이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

의 게놈 편집

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54113

⸱

2016년 6월 20일

 ,  , 
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

이 논문에서

요약

유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다.

초록

진화적 변화의 기저에 있는 유전자의 대립유전자를 식별하는 것은 진화가 어떻게 그리고 왜 일어나는지를 이해하는 데 필수적입니다. 이를 위해 최근의 많은 연구는 다양한 종에서 형질의 진화를 위한 후보 유전자를 식별하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 최근까지만 해도 흥미로운 후보 유전자를 기능적으로 검증하는 것은 어려운 일이었습니다. 최근에 개발된 유전 공학 도구는 광범위한 유기체의 특정 유전자를 조작하는 것을 가능하게 합니다. 이 기술을 진화론적으로 관련된 유기체에 적용하면 진화에서 후보 유전자의 역할에 대한 전례 없는 통찰력을 얻을 수 있을 것입니다. Astyanax mexicanus (A. mexicanus)는 지표 거주 형태와 동굴 거주 형태를 모두 가진 물고기 종입니다. 동굴 거주 형태의 여러 독립적 인 계통은 조상 표면 물고기에서 진화했으며, 이들은 서로 간섭하고 지표 물고기와 간섭하여 동굴 특성의 유전 적 기초를 설명 할 수 있습니다. A. mexicanus는 여러 형질을 담당하는 후보 유전자를 식별하기 위한 연결 분석을 포함하여 여러 진화 연구에 사용되었습니다. 따라서 A. mexicanus는 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위한 게놈 편집 응용 프로그램에 이상적인 시스템입니다. 여기에서는 전사 활성화제와 유사한 효과기 뉴클레아제(TALEN)를 사용하여 표면 A. mexicanus의 유전자를 돌연변이시키는 방법을 보고합니다. A. mexicanus에서 TALEN을 사용한 게놈 편집은 색소 유전자에서 돌연변이를 생성하는 데 활용되었습니다. 이 기술은 또한 A. mexicanus의 동굴 형태에서 진화한 다른 여러 형질에 대한 후보 유전자의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

특성 진화의 유전 적 기초를 이해하는 것은 진화 생물학의 중요한 연구 목표입니다. 상당한 진전이 특성의 진화를 기본 궤적을 확인하고 (실시 예 1-3)이 유전자좌에서의 후보 유전자를 정확히 파악을했다. 그러나, 기능적으로 이들 유전자의 역할 특성의 진화 연구에 사용 된 많은 유기체 도전 유지하고 테스트하는 것은 현재 유전자 취급 용이하지 않다. 게놈 편집 기술의 출현은 크게 유기체의 광범위한 유전 조작성 증가했다. 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs) 및 클러스터 정기적 interspaced 짧은 반복 팔린 드롬 (CRISPRs)은 (실시 예 4-11) 유기체의 여러 유전자 ​​표적 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다. 진화론 관련 시스템에 적용이 도구는, 진화 생물 학자들이 진화의 유전 적 기초를 공부하는 방법을 혁신 할 수있는 잠재력을 가지고.

아 스티 아낙 스의 mexicanus는 두 가지 형태로 존재하는 물고기의 종입니다. 강에 사는 표면 형태 (표면 생선)과 여러 동굴 주거 형태 (cavefish) A. mexicanus의 cavefish은 (12에서 검토) 표면의 물고기 조상에서 진화. cavefish의 인구는 학교 행동의 감소, 증가 침략, 자세와 과식증 (13) 먹이의 변화로 동작 입맛과 두개골 neuromasts, 변화의 수를 증가, 감소 또는 색소 침착의 손실, 눈의 손실을 포함하여 특성의 숫자를 진화 -19. Cavefish 표면 물고기 interfertile, 그리고 유전자지도 실험은 동굴 특성 1,20-26에 대한 궤적 및 후보 유전자를 식별하기 위해 수행되었다. 일부 후보 유전자가 다른 종 (21)의 모델 생물 또는 과발현 27 또는 과도 최저 U에 의해, 세포 배양 1,19에서 동굴의 특성에 기여하는 기능 역할에 대해 테스트되었습니다A.에 morpholinos 28 노래 mexicanus. 그러나, 이러한 각각의 방법은 한계가있다. A. 이러한 유전자의 돌연변이 대립 유전자를 생성 할 수있는 능력 mexicanus는 cavefish의 발전에 그 기능을 이해하는데 중요하다. 따라서, A. mexicanus는 게놈 편집 기술의 응용 프로그램에 대한 이상적인 후보 유기체이다.

