접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

요약

이 프로토콜은 랫트에서 분리된 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 분리와 축삭 정렬을 향상시키기 위한 정적 사전 스트레치 세포 배양 시스템에서 DRG 뉴런의 배양을 설명하며, 이후 슈반 세포(SC)의 공동 배양은 수초화를 촉진합니다.

초록

축삭 재생은 주로 조직화되지 않은 축삭 정렬로 인한 혼란스러운 과정입니다. 따라서 충분한 수의 재생된 축삭이 병변 부위를 연결하기 위해서는 적절하게 조직된 축삭 정렬이 필요합니다. 신경 손상 후 탈수초는 살아남은 축삭돌기의 전도 능력을 크게 손상시키기 때문에 재생된 신경의 성공적인 기능을 위해서는 재수초화가 중요합니다. 이전에는 중간엽 줄기세포(MSC)가 사전 스트레치 유도 이방성 표면에 정렬된 것을 입증했는데, 이는 세포가 수직 방향보다 늘어난 방향에서 더 큰 유효 강성을 감지할 수 있기 때문입니다. 우리는 또한 기계적으로 미리 늘어난 표면에서 발생하는 이방성 표면이 정렬뿐만 아니라 축삭의 성장 및 수초화에 유사하게 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 사전 연신된 이방성 표면을 준비하기 위한 자세한 프로토콜, 사전 연신된 표면에서 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 분리 및 배양을 제공하고, 사전 연신된 표면에서 DRG 뉴런과 슈반 세포(SC)의 공동 배양의 수초화 거동을 보여줍니다.

서론

신경 손상에서, 근위 및 원위 신경 그루터기는 종종 인해 병변 사이트에 ^1-2로 신경 다발의 직접 재배치 방지 할 수있다. 일반적으로, 축삭 책자는 연결의 복잡한 네트워크를 형성 축삭의 높은 순서 정렬 번들로 구성된다. 그러나, 신경 재생이 제대로 구성 축삭 정렬 ^3-4으로 인해 혼란스러운 과정이다. 따라서, 병변 부위를 해소 축삭 재생의 충분한 수를 생성하는 것이 아니라 축삭 조직 배향을 유도 할 필요가있다. 또한, 탈수 초화는 부상 사이트에서 myelinating 세포의 죽음으로 인한 신경 손상을 수반. 탈수 초화가 강하게 축삭 생존의 도전 능력을 손상 때문에, 탈수 초화를 대상으로 또는 재유 수화를 촉진 치료는 신경 손상 ⁽⁵⁾ 후 기능 회복을 위해 중요하다. 따라서이 프로토콜의 목적은 두 가지 문제를 해결하는 설계 방법을 예시하는 것이다신경 재생의.

재료의 물리적, 기계적 성질, 상이한 축을 따라 측정 할 때의 차이로 정의되는 표면 이방성은 셀의 배향의 성장 및 이동 ^{6-7 영향을인가하고있다.} 지형뿐만 아니라, 이방성을 유도하는 다른 방법이있다. 이전에, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 멤브레인의 기계적 정적 사전 스트레치에 의해 유도 된 표면 이....

프로토콜

세포의 분리에 관한 모든 절차는 미시간 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

사전 뻗어 이방성 표면의 1. 준비

1. 베이스와 경화제의 1 용액과 조직 배양 접시 (12cm 직경)로 혼합물을 부어 : 10을 섞는다. 4,900 mg의베이스와 총 가교 혼합물에 대한 경화제 490 mg을 사용합니다.
2. 기포를 제거하기 위해 20 분 동안 진공 하에서 겔 혼합물을 유지한다.
3. 60 ° C에서 밤새 경화 오븐에서 혼합 겔을 놓습니다.
4. PDMS의 막을 경화 한 후, 165 mTorr의 3 분의 _2와 O 65 sccm의 흐름을위한 플라즈마 클리닝 / 에칭 시스템을 사용하여 산소 플라즈마로 표면을 처리한다.
5. 인식되는 것은 어느 쪽하는 산소 처리하는 동안, 접시에서 직사각형 막 (5 × 3.5 cm)의 조각을 잘라 확인 산소 처리 된면이 직면을하고 스트레칭 프레임에 고정합니다. A의 프레임을 배치 무대를 스트레칭과 균등하게 10 % 신장에 도달 할 때까지 무대에 노브를 돌려 스트레칭 (또는 다른 미리 정해진 스트레칭, 신장 직접 연신 단계에서 읽을 수 있습니다) 긴 축 ^9. 프레임의 나사를 조여 스트레칭을 수정합니다.
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결과

