방법 논문

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

DOI:

10.3791/54106

⸱

2016년 7월 23일

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다. siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

초록

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프리온 질환은 정상적인 세포 프리온 단백질(PrPC)이 PrPRes라고 하는 비정상적인 단백질 분해효소 내성 이성질체로 잘못 접혀서 발생합니다. 야생 동물 개체군에서 프리온 질병의 출현과 인간의 건강에 대한 위협이 증가함에 따라 이러한 질병에 대한 치료법을 찾기 위한 노력이 증가했습니다. 최근 연구에서는 감염성 PrPRes 이성질체를 억제하거나 정상적인 세포 프리온 단백질을 하향 조절할 수 있는 수많은 항프리온 화합물이 발견되었습니다. 그러나 이러한 화합물의 대부분은 뇌 조직에서 PrPRes 형성을 효과적으로 억제하기 위해 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않고, 신경 세포 PrPC를 특이적으로 표적으로 하지 않으며, 종종 너무 독성이 강하여 동물 또는 인간 피험자에게 사용할 수 없습니다.

우리는 siRNA가 혈관 내에서 전달되고 신경 세포 PrPC를 표적으로 하는지 여부를 조사했습니다. 이 보고서는 두 개의 siRNA 리포솜 전달 매개체를 생산하고 PrP siRNA를 포장하여 신경 세포에 전달하는 프로토콜을 설명합니다. 두 가지 리포솜 전달 매개체는 1) 양이온 리포좀(LSPC)을 사용한 복합 siRNA 리포좀 제형과 2) 양이온 또는 음이온 리포좀(PALETS)을 사용한 캡슐화된 siRNA 리포좀 제형입니다. LSPC의 경우, 음전하를 띤 siRNA는 양이온성 리포좀에 정전기적으로 결합되어 있습니다. 양전하를 띤 펩타이드(RVG-9r[광견병 바이러스 당단백질])를 복합체에 첨가하여 혈액뇌장벽(BBB)을 가로질러 중추신경계(CNS)의 아세틸콜린을 발현하는 리포솜-siRNA-펩타이드 복합체(LSPC)를 특이적으로 표적으로 합니다. PALETS(펩타이드, 리포솜 캡슐화 치료용 siRNA)의 경우, 양이온성 및 음이온성 지질은 PrP siRNA에 의해 재수화되었습니다. 이 절차는 양이온 또는 음이온 리포솜 내에서 siRNA를 캡슐화합니다. 다시 말하지만, RVG-9r 뉴로펩타이드는 리포좀에 결합되어 중추신경계에 대한 siRNA/리포좀 복합체를 표적으로 삼았습니다. 이러한 제형을 사용하여 PrP siRNA를 AchR 발현 뉴런에 성공적으로 전달하고 CNS에서 뉴런의 PrPC 발현을 줄였습니다.

서론

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프리온은 중추 신경계에 영향을 미치는 심각한 신경 퇴행성 질환이다. 프리온 질병은 PRP 해상도라는 감염 체에 의해 정상 세포 프리온 단백질 PRP C의 미스 폴딩 기인한다. 이 질병은 인간 1-3에서 소 해면상 소에 뇌증, 스크래피 양에, cervids 만성 소모성 질환, 및 크로이츠 펠트 - 야콥병 등 종의 다양한 영향을 미친다. 프리온은 시냅스 손실 시작하고, 공포 화하기 위해 진행 신경 퇴행, 신경교 증, 신경 세포의 손실 및 플라크 침착을 일으킬. 결국, 4 개인 동물 /의 죽음의 결과로. 수십 년 동안, 연구자들은 늦추거나 프리온 질병의 진행을 중지하는 것을 의미 화합물을 조사 하였다. 그러나 연구진은 성공적인 치료 또는 효과적인 전신 배달 차량 중 하나를 발견하지 않았습니다.

