방법 논문

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

DOI:

10.3791/54121

⸱

2016년 7월 6일

 ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 2'- 알킨의 합성 방법은 포스 표준 화학을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 디옥시리보 핵산 (DNA) 가닥을 변성 보여준다. 올리고 뉴클레오티드 후 합성 구리 촉매 클릭 화학 제를 사용하여 두 개의 새로운 광 안정성 시아닌 염료로 표시되어 있습니다. 모두 도너와 억 셉터 염료의 합성을 설명하고, 세 개의 연속 단계로 수행된다. 이들은 혼성화에 접할 때 주변 구조와 같은 DNA,이 두 염료의 에너지 전달을 겪는다. 따라서, 두 개의 단일 가닥의 DNA 가닥의 어닐링 형광 색의 변화에​​ 의해 가시화된다. 이 색상 변화는 형광 분광 특징뿐만 아니라, 직접적으로 휴대용 자외선 (UV) 램프를 이용하여 관찰 할 수있다. 이중 색상 형광 판독 값의 개념은 이러한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 분자 이미징 특히 기재된 포위한 우수한 툴을 만든다tostable 염료가 사용된다. 이에 따라, 이미징 프로브 광표백은 방지되고, 생물학적 과정은 긴 시간주기 동안 실시간으로 관찰 할 수있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분자 이미징은 살아있는 세포 내에서 생물학적 과정을 이해하기위한 기본적인 기술을 나타냅니다. 1-3 화학적 생물학적 응용 프로그램에 대한 형광 핵산 ​​기반 프로브의 개발이 확대 연구 분야가되고있다. 이 형광 프로브는 세포 이미징에 적합한 도구가 될 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 첫째, 적용 염료가 높은 양자 수율과 형광을 전시한다, 큰 스톡스 '변화는, 그리고 가장 중요한 것은, 높은 photostabilities는 생체 내 이미징의 장기를 허용합니다. 그리고 둘째로, 그들은 신뢰할 수있는 형광 판독을 표시해야합니다. 종래 발색단 소광-시스템은 형광 농도의 간단한 변경에 의해 하나의 형광 색의 판독에 기초한다. (4)이 접근법으로 인해 세포 내 성분 또는 낮은 신호대 잡음비의 형광도에 위양성 혹은 위음성 결과의 위험을 부담 때문에 다른 COM에 의해 원치 않는 담금질에ponents. 4

최근 개의 상이한 발색단을 사용하여 이중 형광 색 판독을 표시 "DNA 신호등"의 개념을보고 하였다. 5-6 개념은 형광 변화 셉터 염료 도너 염료의 에너지 전달 (ET)에 기초 컬러 (도 1 참조). 이는보다 안정적인 판독이 가능하여 형광 이미징 프로브를위한 강력한 도구를 제공합니다. 형광 염료를 가진 올리고 뉴클레오티드 라벨링 두 가지 방법에 의해 달성 될 수있다. 염료는 상응하는 개질 된 포스 빌딩 블록을 사용하여 고상에서 화학적 DNA 합성 동안 혼입 될 수있다. (7)이 메소드는 표준 포스 탈 보호 조건 하에서 안정한 염료로 제한된다. 대안으로, 사후 합성 수정 방법은 올리고 뉴클레오티드 화학에 설립되었다. 여기, 우리는 우리의 새로운 사진 중 하나의 합성을 보여테이블 에너지 전달 쌍 8,9 및 아 지드와 알킨 (CuAAC) 사이의 구리 촉매 1,3- 사이클로을 사용하여 DNA의 후 합성 라벨. (10)

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 합성에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 일반적으로, 실험실 코트를 입고 안전 안경, 장갑 등의 유기 화학 실험실에 필요한 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오.

염료의 1. 합성

. 두 염료가 반응 동일한 유형으로 합성 할 수있다 (2) 이러한 반응의 개요를 보여줍니다 :합니다.