여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을 간략하게 설명 mexicanus TALENs를 사용하여. 이 방법은 표현형에 대한 관심 (29)의 유전자 안정 돌연변이 물고기의 라인을 분리하기위한 모자이크 주입 설립자 물고기를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물의 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지침에 따라이었고, 아이오와 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 메릴랜드 대학에 의해 승인되었다.

1. TALEN 디자인

  1. TALEN 디자인 웹 사이트에 입력 원하는 대상 시퀀스. (예 : https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). 입력 스페이서 / 반복 배열 길이를 선택.
    1. "순서"라고 표시된 상자에 게놈 시퀀스를 복사합니다.
    2. "사용자 지정 스페이서 / RVD 길이를 제공한다"탭에서 스페이서 길이와 배열의 길이를 선택합니다.
      참고 : 15 염기쌍의 스페이서 길이 잘 15-17 일의 배열의 길이를 반복하고 조립이 덜 복잡합니다.
  2. TALEN 쌍을 선택합니다. 독특한 제한 효소 부위를 중심으로 설계 TALEN 쌍은 제한 효소에 의해 소화 유전자형이 허용PCR 산물.
  3. 디자인 된 프라이머에는 Primer3 (30-32)과 같은 웹 사이트를 이용하여 TALEN 대상 부위 주변의 게놈 영역을 증폭한다. 제한 효소 유전자형하면 설계 프라이머 번만 제한 효소 부위를 포함하는 영역을 증폭한다. 이 지역이 증폭되고 A에 존재하는 다형성을 확인하기 TALEN 건설에 앞서 염기 서열을하는 것이 좋습니다 mexicanus 실험실 인구는 미세 주입에 사용되는.

합니다 (TALEN 키트 프로토콜에서 수정) 2. TALEN 조립 33, 34

자세한 내용 및 문제 해결을 위해 프로토콜 34을 참조하십시오.

