방법 논문

고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

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DOI:

10.3791/54091

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2016년 7월 3일

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1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

이 논문에서

요약

빙권은 과거 환경 조건에서 유지 보존 생물에 대한 액세스를 제공합니다. 프로토콜은 수집하고 토양과 얼음의 영구 동토층 코어 오염을 제거하기 위해 제공됩니다. 외인성 DNA와 콜로니의 부재가 검출 된 미생물 또는 드릴링 처리에서 재료보다는 오염을 나타낸다는 것을 시사한다.

초록

빙권은 과거의 환경 조건 하에서 지속된 보존된 유기체에 대한 접근을 제공합니다. 사실, 이러한 얼어붙은 물질은 광대한 기간에 걸친 상태를 반영할 수 있으며, 내부에 숨겨진 생물학적 물질에 대한 조사는 고대 환경에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 생태계를 적절하게 분석하고 얼어붙은 토양과 얼음에서 의미 있는 생물학적 정보를 추출하기 위해서는 얼어붙은 샘플의 적절한 수집 및 처리가 필요합니다. 이는 미생물 및 DNA 분석에 특히 중요한데, 존재하는 군집이 현대의 군집과 매우 독특하게 다를 수 있기 때문입니다. 여기에서는 얼어붙은 코어를 성공적으로 수집하고 오염을 제거하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 외부 표면을 도핑하는 데 사용된 군체와 외인성 DNA가 없다는 것은 우리가 얼어붙은 코어의 오염을 성공적으로 제거했으며, 검출된 미생물이 코어의 시추나 가공으로 인한 오염이 아니라 물질에서 나온 것임을 시사합니다.

서론

빙권은 (예를 들면, 영구 동토 토양, 얼음 기능, 빙하, 눈, 만년설과 얼음은) 과거의 환경 조건에서 지속 생물의 유형을 엿볼을 제공합니다. 이 기판을 증착 이후 동결 보존하고 이전 수천 년, 그들의 미생물 커뮤니티, 수백 수십 수 있기 때문에, 고대의 환경 조건을 반영한다. 적절하게 이러한 생태계를 분석하고 냉동 샘플의 냉동 토양과 얼음, 올바른 수거 및 처리에서 의미있는 생물학적 정보를 추출하는 것은 필요하다. 21 세기 기후 전망은 북극과 아 북극 지역 1에서 뚜렷한 온난화의 가능성을 나타내는 이것은 매우 중요하다. 특히, 실내 알래스카와 그린 랜드는 약 5 ° C 각각 2100, 3 7 ° C를 따뜻하게 할 것으로 예상된다. 이것은 상당히 토양 수생 미생물 커뮤니티, 따라서 관련 영향을 예상생지 화학 과정. 따뜻한 온도와 변경된 강수량 정권은 잠재적 두꺼운, 계절 해동 (활성)에 이르는 많은 지역 2-5에서 영구 동토 저하 6,7, 냉동 토양의 해동과 같은 거대한 얼음 기관의 용융 층을 시작할 것으로 예상된다 지상 얼음, 얼음 웨지와 분리 얼음 8. 이 극적으로 이러한 생태계에서 식물과 동물의 생물 다양성에 추가하여 생지 화학적 특성을 변경합니다.

빙하 얼음과 친연성의 영구 동토 침전물과 얼음 기능은 화학 및 기능이 형성되는 시간에 살았 무엇을 나타내는 환경의 생물학적 증거를 포획했다. 예를 들어, 인테리어 알래스카, Illinoisan 위스콘신 모두 영구 동토층이 존재하는 세 특히이 영구 동토층이 존재하는 IMPA의 생물학적, 화학적 증거를 포함 (YBP) 전에 150,000년에 현대 거슬러 올라가는 독특한 위치를 제공합니다생물 다양성에 대한 과거 기후 변화의 캐럿. 그 결과, 이러한 퇴적물은 수천 년에 걸쳐 생지 화학 및 생물 다양성의 기록을 제공합니다. 영역이 낮은 침강 속도를 가지며 빙하 적이 있기 때문에, 교란 샘플 수직 터널 토양 프로필 또는 수평 방향 시추에 수집 및 분석, 어느 드릴링 접근 가능하다. 더 중요한 것은, 광범위한 기록은 특히이 지역 9-14에서 영구 동토층의 고유 한 생물 지구 화학적 특징을 강조하는 것이 존재한다. 특히, DNA 분석의 응용 프로그램이 모두 현존하는 고대 얼음과 영구 동토층 샘플에서 생물 다양성의 존재와 정도를 추정하는 것은 특정 생물에 의해 점령 고대 환경 조건의 연계 및 서식지 탐사 할 수 있습니다.

