이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다. siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
프리온 질환은 정상적인 세포 프리온 단백질(PrPC)이 PrPRes라고 하는 비정상적인 단백질 분해효소 내성 이성질체로 잘못 접혀서 발생합니다. 야생 동물 개체군에서 프리온 질병의 출현과 인간의 건강에 대한 위협이 증가함에 따라 이러한 질병에 대한 치료법을 찾기 위한 노력이 증가했습니다. 최근 연구에서는 감염성 PrPRes 이성질체를 억제하거나 정상적인 세포 프리온 단백질을 하향 조절할 수 있는 수많은 항프리온 화합물이 발견되었습니다. 그러나 이러한 화합물의 대부분은 뇌 조직에서 PrPRes 형성을 효과적으로 억제하기 위해 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않고, 신경 세포 PrPC를 특이적으로 표적으로 하지 않으며, 종종 너무 독성이 강하여 동물 또는 인간 피험자에게 사용할 수 없습니다.
우리는 siRNA가 혈관 내에서 전달되고 신경 세포 PrPC를 표적으로 하는지 여부를 조사했습니다. 이 보고서는 두 개의 siRNA 리포솜 전달 매개체를 생산하고 PrP siRNA를 포장하여 신경 세포에 전달하는 프로토콜을 설명합니다. 두 가지 리포솜 전달 매개체는 1) 양이온 리포좀(LSPC)을 사용한 복합 siRNA 리포좀 제형과 2) 양이온 또는 음이온 리포좀(PALETS)을 사용한 캡슐화된 siRNA 리포좀 제형입니다. LSPC의 경우, 음전하를 띤 siRNA는 양이온성 리포좀에 정전기적으로 결합되어 있습니다. 양전하를 띤 펩타이드(RVG-9r[광견병 바이러스 당단백질])를 복합체에 첨가하여 혈액뇌장벽(BBB)을 가로질러 중추신경계(CNS)의 아세틸콜린을 발현하는 리포솜-siRNA-펩타이드 복합체(LSPC)를 특이적으로 표적으로 합니다. PALETS(펩타이드, 리포솜 캡슐화 치료용 siRNA)의 경우, 양이온성 및 음이온성 지질은 PrP siRNA에 의해 재수화되었습니다. 이 절차는 양이온 또는 음이온 리포솜 내에서 siRNA를 캡슐화합니다. 다시 말하지만, RVG-9r 뉴로펩타이드는 리포좀에 결합되어 중추신경계에 대한 siRNA/리포좀 복합체를 표적으로 삼았습니다. 이러한 제형을 사용하여 PrP siRNA를 AchR 발현 뉴런에 성공적으로 전달하고 CNS에서 뉴런의 PrPC 발현을 줄였습니다.
서론
프리온은 중추 신경계에 영향을 미치는 심각한 신경 퇴행성 질환이다. 프리온 질병은 PRP 해상도라는 감염 체에 의해 정상 세포 프리온 단백질 PRP C의 미스 폴딩 기인한다. 이 질병은 인간 1-3에서 소 해면상 소에 뇌증, 스크래피 양에, cervids 만성 소모성 질환, 및 크로이츠 펠트 - 야콥병 등 종의 다양한 영향을 미친다. 프리온은 시냅스 손실 시작하고, 공포 화하기 위해 진행 신경 퇴행, 신경교 증, 신경 세포의 손실 및 플라크 침착을 일으킬. 결국, 4 개인 동물 /의 죽음의 결과로. 수십 년 동안, 연구자들은 늦추거나 프리온 질병의 진행을 중지하는 것을 의미 화합물을 조사 하였다. 그러나 연구진은 성공적인 치료 또는 효과적인 전신 배달 차량 중 하나를 발견하지 않았습니다.
내인성 PRP C 발현 프리온 질병 (5)의 발전에 필요한 입니다. 따라서, 감소 또는 제거 PRP C 표현이 지연 또는 질병의 경감 될 수 있습니다. 몇몇 그룹은 프리온 질환 PRP C 발현 수준의 역할을 조사하기 위해 쥐 뇌 조직에 직접 shRNA를 발현 PRP C의 감....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 마우스는 사육과 콜로라도 주립 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 평가 및 실험 동물 관리 국제의 인증 협회의 인증을 받았으며 실험 동물 자원, 유지되었다.