  1. 준비하고 제조업체의 지침에 따라 TALEN 키트에서 필요한 플라스미드 시퀀스.
  2. 반응 A와 B에 대한 1 반응이 반복 변수 diresidues (RVDS) 1-10과 반응 A의 대상 벡터 pFUS_A는 RVDS를 포함를 11- 포함 # (N-1)과 일을 설정합니다N은 TALEN에 RVDS의 총 개수이다 전자 대상 벡터 pFUS_B 반응 B의 (N-1).
    1. 각 반응에 추가 각 RVD (100 NG / μL), 대상 벡터 (100 NG / μL), 1 ㎕의 BSA I 제한 효소 1 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA) (2 ㎎ / ㎖를 함유하는 각각의 플라스미드 1 μL ) 1 μL 리가 20 μl의 총 부피에 대한 물의 μL 배 리가 버퍼 (X)의 2 μL. 예를 들어, 표 1을 참조하십시오.
      주 : 하프 반응이 또한 사용될 수있다.
    2. 열 순환기의 반응을 놓고 사이클 실행 : 10 배 (37 ° C / 5 분 + 16 ° C / 10 분) + 50 ° C / 5 분 + 80 ° C / 5 분.
  3. 클레아 제와 반응을 품어. 각 반응에 1 ㎕의 25 mM의 ATP 1 ㎕를 클레아를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 반응을 인큐베이션.
  4. 반응을 변환.
    1. 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환.
      참고 : 제 유능한 CELL을 사용할 수있다. 그러나, 낮은 능력을 가진 세포는 식민지의 부족이 발생할 수 있습니다.
      1. 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 다섯 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 품어.
      2. 2 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. Catabolite 억압 (SOC) 슈퍼 최적 배지 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 흔들어.
    2. 접시 스펙 티노 마이신 (50 μg의 / mL)로 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 100 μL, X-gal을 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG). 37 ° C에서 O / N를 성장.
  5. 각각의 반응 2-3 흰색 식민지를 선택하고 프라이머 pCR8_F1 및 pCR8_R1 (표 2)를 사용하여 식민지 PCR에 의해 확인합니다.
    1. 시약의 마스터 믹스를 확인합니다. 예를 들어, 표 3 참조.
    2. 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 스펙 티노 마이신과 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어(50 μg의 / ㎖). 식민지와 튜브에 마스터 믹스 15 μl를 놓습니다.
    3. 다음 PCR 프로그램을 실행 (표 4)
    4. 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 (전체 볼륨을 실행) 확인합니다. 올바른 클론 예상 크기에 밴드뿐만 아니라 비방과 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오.
    5. 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장.
  6. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙.
  7. 순서 pCR8_F1 및 pCR8_R1과 TALEN 순서를 확인합니다. 앞에서 설명한 방법 (35)을 따릅니다.
  8. 시퀀싱에 의해 확인 정확한 클론을 사용하여, 대상 벡터에 A 및 B 벡터를 최종 RVD에서 RVDS를 두어 반응 # 2 (TALEN 키트)를 설치했다.
    1. 반응 2 (표 5)에 대한 믹스를 준비합니다.
      참고 : 하LF 반응이 사용될 수있다.
    2. 열 순환기의 반응을 놓고 다음 프로그램 실행 : 37 ° C / 10 분 + 16 ° C / 15 분 + 37 ° C / 15 분 + 80 ° C / 5 분.
  9. 반응을 변환.
    1. 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환.
      1. 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 열은 42 ℃에서 30 초 동안 세포를 충격.
      2. 얼음에 튜브를 놓습니다. SOC의 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양기에서 튜브를 놓습니다.
    2. 플레이트 암피실린 (100 μg의 / ㎖), X-여자와 IPTG와 LB 플레이트 상에 형질 전환 세포 100 ㎕. 37 ℃에서 O / N 성장
  10. 각각의 반응 1-3 흰색 식민지를 선택하고 식민지 PCR 프라이머의 TAL_F1를 사용 TAL_R2 (표 2)에 의해 확인.
    1. 중합 효소 mastermix 물 및 프라이머의 용액을표 3에 설명했다. 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어. 식민지와 튜브에 용액 15 μl를 놓습니다.
    2. PCR을 프로그램 (표 6)를 실행합니다.
    3. 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 확인합니다. 올바른 클론은 번짐 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오.
    4. 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장.
  11. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙.
  12. 순서 TAL_F1 및 TAL_R2 앞에서 설명한 방법 (35)을 다음과 같이 TALEN 순서를 확인합니다.

