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방법 논문

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략

7.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54104

⸱

2016년 6월 4일

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Pharmacy, Research Unit for Infectious and Tropical Emerging Diseases, Aix Marseille University, 2Pole of Infectious and Tropical Diseases, Clinical and Biological Sector, Federation of Bacteriology-Hygiene Virology, University Hospital Institute Mediterranean Infection

이 논문에서

요약

여기에서는 거대 바이러스의 새로운 아스파르바이러스 관련 계통인 파우스토바이러스의 새로운 유전자형을 특성화하기 위한 바이러스 분리의 최신 발전에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 바이러스, 특히 아메바를 감염시키는 거대 바이러스의 고처리량 격리에 적용할 수 있습니다.

초록

거대한 바이러스의 분리는이 거대한 바이러스가 원생 ​​생물에 관한 특히 때문에, 바이러스학의이 새로운 시대에 큰 관심이다. 자이언트 바이러스는 원생 생물의 많은 종에 대한 잠재적 병원성 수 있습니다. 그들은 Megavirales의 최근 기술 된 순서에 속한다. 하수 시료에서 분리 된 새로운 계보 Faustovirus는 포유 동물의 병원체 아프리카 돼지 열병 바이러스에 먼 관련이있다. 이 바이러스는 또한 amoebal 호스트, Vermamoeba의 vermiformis, 건강 관리 물 시스템에 공통 원생 생물에 고유합니다. 그것의 유전자형 수집을 확대하고 팬 게놈을 연구하기 위해 새로운 Faustovirus 유전자형을 분리 계속 중요합니다. 우리는 아메바 공동 배양 세균 및 진균 오염물을 방지하기 위해 항생제 및 항진균제의 조합의 사용을 개선하고 바이러스 증식을 선호하여 추가 균주의 분리를위한 새로운 전략을 개발했다. 우리는 또한 새로운 starvatio를 구현N 매체 V.을 유지할 바이러스 공동 배양을위한 최적의 조건에서 vermiformis. 마지막으로, 우리는 세포 병변 효과를 검출하기 위해, 시간 소모적 인 유동 세포 계측법보다는 현미경 관찰을 사용했다. 우리는 더 나은 자신의 환경, 호스트 특이성 유전자 내용을 이해하기 위해,이 방법의 효율성을 증명함으로써 Faustoviruses의 수집을 확대, 하수 시료에서 두 균주를 획득했습니다.

서론

거대 바이러스의 Megavirales 순서에 속하는 특히 이들의 발견은 완전히 입경 게놈의 복잡성의 관점에서 바이러스의 세계를 바꾸었다. 바이러스는 이전 소기업 것으로 생각하고 Mimivirus 모든 규칙을 위반 등장 하였다. 1 군 유전체학 데이터 환경에서 2-5뿐만 아니라, 인간에서뿐만 아니라 거대 바이러스의 편재를 제안한다. (6) 따라서, 여전히 필요가있다 대규모 이러한 바이러스를 검색 할 수 있습니다. 이 거대한 바이러스의 다양성이 인간의 샘플 12, 13 및 환경 시료의 다양한 선별하여, 전 세계적으로도 7-11하지만를 수생 환경의 다양성과 관련 퇴적물뿐만 아니라 샘플링하여 평가 하였다. 7,9 가시 아메바의 풍뎅이 아목의 mimivirus이었다 식세포 원생 생물, 주로 가시 아메바 종을 사용하여 공동 문화입니다. 14-16 거대 바이러스의 전체 컬렉션은 또한 다음이었다과학계는 가시 아메바 종에 대한 연구 및 격리 절차를 제한 만든이 지정된 원생 호스트에서입니다. 분명히 하나의 호스트 종에이 신뢰는 바이러스의 많은 부분이 간과되고 가져왔다. 거대 바이러스 CroV가 높은 운동성 해양 원충 카페테리아 roenbergensis 절연 있다는 사실은 17,18 새로운 계통 또는 거대 바이러스 패밀리를 발견하기 위해 원생 동물의 넓은 범위를 사용할 필요성을 나타낸다. Reteno 등은. 이전에 사용 된 적이 셀 호스트와 같은 다른 원생 동물을 선택 관리, 거대한 바이러스의 새로운 아스파 관련 계통 (새로 명명 된 Faustovirus를)입니다. (19)