각각의 연구가 differe를 사용하지만 이전 연구는 포유 동물, 식물, YBP 11, 15 ~ 19 50K 데이트 샘플에서 미생물에 기후에 미치는 영향을 확인했다NT 방법론 수집하고 영구 동토 또는 얼음 코어 오염을 제거합니다. 구체적인 방법은 외래 핵산은 또한 샘플들로부터 제거되었는지 명확하지 않지만 어떤 경우에는 시추 코어, 16, 20-21을 멸균 하였다. 다른 연구에서, 박테리아는 22 제염 방법의 효능을 측정하기 위하여 사용되어왔다 (15) (예를 들면, 세라 티아 균)과 형광 미립자를 분리.

이 실험은 다시 약 40K YBP 데이트 영구 동토 샘플에서 미생물 군집을 조사 더 큰 연구의 일부였다. 연구의이 부분의 구체적인 목적은 성공적으로 얼음과 영구 동토층 코어 오염을 제거하는 것이었다. 우리의 지식을 어떠한 방법은 고정 된 코어의 외측 부분으로부터 외래 핵산과 연관된 클레아 제를 제거하기위한 용액의 이용을 통합하지 않았다. 따라서 이러한 솔루션 commonl 있다는 사실에도 불구하고Y는 분자 실험 실험실 장비의 오염을 제거하는 데 사용됩니다.

코어는 정화 된 후에, 게놈 DNA는 그리피스 등. 23 Töwe 외. (24)에 의해 개발 된 프로토콜을 사용하여 추출하고, 분광 광도계를 사용하여 정량하고, 반응 당 20 ng를 달성하기 위해 멸균 DNA없는 물로 희석 하였다. 600 초 동안 95 ° C (45) 사이클 다음 : 세균 16S의 rRNA의 유전자 rRNA의 유전자가 프라이머 아치 349F와 아치 806R 다음과 같은 조건에서 TM 아치 516F (26)을 프로브로 증폭 된 프라이머 331F 및 797R 증폭 및 BacTaq 25 고세균 (16S)을 조사 하였다 30 초, 60 초 동안 57 ° C, 30 초 동안 40 ° C에서 최종 연장 25 초 동안 72 ° C 95 ° C의. 모든 qPCR의 반응은 중복으로 수행되었다. 20 ㎕의 반응 부피가 20 ng를 DNA, 프라이머 10 μM, 프로브의 5 μM 및 qPCR에 반응 혼합물 10 μl를 포함. 표준 FO슈도모나스 각각 fluorescens 및 Halobacterium의 salinarum에서 세균 및 고세균 qPCR의 게놈 DNA를 사용하여 제조 하였다 r에. 모두 상을 로그로 성장했다. 플레이트 카운트를 실시하고, DNA를 배양 물로부터 분리 하였다. 게놈 DNA는 하나의 가정 및 게놈 당 16S rRNA 유전자의 여섯 사본 H. 용으로 분광 광도계로 정량 하였다 salinarum 및 P. 각각 27 ~ 28, fluorescens. 세균 및 고세균 유전자의 카피 수를 표준 곡선에 기초하여 계산하고, 치료 사이의 불균등 한 분산을 고려하여 로그 변환하고, ANOVA에 의해 평가했다.

커뮤니티 조성물은 16S rRNA 유전자 염기 서열을 유동 세포 다리 증폭 기술을 이용하여 '미생물 생태로 정량적 통계'(QIIME) 29 커뮤니티를 분석하여 결정 하였다. 순방향 및 역방향 읽기가 함께 결합 된 다음 시퀀스를 필터링, 색인하고,고품질 대표는 참조 데이터베이스와 서열 정렬을 통해 드 노보 운​​영 분류 학적 단위 (OTU) 과제 선정되었다. 정렬 된 서열은 분류 학적 할당 별도 참조 데이터베이스에 비교 하​​였다. 문 수준 OTU 테이블은 일반 커뮤니티 구성을 결정하기 위해 만들어졌습니다.