TALENs의 3 mRNA의 전사

  1. 37 ° C에서 2 시간 동안 2 μL 골목 I와 순서 검증 된 템플릿의 4 μg의 다이제스트.
  2. 전기 영동에 의해 1.5 % 아가 로스 겔에서 골목 I 소화 플라스미드 2 μL를 실행. 제대로 소화 플라스미드는 하나의 밴드가 표시됩니다.
  3. PCR을 정제 키트 프로토콜 다음 나머지 골목 I-소화 플라스미드를 정제. 용출 전에 세척 용액으로 두 번 세척 하였다. 뉴 클레아 제 무 물 30 μL로 용출.
  4. T3 mRNA의 생산을위한 표준 프로토콜을 따르십시오.
    1. 선형화 된 템플릿의 0.5 μg의를 사용하여 반 반응을 설정합니다 (위의 준비). 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    2. DNase의 (키트에 포함)의 0.5 μl를 추가하고 15 분 동안 37 ° C에서 품어.
  5. 제조업체의 지침에 따라 mRNA의 정화. 30 μL 클레아없는 물에 용출.
  6. mRNA의를 확인하기 위해 전기 영동으로 1.5 % 아가 로스 젤을 실행합니다.
    1. 된 RNase 오염을 제거하고 1.2 % 겔을 제조 제품 겔 청소 장치.
    2. 믹스 1 μL mRNA의 + 4# 181; 리터 클레아없는 물 + 5 ㎕를 glyoxyl 로딩 염료. 30 분 동안 50 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 젤을 실행하기 전에 얼음에 원심 분리기 튜브 짧게과 장소.
  7. 핵산 농도의 정량 방법을 사용하여 농도를 검사하고 -80 ℃에서 분취 량으로 RNA를 저장한다. RNA는 / 냉동 번 이상 해동되지 않도록 나누어지는 크기를 선택합니다.
    참고 : 500 ~ 1,000 NG의 농도 / NL은 일반적으로 얻을 수있다. RNA의 무결성이 유지되는 (밴드보다는 겔상의 스미어이 정한) 저급 RNA 농도를 오랫동안 사용할 수있다.