이 바이러스 계통의 구성원을 확장하기 위해 새로운 Faustovirus 유전자형을 분리하기위한 시도에서, 우리는 우리의 격리 절차를 수정하고 새로운 Faustoviruses을 수확 할 수있는 환경 시료를 선별를 사용했다. 우리 다음새로운 균주의 특성을하기 위해 전체 프로토콜을 설명했다. 우리는 Vermamoeba의 vermiformis, 이미 첫 번째 Faustovirus 프로토 타입 E12. 19 현재 여전히 호스트 특정되어 Faustovirus에 대한이 원생 생물의 분리에 사용되는 인간 환경에서 발견 된 가장 일반적인 자유 생활 원생 생물, 20-22을 평가 하였다. 우리는 우리의 실험실은 아메바 용해 또는 바이러스 성장을 보였다에 더 시도가 다른 거대한 바이러스를 성장하지 있기 때문에 알려진 거대한 바이러스의 것도,이 아메바에 대한 병원성 없다는 것을 알고 있었다. 이러한 이유로 생각 V. vermiformis 새로운 Faustoviruses을 분리하는 것으로 알려져 최고의 가장 독특한 세포 지원입니다.

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프로토콜

1. 샘플 컬렉션

  1. 서로 다른 환경과 지역의 70 샘플을 수집합니다. 세인트 피에르 드 Meyzoargues (프랑스), 마르세유 (프랑스) 파크 Borély의 호수에서 15 샘플의 마을에서 5 더러운 물 샘플,이 경우, 다음을 사용 (15) 바다 물 25 강 물 샘플 알프스 (프랑스)에서 마르세유 Samena (프랑스)에서 바위 입구에서 퇴적물과 샘플, 그리고 마지막으로, 라 시오타의 하수에서 10 샘플 (프랑스).
  2. 어떠한 처리없이 실온에서 1 분 동안, 접종 전에 균질화 소용돌이 샘플.

