턴 레 디 선물은 선물은 . 선물은 . 선물은 . 면역

참고문헌

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  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
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  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
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