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프로토콜

1. 장비 준비 및 영구 동토 코어 컬렉션

  1. 장비 준비 및 현장 샘플 수집 및 보존 기어
    1. 배럴의 상단에 드라이브 어댑터를 삽입하고 제자리에 고정하는 레버를 돌려 샘플 수집을위한 오거를 조립합니다. 드라이브 어댑터에 어댑터 튜브 핀 어댑터 튜브 상 모터에 핀. 배럴에 커터를 넣습니다.
    2. 샘플에 어떤 오염을 줄이기 위해 경량 정장, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용 할 것. 귀 보호 및 영구 동토 터널 (그림 1) 입력시 안전 하드 모자를 착용한다.
    3. 터널을 입력하고 샘플 (그림 1B)를 수집하는 위치를 선택합니다.
      주 : 수직 또는 수평 드릴링 위치는 물질 (예, ICE 또는 영구 동토층) 동결 증거가 공지되어있는 영역을 선택, 알려진 많은 뿌리 체계가없고 공지 자갈이 없다. 모두 제거시료를 수집하기 전에 영역에서 식물 물질 생활. 수직 또는 수평 시추 경우, 상대적으로 평평하고 오거에 액세스 할 수있는 영역을 선택합니다.
    4. 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 소독 된 플라스틱 재료로 땅을 적층하여 워크 스테이션을 준비합니다.
    5. 그들은 오거에서 제거 할 때 코어를 개최 저점을 제공하기 위해 길이 워크 스테이션에 반에 10cm 직경의 폴리 염화 비닐 (PVC) 파이프 절단을 놓습니다. 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 PVC 파이프의 오염을 제거.
    6. 워크 스테이션 근처에, 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 분무하여 오거 오염을 제거. 와이프와 오거에서 솔루션을 제거합니다.
  2. 얼음과 영구 동토층 코어 수집 및 저장
    1. 샘플 벽의 영역을 선택합니다 (1.2.1 참조노트).
    2. 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 닦아 냉동 벽 면적의 약 10cm 직경의 오염을 제거.
    3. 이 샘플 영역에 수직이되도록 관심 영역으로 정화 오거 상승 벽 (도 1C, D)의 세척면에 구멍을 시작한다.
    4. 조심스럽게 샘플 수집 영역에서 오거를 제거합니다. 모터에서 오거를 분리하고 깨끗한 워크 스테이션에서 멸균 PVC 파이프 위의 오거를 놓습니다. 조심스럽게 냉동 코어 멸균 PVC 파이프 (그림 1E)에 슬라이드 아웃하도록 오거를 기울이십시오.
    5. 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액과 장갑 오염을 제거.
    6. 멸균 장갑과 얼음 및 영구 동토층 코어를 들고 무균 가방에 배치합니다.
    7. 그들이 제공 또는 처리 될 때까지 냉각기 또는 차가운 방에 코어를 배치합니다.
    8. 쉬0 ° C 이하의 온도에서 그들을 유지하기 위하여, 드라이 아이스를 사용하여 고정을 IP 코어.
    9. 즉시 -80 ° C에서 코어를 저장합니다.