2. 격리 절차

  1. 블라인드 문화 절차 및 샘플 예방 접종에 대한 준비 호스트
    1. 사용 V. 공동 배양을위한 세포 지원과 같은 vermiformis (주 CDC19).
    2. (프로테아제 - 펩톤 - 효모 추출물 포도당 매체의 30ml를 가진 75cm 2 세포 배양 플라스크에, PY를 28 ° C에서 아메바를 유지지). 표 1에 PYG 구성을 확인하시기 바랍니다.
      참고 : 48 시간 후, 아메바는 정상적인 카운트하여 카운트 슬라이드 (예 Kovaslides)에 의해 정량화된다.
    3. 10 분 동안 720 × g으로 원심 분리하여 5 × 5 6 세포 / ㎖, 펠렛 아메바 (10)의 농도로 세포를 수확.
    4. 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 멸균 페이지의 amoebal 식염수 (PAS) 표 1의 30 ml의에서 아메바 펠렛을 다시 일시 중지합니다.이 세정 절차를 반복합니다.
    5. 약 106 아메바 / ml의 농도의 항생제 및 항진균제 혼합물 기아 배지 30 ㎖에서 아메바를 다시 일시. 기아 매체는 encystment 또는 곱셈없이 살아 남기 위해 그것을 가능하게하는 아메바에 대한 생존 매체입니다. 표 1의 구성을 확인합니다.
      주 : 항균제 혼합물은 10 μg의 / ㎖ 반코마이신 10 μg의 / ㎖ 이미페넴, 20 μg의 / ㎖ 시프로플록사신, 20 μ 포함g / ㎖ 독시사이클린, 20 μg의 / ㎖ 보리 코나 졸. 이 조합은 감소 또는 바이러스 증식을 변경할 수 있습니다 세균과 곰팡이 오염을 줄이기 위해 봉사했다.
    6. 직접 습한 환경이 포함 된 가방 안에 젖은 압축을 배치하는 구성 (아메바의 준수를 선호하는 96 웰 플레이트 평평한 바닥에 200 μL의 아메바 단일 층에 각 샘플의 25 μl를 접종하고 습한 환경에서 30 ° C에서 부화 )의 증발을 방지하기 위해 판. 이 프리모 문화입니다. 모든 샘플 접종없이 아메바의 두 우물을 남겨; 이는 음성 대조군으로 작용한다. 사흘 동안이 프리모 문화를 품어.
    7. 사흘 첫 번째 접종, 하위 문화 모든 현미경 관찰하지 않고 상기 한 바와 같이 신선한 아메바에 프리모 문화 판 후. 프리모 배양과 동일한 조건 하에서 3 일 동안 새로운 플레이트를 인큐베이션.
    8. 배양이 세 번째 일 후와 동일한 방법으로 최종 배양을 수행전자 primo- 및 하위 문화. 이틀 동안 최종 문화를 품어. 그런 다음 검출로 진행합니다.
  2. 자동 유동 세포 계측법에 의해 용해의 검출
    참고 : 흐름과 함께 시각 장애인의 문화는 세포 계측법 분리의 이전 표준 시스템 다르다. 그것은 더 민감한 정밀하고 자동화합니다. 검출 목적을 위해, 우리는 높은 속도 및 현미경 관찰없이 용해를 검출하기 위해 개발 된 새로운 기술을 적용 하였다. 이 기술은 검사 샘플 유리하고 이전 기술보다 더 나은 감도를 가지고있다. 7-9
    1. 용해를 검출하는 최종 공동 배양 96 웰 플레이트를 사용한다.
    2. 세포 계측기의 전원을 켜고 제조 업체의 프로토콜에 따라 낮은 소음을 얻기 위해 깨끗하고 세정주기를 실행합니다.
    3. 높은 처리량 샘플러 사이토 자동으로 96 웰 플레이트에서 샘플을로드하고 accordin 40 분 이내에 완전히 자동화 된 수집을 수행하는 흐름과 결합 (HTS)을 실행제조 업체의 프로토콜 g.
    4. 다음과 같이 HTS를 설정 : 샘플 볼륨을 150 μl를, 볼륨 50 μl를 혼합 속도 (180), 혼합 (5)의 수를 혼합, 각 시료 400 ㎕를 사이에 세척 볼륨, 속도 2.5 μL / 초, 기록 된 이벤트 만의 수를 흐른다.
    5. 게이트에 제 위해 아메바 인구 최종 공동 배양 마이크로 플레이트의 음성 대조군 웰을 평가하고 그 물리적 특성에 따라 이러한 셀 호스트의 비율을 결정한다. 균일 한 아메바 인구와 파편과 소음에 해당하는 낮은 이벤트의 두 번째 인구를 가지고해야합니다.
      참고 :이 게이팅 절차는 앞으로 산란에 의해 예상 크기에 의해 하나의 세포에서 세포 내 파편과 덩어리를 구분합니다. 정확하게 최상의 게이팅 방법을 이용하여 각각의 인구의 비율을 결정하는 것이 중요하다. 이 비율은 원생 동물의 많은 유형을 사용하는 경우 특히, 다를 수 있습니다, 그래서 그것은 negativ을 가지고 항상 중요하다샘플의 나머지 기준 인구로서 사용될 수있는 전자 제어.
    6. 취득 샘플을 클릭하여 게이트를 시작합니다.
    7. 10,000 건의 이상 이벤트의 수를 기록한다.
    8. 화살표를 사용하여 관심있는 아메바 인구 지역화. 이 문을 정의하는 방법이다.
    9. 자동으로 전체 판을 실행 게이팅 후, HTS의 자리를하자 또는 '홈'을 클릭하여 플레이트를 찾습니다. 크기와 구조 매개 변수에 따라 데이터 수집 및 분석을 수행 (각각, FSC (전방 산란)와 SSC (사이드 분산)).
      참고 : 아메바 - 게이트 인구의 손실을 감지하는 아메바 용해에 대한 책임 병원성 에이전트의 존재를 알립니다. 바이러스 감염과 연관된 원충 용해 분석기에 의해 게이트와 신뢰성있는 음성 대조군으로 사용 된 것과 같은 비 - 감염된 인구 비교 아메바 인구의 50 %를 용해하는 임의로 설계 임계 값이 검출된다.
3. 용해 감지 후 새로운 균주 특성