내인성 PRP C 발현 프리온 질병 (5)의 발전에 필요한 입니다. 따라서, 감소 또는 제거 PRP C 표현이 지연 또는 질병의 경감 될 수 있습니다. 몇몇 그룹은 프리온 질환 PRP C 발현 수준의 역할을 조사하기 위해 쥐 뇌 조직에 직접 shRNA를 발현 PRP C의 감소 수준 또는 주입 lentivectors와 트랜스 제닉 마우스를 만들었다. 신경 PRP C의 양을 감소 발견 이들 연구자 프리온 질병의 병리학 시브를 중지 결과 및 6-9 동물의 수명을 연장. 우리는 마우스 신경 모세포종 세포 (10)의 PRP 해상도의 틈새에서 그 PRP C의 siRNA 처리 결과를보고했다. 이러한 연구는 치료의 사용은 작은 간섭 RNA (siRNA의) mRNA의 절단 같이 PRP C 발현 수준을 감소시키기에 충분히 프리온 질병의 진행을 지연시킬 수 있다는 것을 시사한다. 그러나 프리온 질환에 대한 조사 대부분의 치료는 실용적이지 않을 것입니다 방법으로 전달되었다임상있다. 따라서, siRNA의 치료는 CNS에 정맥 내 전달을 대상으로 전신 전달 시스템을 필요로한다.

연구자들은 유전자 치료제에 대한 전달 비히클로서 리포좀의 사용을 연구 하였다. 양이온 및 음이온 모두 지질 리포좀의 형성에 사용된다. 양이온 성 지질 및 DNA / RNA 사이의 전하의 차이를 효율적으로 포장 할 수 있기 때문에 양이온 성 지질 널리 음이온 지질 이상 사용된다. 양이온 성 지질의 또 다른 장점은 그들이 다른 지질 11-14보다 용이하게 세포막을 통과한다는 것이다. 그러나, 양이온 성 지질은 음이온 지질 (13, 14)보다 면역 원성 있습니다. 따라서 연구팀은 리포좀의 지질 음이온에 양이온을 사용하여 이동하기 시작했다. 유전자 치료 제품을 효율적으로 DNA / RNA 분자 15-19 집광 양전하 펩타이드 프로타민 설페이트를 사용하는 음이온 성 리포좀 내로 패키징 할 수있다. 음이온 LIPI 이후DS는 양이온 성 지질가 순환 시간을 증가 할 수 있으며, 더 많은 동물 모델 (13, 14)에서 허용 될 수보다 면역 원성 있습니다. 리포좀은 리포좀에 부착 된 펩티드를 대상으로 사용하여 특정 조직을 대상으로한다. 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체에 결합하는 RVG-9R의 신경 펩타이드는 중추 신경계 17-20로의 siRNA와 리포좀을 대상으로 사용되어왔다.

이 보고서는 프로토콜은 세 가지의 siRNA 전달 비히클을 제조하고, 패키징하고 신경 세포 (도 1)에 siRNA를 전달하기 위해 설명. siRNA를 리포좀 - 펩티드 복합체 (LSPCs)의 siRNA를 리포좀으로 구성되는 펩티드 타겟팅 RVG-9R 정전 기적 리포솜의 외 표면에 부착. 펩티드 RVG-9R 공유 결합 지질 PEG 그룹에 결합하여 siRNA를 리포좀 내에 캡슐화 프로타민 구성되어 치료의 siRNA (PALETS)를 캡슐화 리포솜을 해결. 아래의 방법을 사용하고 LSPCs PALET를 생성S는 PRP C의 siRNA는 치료 또는 실질적으로 프리온 질병 병리학의 발병을 지연시키는 엄청난 약속을 보유하고 신경 세포의 90 %, 최대 PRP C의 발현을 감소시킨다.

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프로토콜

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모든 마우스는 사육과 콜로라도 주립 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 평가 및 실험 동물 관리 국제의 인증 협회의 인증을 받았으며 실험 동물 자원, 유지되었다.