2. 영구 동토 얼음 코어 프로세싱

  1. 재료 준비
    1. 4 시간 동안 450 ℃의 오븐에서 굽기에 의해 멸균, 핵산 무료 무거운 의무 알루미늄 호일, 금속 선반, 유리, 금속 집게, 유리 양모를 준비합니다. 사용할 때까지이 자료를 따로 설정합니다.
    2. 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 통과시켜 95 % 에탄올, 초순수 살균.
    3. 4 ° C에서 -20 ° C 물에서 보관 에탄올 용액.
    4. 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 분사 즉시 각 솔루션 후 닦아 플라스틱 통치자를 소독.
  2. 세균성 문화 준비
    1. 세라 티아 균 성장을 국물과 접시를 준비합니다.
      1. 국물를 들어, 5g의 시도를 결합ptone, 1g 포도당, 5g 효모 추출물 및 1g 칼륨 인산, 다음 증류 추가 할 물은 판을 상기 혼합 한천 15g을 추가하려면 1 L.에 도달합니다. 국물과 플레이트를 들어, 15 분 동안 121 ° C에서 7 오토 클레이브에 산도를 조정합니다.
    2. 8g 염화나트륨, 염화칼륨 0.2 g, 인산 나트륨 1.44 g 및 0.24 g의 인산 칼륨 염기를 조합하여 1X 인산 버핑 식염수 (PBS)를 준비하고 800 ml에 도달 증류수를 추가한다. 7.4으로 산도를 조정하고 15 분 동안 121 ° C에서 1 L. 오토 클레이브에 도달하는 증류수를 추가합니다.
    3. S.에 침지하여 살균 루프 국물을 접종 이전에 -80 ℃에서 냉동 보관 하였다 티아 균 배양. 무균 조건 하에서, 연속 희석 수동 PBS 9 ml의 배양액 1mL를 첨가하여 배양 용액을 반전. PBS의 9 ml의이 희석 1 ML을 추가하고 수동으로 솔루션을 반전. 10 -9 dilu까지 여덟 번 이상 반복기 도달.
    4. 접시에 국물 1 ㎖를 배포하고 셀 스프레더와 확산에 의해 아가 플레이트 상에 10-6, 10-7, 10-8, 10 -9 솔루션을 확산. 희석 당 세중에서이 작업을 수행합니다. 4 ° C에서 원래의 문화를 저장합니다.
    5. 24 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어. 원래 배양 세포의 수를 계산하는 콜로니의 수를 계산. 주 : 원래 배양에서 콜로니의 수는 박테리아의 성장 속도에 의존한다.
    6. 피펫 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 원래 문화의 250 μL. 이전 단계에서 콜로니 수에 의해 결정되는 약 109 세포 / ml를 얻을 1X PBS의 충분한 부피를 첨가하여 원래의 배양을 희석. 10 분 동안 2500 × g으로 원심 분리에 의해 미세 원심 분리 튜브에 세포를 펠렛.
      주 : 1X PBS의 부피는 박테리아의 성장 속도에 따라 달라질 것이다.
    7. 멸균 biohood에서상기 발효액을 피펫 및 PBS 완충액 1X 1 ml의 세포를 재현 탁. 사용할 때까지 4 °의 C 또는 약 2 개월에 보관하십시오.
    8. 처리의 날, S. 희석 원래 S. 1 ㎖를 추가하여 단계 2.2.7에서 티아 균 배양 50㎖의 원심 분리 관에서 PBS 완충액 39 mL를 1X로 티아 균 배양.
  3. 코어 프로세싱 및 보존 기어 차가운 실내 공간을 준비
    1. 1 % 표백제 용액으로 냉장실 깨끗한 벽, 바닥, 금속 테이블 놀 이전.
    2. 약에 냉장실의 설정 온도 -11 ° C ~.
    3. 추운 방에 원하는 온도에 도달하면, 냉장실과 샘플에 어떤 오염을 줄이기 위해 경량 정장, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용한다.
      참고 : 두 제대로 옷을 입고 개인이 절차가 필요합니다.
    4. 멸균 재료를 가지고 (예를 들면, 알루미늄 호일, 금속 선반, 유리, 트레이, S. 티아 균의 문화, 마일멸균 테이블에 냉장실과 장소에 crotome 블레이드) 및 샘플.
  4. 추운 방 시설에서 영구 동토와 얼음 코어 프로세싱
    1. 알루미늄 호일의 멸균, 핵산 무료 시트에 영구 동토 코어를 놓습니다.
    2. 가볍게 S.의 희석 배양에 코어의 외부 접종 티아 균은 살균 발포 플러그 (도 2b)를 사용.
    3. 트레이 위에 앉아 멸균 금속 선반에 코어를 배치합니다.
    4. 70 % 에탄올, DNA 제염 용액과의 RNase 염액과 스틸 마이크로톰 블레이드 소독.
    5. 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액과 개별 깨끗한 니트릴 장갑이 트레이 위 45 ° 각도로 코어를 개최합니다.
    6. 개별 B 부드럽게 개별 A는 각 크레이프 후의 코어 (회전 동안 멸균 블레이드를 사용하여, 말단을 포함한 전체 코어의 외측 대략 5mm를 긁어 가지고 도 2C 및 3A, B). 필요에 따라 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 블레이드를 닦아냅니다.
    7. 개별 A는 용액이 주입 될 때 코어 (도 2D, 3C)를 회전하면서 개인 B는 신중하고 신속하게 핵심을 통해 필터 살균 95 % 에탄올을 부어 있습니다.
    8. 개인 B 즉시 필터 멸균 수와 코어를 씻어 있습니다.
    9. 새로운 멸균 금속 랙 트레이에 사용되는 금속 랙을 장착합니다.
    10. 개인 A가 트레이 위 45 ° 각도로 코어를 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 자신의 니트릴 장갑을 청소하고 유지하게한다.
    11. 개인 B가 DNA의 오염 제거 용액으로 전체 코어를 살포해야합니다.
    12. 개인 B 즉시 필터 멸균 수와 코어를 씻어 있습니다.
    13. 개인 B가 된 RNase의 오염 제거 용액으로 전체 코어를 살포해야합니다.
    14. Individu이알 B는 즉시 필터 멸균 수와 코어를 씻어.
    15. 알루미늄 호일의 멸균 시트에 핵심을두고 가볍게 마무리.
  5. 해동 외부 코어
    1. 층류와 멸균 biohood에서 멸균 유리 접시 위에 멸균 금속 선반을 두십시오.
    2. S. 특정이 한천 플레이트를 배치 멸균 랙 아래 유리 접시에 티아 균은 코어 (그림 2E)로부터 액체를 수집합니다.
    3. 멸균 금속 선반에 코어를 배치합니다.
    4. (평균이 약 10 분 이내에 발생) 코어의 외부 표면의 약 2-5mm 23 ° C에서 해동하도록 허용합니다. 약 90 매 2 분을 핵심으로 돌립니다.
    5. 멸균 집게와 멸균 유리 섬유를 사용하여 코어의 전체 표면을 면봉과 S. 두 한천 플레이트 특정 접종 판의 표면에이 물질을 보라고하여 티아 균. 원래 문화에 두 개의 새로운 판을 접종하면 외부를 도핑하는 데 사용냉장실의 낮은 온도에 노출 코어.
    6. 근처 멸균 통치자를 배치하지만 핵심을 터치하지 않음으로써 해동 원통형 코어의 외부 치수를 측정한다.
    7. 큰 무균 가방에 핵심을두고 -80 ° C에서 보관합니다.
  6. 성장 확인
    1. 일주일 동안 23 ° C에서 한천 플레이트를 품어.
    2. S.의 성장을위한 한천 플레이트를 검사 티아 균 식민지.
      1. 접시에 보이는 식민지가없는 경우, 2.5.3 단계로 진행합니다.
      2. 식민지가 접시에 나타나는 경우, 섹션 2 "영구 동토와 얼음 코어 프로세싱 '의 단계 2.1.1에서 반복합니다.
    3. 냉장고에서 코어를 구하여 무균 멸균 가방에 전송할 수 있습니다.
    4. 전체 코어를 해동 약 24 ~ 48 시간 동안 4 ° C에서 멸균 가방의 핵심을 저장합니다.