  1. 예비 염색 자이언트 바이러스의 존재를 공개
    1. 유동 세포 계측법에 의해 용해 감지 한 후, 나머지 아메바을 중단하는 용해 공동 문화를 피펫. 그런 다음 직접 10 분 동안 800 XG에서 현탁액의 50 μl를 cytocentrifuge.
    2. 원심 분리 후, 순수 메탄올 용액과 슬라이드를 고정한다. 블루 에오신 / 아주르 및 DAPI 염색 상업적 빠른 염색을 이용하여 슬라이드를 얼룩과 바이러스 공장의 존재를 확인하기 위해 1000 배의 배율에서의 광학 현미경 하에서 관찰한다.
      1. 빠른 염색 들어, 제 에오신 용액에 슬라이드를 뛰어 후 인산 완충 용액으로 45 초 동안 슬라이드 린스 마지막 6 초 블루 아주르를 포함하는 제 2 고정 용액에 슬라이드 급락에 직접 전달하고, (4 초간 3 회 반복) pH가 7.2. 다음 observati로 진행, 실온에서 건조 슬라이드를 남겨주세요에.
      2. DAPI 염색, 보증금 고정 건조 슬라이드 상에 DAPI 상업 원액의 15 μl를하십시오. 빛으로부터 보호는 관찰로 진행합니다.
  2. 전자 현미경
    1. 슬라이드의 제 1 식별 한 후, 배양 상청을 전자 현미경으로 관찰 거대 바이러스의 존재를 평가한다.
    2. 예금 글로우 방전 그리드 상에 긍정적 인 샘플의 5 μL. 실온에서 약 20 분 동안 기다립니다.
    3. 거기에 10 초 동안 1 %의 몰리브덴 산 암모늄의 작은 방울을주의 깊게 그리드와 보증금을 건조시킵니다. 5 분 동안 건조 그리드를 남겨주세요.
    4. 200 keV의에서 현미경을 전자로 이동합니다.
    5. 홀더에 그리드를 배치; 현미경으로 홀더를 소개합니다. 해당 아이콘을 클릭하여 진공 개요를 확인합니다. 닫기 밸브는 스폿 사이즈 5에서 관찰을 시작하고, X 25,000의 배율.
    6. ImageJ에 또는 직접를 사용하여 거대한 바이러스를 측정취득 화면에있는 현미경의 측정 도구를 사용하여 현미경 LY.
      주 : 약 200 nm의 캡시드 크기로 Faustovirus 그룹으로 샘플을 분류.
  3. 분자 생물학
    주 :이 확인 후, 분자 생물학 시험 전자 현미경 하에서 동일한 캡시드의 크기 및 모양을 갖는다 Marseillevirus에서 Faustovirus를 구별하기 위해 확인에 중요한 있었다 동일한 호스트 특이성을 갖고 있지 않는다. Marseillevirus이 Vermamoeba에 성장하지 수 있으며, Faustovirus이 Vermamoeba 날짜에 실패 같은 가시 아메바와 같은 다른 아메바에 성장하는 모든 시도에 따라 다릅니다. 설계 및 Reteno 등의 작품에 나열된 특정 프라이머 / 프로브 시스템의 응용 프로그램입니다. 바이러스 유전자의 증폭 및 염기 서열을 통해 새롭게 절연 바이러스보다 정확한 예비 분류 할 수 있었다.
    1. 전의제조사의 프로토콜에 따라 자동 추출 시스템을 사용하여 배양 양성 샘플에서 요로 DNA.
    2. Reteno 등의 설명에 따라 PCR은 열 순환기를 사용하여 실시간을 수행합니다. 19
    3. 증폭에 사용 된 동일한 프라이머를 사용하여 시퀀스. DNA 지시 RNA 폴리머 라제 서브 유닛 1 유전자를 대상으로 프라이머를 사용 Fstv_S2F 5'-CCA GGA의 CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(앞으로) 및 Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC는 AGT TAA A-3'(역)와 Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA 프로브.

4. 바이러스 생산, 정제 및 게놈 시퀀싱

  1. 엔드 포인트 희석 복제에 대한 하나의 바이러스 아메바 문화를 배양.
  2. 제조 : PYG 30 ㎖, 10 Vermamoeba의 vermiformis ㎖의 이미 작은 플라스크에 웰로부터 전송 절연 바이러스 5 ㎖를 함유하는 20 플라스크를 준비한다.
  3. 완료 될 때까지 30 ° C에서 품어아메바의 용해. 모든 아메바가 용해 될 때까지 거꾸로 광학 현미경으로 매일 관찰한다.
  4. 완전 용해 후,받는 사람에 모든 플라스크를 풀. 파편을 제거하기 위해 0.45 μm의 필터로 필터링.
  5. 75 분 동안 89,800 XG에서 초 원심 분리하여 정제를 시작합니다. 원심 분리를 시작하기 전에 튜브의 무게를 조정해야합니다.
  6. 원심 분리 후, 흡인 각 튜브의 상등액을 제거하고 원심 분리를 반복하기 전에, 보정에 사용 된 것과 동일한 부피 PAS의 펠릿을 다시 일시.
  7. 이와 같이, 상층 액을 제거하고 인산 완충 식염수 1 ㎖ (PBS)의 모든 펠릿을 다시 일시.
  8. (0.22 μm의 필터로 여과 PBS 100ml에 수크로오스 27.5 g)의 25 % 슈 크로스를 이용하여 생성 된 바이러스를 정제.
    1. 자당의 8 mL 및 바이러스 현탁액 2 ㎖를 사용합니다. 1 시간 15 분 동안 89,800 XG에 원심 분리기. PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. -80 ° C에서 보관하십시오.