LSPCs 1. 준비

  1. 1 DOTAP (1,2-dioleoyl -3- 트리메틸 프로판) : LSPCs을위한 콜레스테롤의 비율이 1을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀 제제의 경우, DOTAP 2 나노 몰과 (1) 10 ㎖에 콜레스테롤이 나노 몰을 혼합한다.
  2. 흄 후드에서 N 2 가스를 이용하여 메탄올 용액 : 클로로포름 9 ㎖에 증발. 가스없이 밤새 흄 후드에서 용매의 마지막 1 mL로 증발시켰다. 플라스크의 바닥에 얇은 지질막을 관찰한다.
  3. 55 ° C에 10 % 자당 용액의 열 10ml를.
  4. / 천천히 분, 즉 1 ml에 얇은 지질 필름 상에 가열 된 10 % 자당 용액을 붓고 GE 동안ntly 플라스크를 소용돌이. 지질 분자는 겔 액상으로 유지하도록 55 ° C에서 지질과 10 %의 자당과 플라스크를 유지한다. 다중 층 소포 (MLV) 형성에 재수 결과.
  5. 지질은 리포좀 크기를 조정하기 전에 적어도 한 시간 동안 55 ° C에서 재수 할 수 있습니다.
  6. 1.0 μm의 필터 제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립 또는 크기 1.0 μm의 주사기 필터를 사용합니다.
  7. 11 번 압출기에 주사기 중 하나에 가열 된 리포좀 현탁액 1 ML을 추가하고, 두 주사기 사이의 정지를 전달합니다. 서스펜션은 (11)를 통과 한 후 시작 주사기보다 반대 주사기에 있는지 확인하십시오.
  8. 리포좀 크기는 다시 0.45 μm의 다음으로, 0.2 ㎛의 필터는 큰 단일 층 소포 (LUVs)를 생성한다. 쉽게 크기 조정 가열 리포좀 현탁액을 유지합니다.
  9. (4를 20 μM의 200 μL와 4 nmol을 리포좀 현탁액 (200 μM)의 20 μl를 품다nmol을 총)을 실온에서 10 분 동안 siRNA의 스톡 용액.
  10. 500 μM 실온에서 10 분 동안의 siRNA / 리포좀 용액 (40 nmol을 총) 주식 RVG-9R 솔루션의 80 μl를 품어. LSPCs는 가능한 빨리 사용되어야하지만, 제조 후 수 시간이 사용될 수있다. 준비 후 몇 시간 동안 4 ° C에서 보관 LSPCs.

PALETS 2. 준비

  1. 40 : DSPE (1,2- 디스 테아-SN 글리세로 3 phosphoethanolamine) 중 5 몰비 : 콜레스테롤 : DSPE-PEG 또는 DOTAP : 콜레스테롤 : DSPE-PEG PALETS위한 55을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀의 제조를 위해, DSPE 또는 DOTAP 중 2.2 나노 몰, 콜레스테롤의 1.6 나노 몰 및 2 10 ㎖에 DSPE-PEG 0.2 나노 몰을 혼합한다.
  2. 단계 1.1 이상 1.2에 설명 된대로 정확히 리포좀 현탁액을 준비합니다. 1X PBS 10 ㎖에 DSPE 리포좀을 재수 1 ㎖ / 분을 추가하여 75 ℃까지 가열 하였다. 지질가에서 75 ° C에서 재수 할 수 있도록 허용크기 전에 적어도 1 시간.
  3. 크기는 리포좀 현탁액을 정확히 같은 단계 1.6-1.8에서 설명.
  4. 피펫 DOTAP와 DSPE 리포좀 후 단일 사용 씩에 4 nmol을 (200 μM) 리포좀 현탁액의 각 20 μL은 크기되었습니다 및 벤치 탑 동결 건조기 (그림 2)를 사용하여 30 분 동안 동결 건조했다.
  5. 20 μM DSPE PALETS 리포좀으로 캡슐화하는 siRNA를 실온에서 10 분 동안 프로타민 설페이트 26.6 μM 용액 1.4 μL (4 nmol을 총) siRNA의 스톡 용액 200 μl를 부화.
  6. siRNA와의 4 nmol을 원액 200 μL로 PALETS DOTAP 리포좀을 재수 또는 siRNA의 / 프로타민 용액 201.4 μL와 DSPE PALETS 리포좀을 재수. RT에서 10 분 동안 리포좀 / siRNA의 용액을 인큐베이션.
  7. 두 DOTAP 및 DSPE PALETS위한 리포좀 / siRNA의 용액에 60 mM의 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 용액 10 μL를 추가한다.
  8. 모두 DOTAP와 DSPE PALETS의 리포좀 / siRNA의 용액에 150 mM의 N 히드 록 (설포-NHS) 용액 10 μl를 추가합니다.
  9. RT에서 2 시간 동안 siRNA의 / 리포좀 현탁액과 EDC 및 NHS 술포 부화.
  10. 500 μM 실온에서 10 분 동안 솔루션을 가교의 siRNA / 리포좀과 (40 nmol을 총) 주식 RVG-9R 솔루션의 80 μl를 품어.
    참고 : EDC / 설포-NHS가 PEG 지질에 공유 결합에 RVG-9R 수 있습니다. 준비 후 몇 시간 내에 PALETS를 사용합니다. 준비 후 몇 시간 동안 4 ° C에서 보관 PALETS.
  11. PALETS의 siRNA를 캡슐화 효율을 확인하려면 :
    1. 이전과 프로타민 260 nm에서 설정된 분광 광도계 리포좀의 첨가 후에 siRNA의 농도를 측정한다.
    2. 50 kDa의 원심 필터를 사용하여 리포좀 / 캡슐화 된 siRNA의 서스펜션에서 캡슐화 된 siRNA를 필터링합니다. 20 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
    3. 농도 측정봉입 여액 siRNA를 260 nm에서 분광 광도계를 사용하여 잔류 물로 캡슐화 된 siRNA의 농도.