3. 얼음 코어 및 영구 동토에서 핵산 추출에 대한 표본을 얻습니다

  1. 빙하 코어에서 핵산 추출
    1. 부드럽게 가방 (그림 2G)를 교반하여 빙하 코어에서 해동 재료를 섞는다.
    2. 미생물을 수집하고 진공하에 0.22 μm의 필터로 멸균 용기에 해빙 물질을 붓는다.
    3. 무균 살균 집게로 필터를 제거하고 멸균 2 ml의 세라믹 비드 튜브 (1.4 mm)에 넣습니다.
    4. -80 ° C에서 필터를 저장합니다.
  2. 영구 동토 코어에서 핵산 추출
    1. 부드럽게 가방을 반죽하여 영구 동토층 코어에서 해동 재료를 섞는다.
    2. 영구 동토층이 잘 혼합 한 후, 멸균 scoopula으로 약 0.5 g 벌크 토양의 표본을 얻고 균형에 똑바로 앉아 칭량 멸균 2 ml의 세라믹 비드 스크류 캡 튜브 (1.4 mm)에 넣습니다.
    3. -80 ° C에서 보관 부 표본.
    4. 샘플의 중량 수분 함량을 얻습니다.
      1. steril와 영구 동토층의 10g을 측정균형에 칭량 주석의 전자 scoopula과 장소. 영구 동토층 및 주석의 젖은 질량을 측정한다.
      2. 24 시간 동안 105 ° C로 설정 오븐에서 영구 동토층을 품어. 영구 동토층 및 주석의 건조 질량을 측정한다.
      3. 영구 동토층의 건조 질량 영구 동토의 젖은 질량을 뺀 영구 동토층의 건조 질량 나누어 중량 수분 함량을 계산합니다.
    5. -80 ° C에서 보관 영구 동토.