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결과

이 원고에서 공부 시스템은 두 개의 새로운 Faustoviruses을 분리하여 개념의 증거를 검증. 테스트 (70) 샘플, 용해의 두 에피소드는 우리의 신뢰할 수있는 음성 대조군 대조적으로 검출되었다. 용해에 대한 음성 대조군은 86 % 아메바 인구가 포함되어 있습니다. 대조적으로, 긍정적 인 샘플 (세인트 피에르 드 Meyzoargues에 대한 ST1)와 (라 시오타 샘플 9 LC9)는 게이트 아메바의 급격한 감소를 보였다; 아메바의 60 % 이상이 파편의 가장 높은 비율로 용해시켰다. 우리의 방법의 검출 단의이 강력한 결과를 그림 1에 표시됩니다. 에오신 / 블루 아주르와 DAPI 염색도 2에 도시 된 아메바 내부 바이러스 공장의 존재를 확인했다. 전자 현미경은 정 이십 면체의 캡시드와 Megavirales의 전형적인 모습을 보여 크기가 200 나노 미터, 및 부족 원 섬유 (그림 3).

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토론

Faustovirus이 ASFV에 가까운 새로운 Megavirales 가족의 첫 번째 구성원이 될 수 있다는 가능성을 먼저 Reteno 등., (19)에 의해 제안했지만 약간의 차이는 여전히 구별 할 수있다. Faustovirus이 Asfarviridae 가족에 가입해야할지 대신 새로운 추정 바이러스 제품군을 형성할지 여부를 명확 나타납니다. 이 문제는 추가 조사, 그 형태의 특히보다 포괄적 인 특성, 숙주 범위, 복제주기 및 유전자 레퍼토리가 필요합니다. 더 Faustovirus 유전자형을 위해 팬 - 게놈을 확장하고 더 나은이 바이러스 그룹 또는 가족의 기원과 친척을 이해하기에 격리되어야한다. 우리가 사용하는 기술은 우리가이 잠재적 인 새로운 가족의 새로운 구성원을 분리 계속할 수있었습니다. 이 기술은 잘 검출하는 농축 단계의 역할을 약간 수정 공 배양 기술과 결합된다. 후 데이터의 취득을위한 유동 세포 계측법에 의해 요구되는 시간샘플 ndreds 이전 표준 공존 배양 시스템에 비해 중요...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 인정할 말이 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
LSR FORTESSA 세포분석기 BD 바이오사이언스프랑스 649225B4
TECNAI G2 F20FEI독일 5027/11
광학 도립 현미경leica 프랑스72643
DNA 추출Qiagen EZ1 고급 XL 추출 로봇프랑스 L106A0452
PCR Cycler CFX96Bio radFrance785BR06298
PYG 매체, PAS, 기아 매체자체 실험실 생산 마르세유 URMITEx
아메바 균주 CDC-19ATCCFrance50237
플레이트CellstarFrance655180
PCR 재료, 프라이머. eurogentecFrancePrimers
그리드가 있는 유리 슬라이드 10에 인용되었습니다.미국H899871441F
Eosin/blue Azur-Hemacolor stainMerck milipore 프랑스111955,6,57,109468
진공 구동 필터Thermo scientific프랑스BPV4550 / 20170115
인산염 완충 식염수Thermo Fisher scientific 프랑스 제10010-023
DAPI 염색라이프 테크놀로지스 프랑스 D1306 (영어
사이토스핀 4 세포원심분리기Thermo Fisher ScientificFrance10522013JT184-31
Single cytology tunnelBiomedical polymers inc.프랑스BMP-cyto-S50
탄소 그리드 유로메덱스프랑스 FCF400NI
암모늄 몰리브데이트VWR 국제 프랑스 21276185
플라스크 SARSTEDT, 독일,
833911 0.22 μ M 필터 밀렉스 밀리포르 프랑스SE2M229104
초원심분리기 Sorval WX 80Thermo scientific프랑스9102448
급류 필터NalgeneFrance450-0020
년는 호)

참고문헌

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