TALEN의 mRNA 4.를 주입 아 스티 아낙 스 mexicanus 배아

  1. 주입을위한 도구를 준비합니다.
    1. 페트리 접시에 생선 물 (중탄산 나트륨과 바다 소금의 pH 7.4와 전도성 700 μS와 에어컨 물)을 1.2 % 아가로 오스를 부어 주사 판을 따르십시오. 물고기 우물을 만들기 위해 돌기 금형 (플라스틱 조각을 배치접시 안에 계란). 4 ° C에서 아가로 오스가 강화했다 금형 및 저장소를 제거합니다. 금형에 대한 자세한 내용은 36를 참조하십시오.
    2. 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 빼냅니다.
      참고 : 적절한 바늘 길이가 주사 중요하다. 너무 긴 바늘은 주사를 너무 유연 할 것입니다. 당기 바늘을위한 프로토콜은 바늘을 당겨하는 데 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 적절한 바늘의 일례의 장비를 위해, 우리는 길이 5~6cm이다 바늘을 당긴다.도 1에 도시 한 고장시 약 0.011 mm의 선단부 외경을 가지고있다. 그러나 바늘은 개구 폭을 결정한다 (단계 4.3.4)를 교정해야한다. 바늘을 인상하기위한 예시적인 프로그램 표 7에서 확인할 수있다.
    3. 달걀이 통과하는 개구부가 충분히 큰 있도록 피펫을 위반하여 배아 전송에 유리 피펫을 준비합니다. 깨진 끝날 때까지 불꽃더 이상 날카로운 없다.
      참고 : A. 작업 할 때 유리 피펫과 유리 그릇을 사용하는 것이 중요합니다 mexicanus 계란과 배아는 끈적하고 플라스틱을 준수하므로.
  2. 1 셀 단계 계란을 수집합니다.
    1. 품종 A. mexicanus 표준 프로토콜 (37)을 다음과 같습니다.
      참고 : 예를 들어, 물고기가 14 불을 유지하는 경우 : 10 어두운주기 및 소등로하고 ZT14 등으로 ZT0와 Zeitgerber 시간 (ZT)를 사용하여, ZT15과 ZT19 사이에 우리의 표면 물고기의 산란. 정확한 산란 시간은 각 실험실에 대해 결정해야합니다.
    2. 이전 짝짓기 3-4 일 동안 물고기를 과식과 신선한 물에 물고기를 배치하여 산란을 유도한다. 온도 2 °의 F를 올립니다. 참고 : 우리의 초기 수온이 약 74 ° F입니다.
    3. 1 세포 단계에서 달걀을 얻기 위해 15 분마다 확인, 어둠 속에서 표면 물고기 알을 수집합니다. 계란의 수백 표면 물고기의 한 쌍에서 얻을 수 있습니다.
    4. 수집유리 그릇에 계란 플라스틱 표면에 부착 방지하고 정렬 현미경으로 알을 관찰하고 단일 셀입니다 계란을 수집하여 사전 주입에 1 세포 단계에서 배아를 분리 할 수​​ 있습니다. (pH와 전도도 처리 된 성인 물고기가 보관되어있는 탱크의 물) 신선한 시스템 물에 계란을 유지합니다.
  3. TALEN의 mRNA를 주입한다.
    1. 독성과 효율 TALEN 쌍마다 다를으로 주입을위한 최적의 농도를 측정하는 총 mRNA를 (상기 한 쌍의 각 TALEN 동일한 양)의 상이한 양을 주입한다. 400-800 페이지입니다 전체의 mRNA의 농도를 주입하여 시작합니다. 희석하고 1.5 NL를 분사 목적의 mRNA 농도를 결합한다.
    2. 로드 바늘의 뒷면에의 mRNA를 희석시키고 마이크로 주사기에 바늘을 연결합니다.
    3. 집게를 사용하여 바늘 브레이크.
    4. 바늘을 보정합니다. 예를 들어, 10 회 배출 및 마이크로 모세관의 결과 강하를 수집합니다. 10 × 100 일회용 1.081, L 32 mm 마이크로 모세관, 드롭 1.5 NL / 1 주입 0.5 mm에 마이크로 모세관을 작성해야합니다. 필요에 따라 분사 시간 및 압력을 조정한다.
    5. 하나의 셀에 바늘을 삽입하고 mRNA를 주입. 하지 노른자로, 셀에 직접 mRNA를 주입한다.
    6. 유리 그릇에 주입 된 배아를 수집합니다. 23 ~ 25 ℃에서 배아를 유지합니다. 죽은 태아 정기적으로 주입 다음 처음 몇 일 동안 (흐린 및 불규칙한 모양이 될 배아)를 제거합니다. 제어 (uninjected) 및 주입 판에서 죽은 변형 배아의 기록 번호.
      참고 : 증가 된 mRNA의 농도가 증가 독성과 태아의 기형 / 죽음으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 효율성에 비해 독성은 주입의 mRNA의 최고 농도를 결정하기 위해 균형을 이루어야한다.

