유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
진화적 변화의 기저에 있는 유전자의 대립유전자를 식별하는 것은 진화가 어떻게 그리고 왜 일어나는지를 이해하는 데 필수적입니다. 이를 위해 최근의 많은 연구는 다양한 종에서 형질의 진화를 위한 후보 유전자를 식별하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 최근까지만 해도 흥미로운 후보 유전자를 기능적으로 검증하는 것은 어려운 일이었습니다. 최근에 개발된 유전 공학 도구는 광범위한 유기체의 특정 유전자를 조작하는 것을 가능하게 합니다. 이 기술을 진화론적으로 관련된 유기체에 적용하면 진화에서 후보 유전자의 역할에 대한 전례 없는 통찰력을 얻을 수 있을 것입니다. Astyanax mexicanus (A. mexicanus)는 지표 거주 형태와 동굴 거주 형태를 모두 가진 물고기 종입니다. 동굴 거주 형태의 여러 독립적 인 계통은 조상 표면 물고기에서 진화했으며, 이들은 서로 간섭하고 지표 물고기와 간섭하여 동굴 특성의 유전 적 기초를 설명 할 수 있습니다. A. mexicanus는 여러 형질을 담당하는 후보 유전자를 식별하기 위한 연결 분석을 포함하여 여러 진화 연구에 사용되었습니다. 따라서 A. mexicanus는 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위한 게놈 편집 응용 프로그램에 이상적인 시스템입니다. 여기에서는 전사 활성화제와 유사한 효과기 뉴클레아제(TALEN)를 사용하여 표면 A. mexicanus의 유전자를 돌연변이시키는 방법을 보고합니다. A. mexicanus에서 TALEN을 사용한 게놈 편집은 색소 유전자에서 돌연변이를 생성하는 데 활용되었습니다. 이 기술은 또한 A. mexicanus의 동굴 형태에서 진화한 다른 여러 형질에 대한 후보 유전자의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
특성 진화의 유전 적 기초를 이해하는 것은 진화 생물학의 중요한 연구 목표입니다. 상당한 진전이 특성의 진화를 기본 궤적을 확인하고 (실시 예 1-3)이 유전자좌에서의 후보 유전자를 정확히 파악을했다. 그러나, 기능적으로 이들 유전자의 역할 특성의 진화 연구에 사용 된 많은 유기체 도전 유지하고 테스트하는 것은 현재 유전자 취급 용이하지 않다. 게놈 편집 기술의 출현은 크게 유기체의 광범위한 유전 조작성 증가했다. 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs) 및 클러스터 정기적 interspaced 짧은 반복 팔린 드롬 (CRISPRs)은 (실시 예 4-11) 유기체의 여러 유전자 표적 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다. 진화론 관련 시스템에 적용이 도구는, 진화 생물 학자들이 진화의 유전 적 기초를 공부하는 방법을 혁신 할 수있는 잠재력을 가지고.
아 스티 아낙 스의 mexicanus는 두 가지 형태로 존재하는 물고기의 종입니다. 강에 사는 표면 형태 (표면 생선)과 여러 동굴 주거 형태 (cavefish) A. mexicanus의 cavefish은 (12에서 검토) 표면의 물고기 조상에서 진화. cavefish의 인구는 학교 행동....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물의 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지침에 따라이었고, 아이오와 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 메릴랜드 대학에 의해 승인되었다.
1. TALEN 디자인
- TALEN 디자인 웹 사이트에 입력 원하는 대상 시퀀스. (예 : https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). 입력 스페이서 / 반복 배열 길이를 선택.
- "순서"라고 표시된 상자에 게놈 시퀀스를 복사합니다.
- "사용자 지정 스페이서 / RVD 길이를 제공한다"탭에서 스페이서 길이와 배열의 길이를 선택합니다.
참고 : 15 염기쌍의 스페이서 길이 잘 15-17 일의 배열의 길이를 반복하고 조립이 덜 복잡합니다.
- TALEN 쌍을 선택합니다. 독특한 제한 효소 부위를 중심으로 설계 TALEN 쌍은 제한 효소에 의해 소화 유전자형이 허용PCR 산물.