4. 영구 동토 얼음 코어에서 핵산을 추출

  1. 재료 준비
    1. 37 ° C 및 고압 증기 멸균에서 O / N을 배양, 0.1 % 디 에틸 피로 카보 (DEPC)로 처리하여 솔루션을 보유 황색 유리 병을 준비합니다.
    2. 240 mM의 인산 칼륨 완충액을 준비한다. 인산 칼륨 일 염기의 2.5 g 및 인산 칼륨 이염의 38.7 g을 추가합니다. 멸균 물을 첨가하여, 500㎖에 최종 볼륨을 조정합니다.
    3. 헥사 데실 브로마이드 (CTAB) 추출 버피 준비FER 80 ml의 물에 4.1 g의 염화나트륨을 용해시키고, 가열 및 교반하면서 천천히 10g의 CTAB를 추가하여. 멸균 물을 첨가하여 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다.
    4. 인산염 완충 용액의 동일한 볼륨을 추가 CTAB는 버퍼 및 필터는 0.22 μm의 필터로 살균. RT에서 알루미늄 호일 및 저장 병을 커버.
    5. 9.35 g의 NaCl, 100 ml의 멸균을 조합하여 1.6 M 염화나트륨 수용액 (염화나트륨)을 준비한다. 1.6 M NaCl 용액 및 필터 소독에 10g의 폴리에틸렌 글리콜 8000을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
  2. 핵산 그리피스 등의 등의 수정 된 버전에 따라 추출. 22 Töwe 등. (23)
    1. 경량 정장, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용 할 것. 청정 실험실 공간 및 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 피펫.
    2. 세라믹 비드 나사-CA 2 ㎖에 (얼음 코어 또는 영구 동토 토양 샘플에서 필터) 표본을 제거실온에서 -80 ° C의 냉동고와 해동에서 페이지 관.
    3. 간단히 헥사 데실 브로마이드 (CTAB) 추출 버퍼와 소용돌이의 0.5 ML을 추가합니다.
    4. (: 24 : 25 1) 페놀 - 클로로포름 - 이소 아밀 알코올의 0.5 ml의 추가 (산도 8)과 vortexer를에 평판 어댑터를 사용하여 10 분 동안 수평 튜브를 흔들.
    5. 4 ° C에서 5 분 동안 16,100 XG에 비드 박동, 원심 분리기 튜브에 따라.
    6. 새로운 멸균 1.5 ㎖의 튜브에 수성 층을 제거하고 클로로포름 - 이소 아밀 알콜의 동량 혼합 (24 : 1). 4 ℃에서 5 분 동안 16,100 XG에 원심 분리기.
    7. 새로운 멸균 1.5 ML 튜브에 수성 층을 제거하고 30 % 폴리에틸렌 글리콜 8000 및 1.6 M의 NaCl이 볼륨을 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 품어.
    8. 4 ℃에서 10 분 동안 16,100 XG에 원심 분리기.
    9. 4 ° C에서 10 분 동안 16,100 XG에 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 및 원심 분리기의 약 500 μL와 핵산 펠렛을 씻으십시오.
    10. 2 시간 동안 멸균 biohood 공기 건조 펠렛. 50 μL의 DNase의 /의 RNase가없는 TE 버퍼에 재현 탁 (PH 8.0). DNA는 PCR 및 qPCR에 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다.
    11. 분광 광도계로 DNA의 농도를 결정합니다.
    12. 반응 당 20 NG를 달성하기 위해 멸균, DNA가없는 물과 DNA를 희석.