LSPCs 1. 준비
- 1 DOTAP (1,2-dioleoyl -3- 트리메틸 프로판) : LSPCs을위한 콜레스테롤의 비율이 1을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀 제제의 경우, DOTAP 2 나노 몰과 (1) 10 ㎖에 콜레스테롤이 나노 몰을 혼합한다.
- 흄 후드에서 N 2 가스를 이용하여 메탄올 용액 : 클로로포름 9 ㎖에 증발. 가스없이 밤새 흄 후드에서 용매의 마지막 1 mL로 증발시켰다. 플라스크의 바닥에 얇은 지질막을 관찰한다.
- 55 ° C에 10 % 자당 용액의 열 10ml를.
- / 천천히 분, 즉 1 ml에 얇은 지질 필름 상에 가열 된 10 % 자당 용액을 붓고 GE 동안ntly 플라스크를 소용돌이. 지질 분자는 겔 액상으로 유지하도록 55 ° C에서 지질과 10 %의 자당과 플라스크를 유지한다. 다중 층 소포 (MLV) 형성에 재수 결과.
- 지질은 리포좀 크기를 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
음이온 PALETS 내의 siRNA의 캡슐화의 효율성을 증가시키기 위해, siRNA의 프로타민을 혼합 하였다. 1 (그림 3A) : 1 2 : siRNA를위한 최선의 프로타민의 농도를 결정하기 위해, siRNA를 1에서, 프로타민의 서로 다른 농도로 혼합 하였다. 프로타민을 사용하지 않고 음이온 성 리포좀에 60~65% siRNA의 캡슐화 효율이 있었다. 프로타민과 샘플 : 1 ~ 1.5 : 1에서 siRNA의 몰비 1 (133-266 nm의)는 80~90%의 siRNA를 캡슐화를했다. 1.5 위의 어금니 비율 : 1의 siRNA / 프로타민 단지의 침전 결과. 이 침전 단지는 음이온 성 리포좀으로 캡슐화되지 않았다. siRNA의 프로타민에 첨가 후에 의한 희석에 대한 siRNA의 농도에 약간의 저하가 존재 하였다; 그러나, 프로타민 농도의 첨가 (도 3b) 한 후 안정적이었다. 50 kDa의 필터, siRN.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 보고서는 효율적으로 CNS에의 siRNA를 전송이 표적 전달 시스템을 만들 수있는 프로토콜을 설명합니다. 중추 신경계에의 siRNA를 전달하는 이전 방법은 뇌, 대상의 siRNA의 정맥 주사, 또는 비 대상 리포좀의 siRNA 복합체의 정맥 주사에 직접 siRNA를 /의 shRNA 벡터를 주입 포함되어 있습니다. 중추 신경계로의 siRNA / shRNA를 벡터의 주입은 목적 단백질의 발현 수준의 감소를 야기 않는다. 그러나, siRNA를 /의 shRNA는 CNS를 통해 자유롭게 확산되지 않습니다. 또한, 이러한 주사는 인접한 신경 조직 6-9 손상. 타겟팅 된 siRNA의 정맥 내 주사는 표적 단백질의 감소를 초래한다. 그러나, siRNA의 대부분은 혈액 단백질 (20)에 의해 분해된다. 마지막으로, 단핵 식세포 시스템 (21) 간 열화 내에 포획 된 siRNA의 불특정의 siRNA를 리포좀 복합체 결과 정맥 내 주사. siRNA의 전달상기 차량 LSPCs 및 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
CSU 감염병 중개 연구 교육 프로그램(ID:TRTP) 및 NIH 연구 보조금 프로그램(R01 NS075214-01A1)의 자금 출처에 감사드립니다. 단클론 항체 PRC5를 사용해 주신 Telling lab에 감사드립니다. 또한 DOTAP 리포좀에 대해 감사드리며, 리포솜 생성에 대한 전문 지식을 공유해 주신 Dow 연구소에도 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DOTAP 지질 | Avanti 지질 | 890890 | |
| 콜레스테롤 | Avanti 지질 | 700000 | |
| DSPE | Avanti 지질 | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti 지질 | 880125 | |
| 클로로포름 | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| 메탄올 | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 가스 | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 압출기 | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4 및 0.2 μ m 필터 | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| 프로타민 설페이트 | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | 일회용 |
| 분주 Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | 분주 |
| 40 μ m Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP 항체 (PRC5) | 독점 - PRC |
참고문헌
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell<....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