- 디자인 된 프라이머에는 Primer3 (30-32)과 같은 웹 사이트를 이용하여 TALEN....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
TALEN 쌍 주사 (NHEJ)를 결합 비 상동 단부를 통해 복구 될 수 이중 가닥 나누기 39의 결과 FokI 따라서 도메인의 이량 체화를 특정 DNA 뉴클레오티드에 RVDS 바인딩을 초래한다. NHEJ 자주 삽입 또는 삭제 (삽입과 삭제)에서 발생하는 오류를 소개합니다. 삽입과 삭제가 TALEN 대상 부위 주변의 영역을 증폭하며 TALEN 스페이서 영역 내에서 절단하는 제한 효소로 생성 된 앰플 리콘 절단함으로써 식별 될 수있다. 대립 유전자는 제한 효소에 강한 밴드를 생성 (도 2) 소화되지 제한 효소 표적 서열을 변경 삽입과 삭제를 포함하면서 INDEL없는 대립 소화한다.
TALEN 주사 가능성이 A의 biallelic 유전자 돌연변이가 발생할 수 있습니다.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
커다란 진보는 특성의 전개의 유전 적 기초를 이해 향해 최근에 이루어지고있다. 형질 다수의 진화를 기초 후보 유전자가 확인되었지만, 인해 가장 흥미로운 진화 종의 유전자 취급 용이성의 부족으로 생체 내에서 이들 유전자를 테스트 도전 남아있다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을보고 mexicanus, 종 동굴 동물의 진화를 연구하는 데 사용. 유전자지도는 1,21,23 연구와 후보 유전자 A. 동굴 형태 특성의 진화에 대한 후보 유전자의 숫자를 식별 한 19,40 접근 mexicanus. cavefish 게놈 (41)의 최근 간행물은 동굴 특성의 진화에 대한 후보 유전자를 식별하기위한 추가 강력한 도구를 제공합니다. 이들 후보 유전자의 대부분의 기능을 시험하는 유전자 발현을 감소시키는 기술이 필요하다. 연구를위한 유일한 현재 옵션A의 감소 유전자 발현을 보내고
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 유전학, 개발 및 세포 생물학 및 아이오와 주립 대학의학과 및 NIH 보조금 EY024941 (WJ) 싱거에 의해 투자되었다. 제프리 Essner는 원고에 대한 의견을 제공했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| 주입 역 | |||
| 젤 기구 | |||
| 바늘 끌어당기는 사람 | |||
| Nanodrop | |||
| Name | 회사 | 카탈로그 번호 | Comments |
| Supplies | |||
| 참고: 우리가 아는 한, 달리 명시 | |||
| Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents 미생물학 매체: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (Fisher를 통해 주문) | 50-843-314 | |
| 스펙티노마이신 디하이드로클로라이드, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| 슈퍼 암피실린(1,000x 솔루션) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher를 통해 주문) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| 페트리 접시 | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (Fisher를 통해 주문) | 50-812-203 | BsaI-HF가 아닌 BsaI를 사용하십시오(Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 프로토콜에 설명된 대로) |
| 제한 | 가 제공되는 | BSA New England Biolabs | |
| 10x T4 리가제 완충액 | Promega(Fisher를 통해 주문) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega(Fisher를 통해 주문) | PRM7123 | 다른 Taq를 사용할 수 있지만 그에 따라 반응을 조정해야 합니다 |
| 퀵 ligation kit | New England Biolabs (Fisher를 통해 주문) | 50-811-728 | 모든 TALEN 어셈블리 반응에 Quick Ligase를 사용합니다 |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | 기타 화학적 역량 세포 또는 수제 역량 세포를 사용할 수 있습니다 |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher를 통해 주문FERER0451 | ||
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Fisher를 통해 주문) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Qiagen 키트는 초기 플라스미드 준비에 사용해야 합니다(Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 프로토콜에 설명된 대로) |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Fisher를 통해 주문) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 전사 키트 | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly 샘플 로딩 염료 | 앰비온 (피셔를 통해 주문) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (피셔를 통해 주문) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand 일회용 소다석회 유리 파스퇴르 피펫 | 피셔 | 13-678-6B | |
| 표준 유리 모세 필라리 | 세계 정밀 기기 | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Femtojet Microinjector | Eppendorf(Fisher를 통해 주문) | 용 팁E5242956003 | |
| 수산화나트륨 | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
참고문헌
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