3. LSPCs 또는 PALETS와 마우스를 주입

  1. 혈관을 팽창하기 위해 가열 램프에 5 ~ 10 분 동안 쥐를 노출.
  2. 2-3 %의 이소 플루오 란 / 산소와 마우스를 마취하여 주입 전에 주입시 5-10 분 흐른다. 동물이 더 이상 보행과 호흡이 발가락 핀치를 수행하여 감속 때 마취를 확인하지 않습니다. 꼬리 정맥에 액세스하기 위해 후면 또는 측면에 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  3. / 지우기 70 % EtOH로 꼬리 뿌려 26 G 인슐린 주사기를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥에 LSPCs 또는 PALETS 300 μL를 주입. 꼬리 정맥에 주입 말단 시작하고 정맥이 붕괴 또는 파열 경우 근위 이동합니다.
  4. 이 흉골 드러 누움을 유지 때까지 깨끗한 새장에 마우스를 놓습니다. 모 두지 마십시오완전히 회복 될 때까지 다른 케이지 동료와 함께 사용합니다. 마우스는 5 ~ 15 분에 복구해야합니다. 이들은 가열 패드 또는 회복이 오래 걸리는 경우 체온을 유지하기위한 가열 램프 아래에 배치 될 수있다. 마우스는 과열에 대한 보호하기 위해 면밀히 모니터링해야한다.
  5. 마취 기운이 떨어지기 보장하기 위해 주사 후 동물 몇 시간을 모니터하고 치료에는 부작용이 없습니다. LSPCs 또는 PALETS은 최소 24 시간 동안 순환 할 수 있습니다.

유동 세포 계측법을 통해 단백질 발현 4. 분석

  1. 15 분 동안 20 % CO 2 유량 쥐를 안락사.
  2. 가위를 사용하여 마우스의 피부와 두개골을 멀리 절단하여 뇌의 반 반구를 해부하다. 껍질 멀리 반 거리에 집게 나 가위의 끝 부분을 사용하여 두개골에서 뇌의 반구.
  3. FACS 완충액 2.5 mL로하여 40 ㎛의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 각 마우스에서 뇌 눌러 반 구체 (1X; 주사기의 플런저 페트리 접시에 PBS, 1 % 소 태아 혈청, 10 mM의 EDTA).
  4. FACS 버퍼의 추가 2.5 ml의 셀 스트레이너와 페트리 접시를 씻어. 얼음에 15 ml의 원뿔 관에서 단일 세포 현탁액을 넣습니다.
  5. 피펫 350 x g에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 5 ㎖ 단일 세포 현탁액 100 ㎕. FACS 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포 펠렛을 버린다. 5 분 동안 350 XG 스핀. FACS 버퍼의 또 다른 1 ㎖로 반복합니다. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  6. (1) 100 ㎕의 세포를 품어 : FACS 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖ 쥐 항 - 마우스의 Fc 블록 (100) 희석을 얼음에 30 ~ 60 분. 펠렛 단계 4.5로 세포를 씻어. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  7. 30 ~ 60 분 동안 얼음에 FACS 버퍼에 7 % 마우스 혈청에서 마우스 PRP C에 대해 20 μg의 / ㎖ 형광 항체 100 ㎕의 세포를 품어. 펠렛 단계 4.5로 세포를 씻어. 세포 현탁액을 유지얼음 에다가요.
  8. 펠릿 1 분간 적혈구 용해 완충액 1 ㎖ (1X PBS 155 mM의 NH 4 CL, 12 mM의 NaHCO3을 0.1 mM의 EDTA)으로 세포를 재 - 보류. 단계 4.5에서와 같이 펠릿은 FACS 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  9. 앞서 설명한 바와 같이 (10) 플로우 사이토 미터를 사용하여 C PRP 발현을 분석한다. 게이트는 총 세포 집단에서 세포를 살고 있습니다. 게이트 PRP C + 라이브 세포 집단에서 세포 MFI (평균 형광 강도)를 결정합니다.