5. 표현형의 설립자 물고기와 TALEN 효율성 평가

  1. 기관 동물 프로토콜에 따라 배아를 희생.
    참고 : 우리는 안락사빠른에 의한 배아 얼음에 냉각.
  2. 전송 피펫을 사용하여 0.8 μl의 PCR 스트립 튜브로 배아를 수집합니다.
    참고 : 유전자형 개별 배아 또는 태아의 풀을 수행 할 수 있습니다.
  3. DNA의 압축을 풉니 다.
    1. 100 ㎕의 50 mM의 수산화 나트륨 (NaOH)와에 장소 배아는 4 ° C까지 다음 냉각, 30 분 동안 95 ° C에서 품어.
    2. 1 M 트리스 - 염산 pH가 8 1/10 일 볼륨 (10 μL)를 추가합니다.
  4. 단계 1.3에서 디자인 된 프라이머를 (샘플 프로토콜에 대한 표 8 및 9 참조)를 사용하여 영역에 PCR을 수행합니다. 개별 배아를 들어 DNA 1 μL는 PCR 반응에 충분하다.
  5. 적절한 제한 효소로 생성 된 PCR 생성물을 소화하고 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔을 실행.
    1. 예를 들면, 주입 된 배아의 oculocutaneous 백색증 2 (oca2) 궤적 유전형에 0을 추가하여 제한 효소 BSR I을 사용하여 PCR 생성물을 소화2 시간 동안 65 ° C에서 배양 완성 된 PCR 반응의 12.5 μL에 BSR 직접 I의 0.5 μL. 소화되지 않은 및 겔에 소화 제품을 실행합니다. 제한 효소 저항 밴드 (즉, 소화되지 않는 밴드) TALEN에 의한 돌연변이가 존재한다 (그림 2) 있음을 나타냅니다.
  6. (선택적) 이전 29 바와 같이 각 밴드의 강도 값을 계산하기 위해 겔 분석 도구를 사용하여 피지 38 겔의 이미지를 분석하여 미가공 생성물의 비율을 측정하여 백분율 돌연변이 비율을 계산한다.
  7. TA는 겔 정제 제한 효소 내성 돌연변이 밴드를 복제하고 클론을 시퀀싱하여 돌연변이 대립 유전자의 순서를 결정합니다.
    1. 젤은 제한이 제조업체의 지침에 따라 내성 돌연변이 밴드 효소 정화. TA는 제조업체의 지침에 따라 밴드를 복제. 식민지를 선택하고 진탕에서 37 ° C에서 1.5 ml의 LB O / N에서 성장부란기.
    2. 제조업체의 지침에 따라 미니 프렙 문화. 염기 서열의 DNA를 보냅니다.
    3. 예컨대 APE 같은 프로그램을 이용하여 야생형 서열에 돌연변이 서열 정렬.
      1. 복사 및 APE 파일에 두 시퀀스를 붙여 넣습니다. "도구"메뉴에서 "정렬 두 시퀀스"도구를 선택합니다.
      2. 드롭 다운 메뉴를 사용하여 두 개의 DNA 시퀀스를 지정합니다.
        참고 : 복제 된 순서의 반대로 보완이 PCR은 클로닝 벡터에 들어갔다 방향에 따라 사용해야 할 수도 있습니다. 서열이 일치하지 않을 경우, "정렬 DNA"상자에서 "계-COM"확인란을 선택 단계를 반복합니다.
  8. 적절한 단계에서 표현형 및 예상 표현형 (29)에 대한 적절한 방법 (예를 들어, 그림 3)를 사용 설립자 물고기를 평가합니다. 표현형의 방법은 protoc를 사용하여 연구원의 대상 유전자의 예상 표현형을 기반으로합니다올.

생식선 전송 6. 화면

참고 : A. mexicanus 4~8개월에서 성적 성숙에 도달.

  1. 야생형 물고기에 성적으로 성숙 설립자 물고기를 교차.
  2. 화면 배아 또는 단계 5.1-5.7의 방법을 사용하여 성인 물고기 (그림 4). 성인 물고기 꼬리의 조각은 마취 다음 잘릴 수 있습니다.
    1. 핀 클리핑 동안 응력을 감소시키기 tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르)의 용액에 침지하여 생선 고기 마취. 핀 클리핑에 따라, 물고기가 민물에 복구 할 수 있습니다. 물고기는 빠르게 회복; 그들은 (일반적으로 수영) 회복 될 때까지 관찰합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

TALEN 쌍 주사 (NHEJ)를 결합 비 상동 단부를 통해 복구 될 수 이중 가닥 나누기 39의 결과 FokI 따라서 도메인의 이량 체화를 특정 DNA 뉴클레오티드에 RVDS 바인딩을 초래한다. NHEJ 자주 삽입 또는 삭제 (삽입과 삭제)에서 발생하는 오류를 소개합니다. 삽입과 삭제가 TALEN 대상 부위 주변의 영역을 증폭하며 TALEN 스페이서 영역 내에서 절단하는 제한 효소로 생성 된 앰플 리콘 절단함으로써 식별 될 수있다. 대립 유전자는 제한 효소에 강한 밴드를 생성 (도 2) 소화되지 제한 효소 표적 서열을 변경 삽입과 삭제를 포함하면서 INDEL없는 대립 소화한다.