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결과

제시된 방법은 영구 동토층에 빙하 얼음에서 다양한 빙권 환경에서 수집 된 냉동 샘플의 오염을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 특히 공학 연구 개발 센터에서 수집 얼음과 영구 동토층 샘플로부터 수집 된 데이터 제시 - 폭스, AK에있는 냉전 지역 연구 및 공학 연구소 (ERDC - CRREL) 영구 동토 터널 (그림 1A 및 1B). 영구 동토층 터널 골드 스트림 계곡의 측면으로 약 110m를 확장하고 얼음이 풍부한 미사와 충적층 30 ~ 31에 대한 액세스를 제공합니다. 얼음 쐐기 및 냉동 토양 샘플은 신중하게 샘플링 당시 2014 년 10 월 24 일 터널의 벽에서 세중의 수집, 영구 동토층 벽의 온도는 -2.9 ° C이었다. 샘플에서 35m와 60m의 터널 포털, 냉동 토양에서 얼음 쐐기 기능이 약 27m에서 수집터널의 포털 (도 1C 및 ...

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토론

빙권은 과거 환경 조건에서 유지 보존 생물에 대한 액세스를 제공합니다. 복구 된 분류군이 전체 역사적인 지역 사회를 대표하지 않을 수 있지만, 빙하와 영구 동토층 샘플의 분석에서 발견 한 사람들은 선택 기간 15 ~ 16에 대한 중요한 역사적인 정보를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 의미있는 생물학적 정보는 해동 (33)의 결과로 탄소 순환 과정을 조사 얼음 그린란드 빙상 (20)의 혐기성 활동을 조사 연구와 영구 동토 연구에서 도출되었으며 Beringia를 16 영구 동토층에서 진균 다양성에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 다운 스트림 실시하는 것은 이러한 냉동 재료 내에서 생물학적 사회 조사를 분석하기 전에 적절한 샘플 수집 및 오염 제거가 발생합니다. 다음 단계는 데이터를 해석에 중요한 의미를 가지고 있지만, 많은 연구가 w 방법 샘플에 대한 구체적인 정보를 제공하지 않습니다조립식 수집 및 처리 또는 이미지는 냉동 재료를 처리하는 방법을 보여...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 미 육군 엔지니어 연구 개발 센터, 기초 연구 프로그램 사무소를 통해 자금을 지원받았습니다. 이 정보를 게시할 수 있는 권한은 엔지니어 책임자가 부여했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% 이소프로판올월마트551116880
95% 에틸 알코올 (변성) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
DNA 오염 제거 솔루션, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
RNase 오염 제거 솔루션, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
경량 슈트Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
니트릴 장갑Fisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
항바이러스 마스크Curad, WalgreensCUR3845
멸균 샘플 가방 Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
스틸 마이크로톰 블레이드 B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack제작 CRREL, Hanover, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
알루미늄 호일웨스턴 플라스틱, 테메큘라, CA
500 ml 병 0.22  &뮤; m 필터Corning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Biosafety HoodNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
PetriDish Fisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC 한천 181- 포도Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC 한천 181- 효모 추출물Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC 한천 181- 인산이칼륨JT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC 한천 181- 한천Difco, Sparks, MD214530
NanoDrop 2000 UV Vis 분광 광도계Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., 인디애나폴리스, IN
Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
em>Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
미생물 DNA 분리 키트MoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
귀 보호ElvexEP-201
안전모
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
유리솜Pyrex430330
눈금자
계량 주석 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
염화나트륨Sigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
염화칼JT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Potassium phosphate, monobasicJT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
인산칼륨, 이염기성JT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
인산나트륨 이염기성, 무수Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
50ml 원심분리기 튜브Corning, Corning, NY4558
2ml 마이크로 원심분리기 튜브MoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
2 ml 세라믹 비드 튜브 (1.4  mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
폴리에틸렌 글리콜 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrifugeEppendorf, Hauppauge, NY5417R
클로로포름-이소아밀 알코올 (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetsRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 및 1,000 µ l 피
펫 피펫 팁Rainin, Woburn, MARainin LTS 사전 살균, 저 보유, 필터링 팁, 10, 20, 200, 1,000  &마이크로; l
VortexorScientific Industries, Bohemia, NYG-560
Vortex AdaptorMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Clear BottleCorning, Corning, NYC1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NYC5135250
병 상단 필터, 0.22  &마이크로; m코닝, 코닝, 뉴욕430513
60 ml 주사기Becton, Dickenson and Company, 프랭클린 호수, 뉴저지BD 309653
Millex 주사기 필터, 0.22 μ mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70% 에탄올Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500희석 및 필터 멸균
Isotemp 100 L 오븐Fisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
세포 살포기Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
일회용 접종 루프Fisher 사이언티픽, 피츠버그, PA22-363-602
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참고문헌

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