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결과

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음이온 PALETS 내의 siRNA의 캡슐화의 효율성을 증가시키기 위해, siRNA의 프로타민을 혼합 하였다. 1 (그림 3A) : 1 2 : siRNA를위한 최선의 프로타민의 농도를 결정하기 위해, siRNA를 1에서, 프로타민의 서로 다른 농도로 혼합 하였다. 프로타민을 사용하지 않고 음이온 성 리포좀에 60~65% siRNA의 캡슐화 효율이 있었다. 프로타민과 샘플 : 1 ~ 1.5 : 1에서 siRNA의 몰비 1 (133-266 nm의)는 80~90%의 siRNA를 캡슐화를했다. 1.5 위의 어금니 비율 : 1의 siRNA / 프로타민 단지의 침전 결과. 이 침전 단지는 음이온 성 리포좀으로 캡슐화되지 않았다. siRNA의 프로타민에 첨가 후에 의한 희석에 대한 siRNA의 농도에 약간의 저하가 존재 하였다; 그러나, 프로타민 농도의 첨가 (도 3b) 한 후 안정적이었다. 50 kDa의 필터, siRN...

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토론

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이 보고서는 효율적으로 CNS에의 siRNA를 전송이 표적 전달 시스템을 만들 수있는 프로토콜을 설명합니다. 중추 신경계에의 siRNA를 전달하는 이전 방법은 뇌, 대상의 siRNA의 정맥 주사, 또는 비 대상 리포좀의 siRNA 복합체의 정맥 주사에​​ 직접 siRNA를 /의 shRNA 벡터를 주입 포함되어 있습니다. 중추 신경계로의 siRNA / shRNA를 벡터의 주입은 목적 단백질의 발현 수준의 감소를 야기 않는다. 그러나, siRNA를 /의 shRNA는 CNS를 통해 자유롭게 확산되지 않습니다. 또한, 이러한 주사는 인접한 신경 조직 6-9 손상. 타겟팅 된 siRNA의 정맥 내 주사는 표적 단백질의 감소를 초래한다. 그러나, siRNA의 대부분은 혈액 단백질 (20)에 의해 분해된다. 마지막으로, 단핵 식세포 시스템 (21) 간 열화 내에 포획 된 siRNA의 불특정의 siRNA를 리포좀 복합체 결과 정맥 내 주사. siRNA의 전달상기 차량 LSPCs 및 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CSU 감염병 중개 연구 교육 프로그램(ID:TRTP) 및 NIH 연구 보조금 프로그램(R01 NS075214-01A1)의 자금 출처에 감사드립니다. 단클론 항체 PRC5를 사용해 주신 Telling lab에 감사드립니다. 또한 DOTAP 리포좀에 대해 감사드리며, 리포솜 생성에 대한 전문 지식을 공유해 주신 Dow 연구소에도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DOTAP 지질Avanti 지질890890
콜레스테롤Avanti 지질700000
DSPEAvanti 지질850715
DSPE-PEGAvanti 지질880125
클로로포름Fisher ScientificAC268320010
메탄올EMD Millipore113351
N2 가스AirGas
SucroseFisher ScientificS5-500
압출기Avanti Lipids610023
1.0, 0.4 및 0.2 μ m 필터Avanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
프로타민 설페이트Fisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980일회용
분주 Sulfo-NHSThermo Scientific24510분주
40 μ m Cell StrainerFisher Scientific08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc blockBD Pharmigen553141
Anti-PrP 항체 (PRC5)독점 - PRC

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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