TALEN 주사 가능성이 A의 biallelic 유전자 돌연변이가 발생할 수 있습니다...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

커다란 진보는 특성의 전개의 유전 적 기초를 이해 향해 최근에 이루어지고있다. 형질 다수의 진화를 기초 후보 유전자가 확인되었지만, 인해 가장 흥미로운 진화 종의 유전자 취급 용이성의 부족으로 생체 내에서 이들 유전자를 테스트 도전 남아있다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을보고 mexicanus, 종 동굴 동물의 진화를 연구하는 데 사용. 유전자지도는 1,21,23 연구와 후보 유전자 A. 동굴 형태 특성의 진화에 대한 후보 유전자의 숫자를 식별 한 19,40 접근 mexicanus. cavefish 게놈 (41)의 최근 간행물은 동굴 특성의 진화에 대한 후보 유전자를 식별하기위한 추가 강력한 도구를 제공합니다. 이들 후보 유전자의 대부분의 기능을 시험하는 유전자 발현을 감소시키는 기술이 필요하다. 연구를위한 유일한 현재 옵션A의 감소 유전자 발현을 보내고

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 유전학, 개발 및 세포 생물학 및 아이오와 주립 대학의학과 및 NIH 보조금 EY024941 (WJ) 싱거에 의해 투자되었다. 제프리 Essner는 원고에 대한 의견을 제공했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Thermocycler
주입 역
젤 기구
바늘 끌어당기는 사람
Nanodrop
Name 회사카탈로그 번호Comments
Supplies
참고: 우리가 아는 한, 달리 명시
Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents 미생물학 매체: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOHTeknova (Fisher를 통해 주문)50-843-314
스펙티노마이신 디하이드로클로라이드, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
슈퍼 암피실린(1,000x 솔루션)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-useThermo Sci Fermentas Inc (Fisher를 통해 주문)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
페트리 접시Fisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (Fisher를 통해 주문)50-812-203BsaI-HF가 아닌 BsaI를 사용하십시오(Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 프로토콜에 설명된 대로)
제한가 제공되는BSA New England Biolabs
10x T4 리가제 완충액Promega(Fisher를 통해 주문)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega(Fisher를 통해 주문)PRM7123다른 Taq를 사용할 수 있지만 그에 따라 반응을 조정해야 합니다
퀵 ligation kitNew England Biolabs (Fisher를 통해 주문)50-811-728모든 TALEN 어셈블리 반응에 Quick Ligase를 사용합니다
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliInvitrogenC4040-06기타 화학적 역량 세포 또는 수제 역량 세포를 사용할 수 있습니다
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (Fisher를 통해 주문FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNaseEpicentre (Fisher를 통해 주문)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Qiagen 키트는 초기 플라스미드 준비에 사용해야 합니다(Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 프로토콜에 설명된 대로)
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28104
GeneMate LE Quick Dissolve AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac IPromega (Fisher를 통해 주문)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 전사 키트AmbionAM1348M
Rneasy MinElute Cleanup KitQiagen74204
NorthernMax-Gly 샘플 로딩 염료 앰비온 (피셔를 통해 주문)AM8551
EliminaseDecon (피셔를 통해 주문)04-355-32
Fisherbrand 일회용 소다석회 유리 파스퇴르 피펫피셔13-678-6B
표준 유리 모세 필라리세계 정밀 기기1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Femtojet MicroinjectorEppendorf(Fisher를 통해 주문)용 팁E5242956003
수산화나트륨FisherS318-500
Tris baseFisherBP152-1
되지 않는 한 다른 회사의 공급품을 사용할 수 있습니다. 효소.

참고문헌

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105(2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108(2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281(2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823(2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647(2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307(2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

TALENmRNAPCROCA2
의 게놈 편집
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.