사전 신장 세포 배양 시스템 DRG 축삭 배향 ^(10)을 추진. DRG 뉴런 12 일 동안 사전 뻗어 미연 신 표면에 배양 하였다. 축삭은 정렬을 입증하는 β-III-tubulin에 대한 염색 하였다. (2) 문화의 12 일 후 사전 뻗어 미연 신 PDMS 기판에 축삭 방향을 비교 한 그림. 그들은 임의의 배향을 보여 미연 신 PDMS 기판상의 상호 연결된 네트워크를 형성하는 반면, DRG 축삭은 연신 방향에 평행하게 정렬.

축삭 배향을 유도하는 것 외에도 미리 스트레칭 유도 이방성 축삭의 속상 향상. 연결된 축삭 네트워크에서 차이가 연신 표면에 형성 축삭 번들에 정렬 된 축삭은 미연 신 표면에서 관찰. 사전 뻗어 표면이 fascicular 번들은 신경 조직의 TR을 닮은에.......

토론

사전 뻗어 표면에 축삭 배향을 유도하기 위해 두 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) PDMS 막을와 균일 한 두께의 평면이어야합니다 2) 신경 교세포가 DRG로부터 제거되어야한다. PDMS의 가교제와 혼합하고 오븐에서 경화 후, PDMS 가교 겔 평평한 작업대 위에 보관 및 틸팅을 피하기 위해주의 깊게 취급되어야한다. 플라즈마 처리 후 (세포 부착을 위해 요구되는) 표면의 친수성이 시간에 감쇠 이후 PDMS 막의 산소 플라즈마 처리는 PLL 코팅 법에 의해 6 시간 내에 따라야한다. 플라즈마 처리는 상기 멤브레인의 한쪽면에 도포되어 있기 때문에, 관리는 플라즈마 처리 된 표면에 세포가 위로 향하게한다, 즉, 상기 프레임에 배치되는 올바른 쪽을 위해 접시 오프 PDMS 박리 후에 수행해야 에 연결합니다.

DRGs는 척추와 함께 정렬 뼈 포켓 내부에 있습니다. 척추의 색은 흰색이므로젊은 새끼, 상기 척추로부터 DRGs를 구별하기 어렵다. 이 경우에는, 스폿 광에 가까운 척추를 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal 매체 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 보충제 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
신경 성장 인자 -7S	Invitrogen	13290-010
페니실린-스트렙토마이신	GibcoBRL	15140-122
0.05% 트립신-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
폴리-L-라이신	트레비젠	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
플루오로-2 데옥시-우리딘	Sigma	F0503
우리딘	시그마	U3003
행크 s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
실리콘 챔버	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
플라즈마 세척/에칭 시스템	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 항체	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
표준 성장 배지			500ml Neurobasal Medium 1x의 경우 B-27 50x 10ml, Glutamax-I 100x 5ml, 페니실린/스트렙토마이신(Penn/Strep) 2.5ml, Albumax-I 1ml 및 1&mu를 추가합니다. NGF의 l-- 7S (50 μ g/ml)입니다.
FDU 우리딘 원액			FDU 100 ml의 ddH2O (10 mg/ml)의 10 ml, 후드에 여과하고 500 &mu로 나눕니다. l 분취량은 -20 ºC. Uridine 5g에서 166.7 ml의 ddH2O (33 mg/ml)에 저장하고, 후드에 필터, 200 &mu로 나눕니다. l 부분 표본 및 -20 ºC에 보관합니다. 테이크 61.5 μ FDU (10 mg/ml) 및 20.5 &mu의 l; 우리딘 (33 mg / ml)의 l, 4,918 &mu를 추가하십시오. l의 ddH2O를 최종 재고 농도로 계산한 다음 1ml 분취량으로 나누어 -20 ºC에서 보관합니다.