  1. 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1)
    1. 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a)
      1. 녹여 466 mg의 4- 피 콜린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉.
      2. 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
      3. 그 후, RT로 냉각 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거 할 수있다.
      4. 잔류 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다.
      5. 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다.
    2. 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움의 합성 (도 2a, b) 단계
      1. 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 376 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다.
      2. 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
      3. 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다.
      4. 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다.
      5. 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다.
      6. 썩어을 사용하여 감압하에 용매를 제거진 증발기 갈색 오일로서 생성물을 얻었다.
    3. 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2a를 참조하면, 단계 c)
      1. 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 1.52 g의 탄산 칼륨 및 2.70 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다.
      2. 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다.
      3. 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다.
      4. 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다.
      5. 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 감압하에 회전 증발기를 사용하여 50 ℃에서 용매를 제거한다.
    4. 커플 링 1- (3- 아지도 프로필) -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) (도 2a, 단계 d)
      1. 아르곤 하에서 수분의 배제에 따라 작업 할 수 있습니다. Dissol환류 응축기를 갖춘 플라스크 둥근 바닥 20 ㎖에 4 ㎖의 에탄올 중의 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움 및 48 mg의 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드를했습니다.
      2. 4 시간 동안 80 ° C로 0.07 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다.
      3. RT로 냉각 할 수 있습니다.
      4. 여과하여 생성 된 침전물을 수집하고, 디 에틸 에테르로 3 회 세척 하였다.
      5. 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다.
      6. 침전물을 결합합니다.
  2. 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 2)
    1. 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2b는, 단계 a)
      1. 녹여 715 mg의 4- 메틸 퀴놀린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉.
      2. 열16 시간 동안 85 ° C이다.
      3. 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다.
      4. 남은 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다.
      5. 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다.
    2. 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 b)
      1. 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 333 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다.
      2. 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
      3. 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다.
      4. 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다.
      5. 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다.
      6. 용매 유를 제거파인더 갈색 오일로서 생성물을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 압력을 감소시켰다.
    3. 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 c)
      1. 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 0.996 g의 탄산 칼륨 및 1.77 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다.
      2. 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다.
      3. 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다.
      4. 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다.
      5. 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거한다.
    4. 1- (3- 아지도 프로필)에 커플 링 -4- (2- (1- 메틸 -2- 프 피닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (도 2b를 참조하면, 단계 d)
      1. 인수에서 작업에 수분의 배제 아래. 플라스크 둥근 바닥 구비 한 20ml에 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움 및 59.7 mg을 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카브 알데하이드 4 ml의 에탄올에 녹여 환류 응축기.
      2. 4 시간 동안 80 ° C로 0.06 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다.
      3. RT로 냉각 할 수 있습니다.
      4. 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집하고 디 에틸 에테르로 3 회 세척한다.
      5. 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다.
      6. 침전물을 결합합니다.

DNA의 가닥 2. 합성

주 : DNA 합성기에서 M. Caruthers (11)에 의해 설명 된 것처럼 DNA 가닥의 합성은 고체상에서 포스 방법을 사용하여 수행된다. 신디사이저의 기능은 합성 절차 전에 테스트하고, 시약 경우 갱신됩니다필요한.

  1. Prearrangements
    1. amidite 희석제 (추가 건조 아세토 니트릴) 1.2 ㎖에 시판되는 2'-O-프로 파르 길 - deoxyuridinephosphoramidite (CU)를 녹인다. 신디사이저의 유리 병에 유리 병에 솔루션을 이동 신디사이저로 조입니다.
    2. 더 아르곤 가스 누출이 없음을 확인 (제조업체의 지침에 따라)는 "누설 테스트"를 수행합니다. 은 "누설 테스트가"실패하면 더 단단히 유리 병에 나사.
    3. 고상 합성 챔버에 연결 튜브를 작성하여 프라임 구리 용액.
    4. 아세토 니트릴로 모든 라인을 씻으십시오.
  2. DNA 가닥의 합성
    1. 제조 업체의 프로토콜의 지시에 따라 DNA 서열과 결합 방법을 입력 연결된 컴퓨터를 사용합니다. CU를 빌딩 블록의 커플 링 공정은 통상 7 펄스를 40 초에 비해 (각 펄스가 16 μL 임) (7) 펄스 168 초 소요빌딩 블록으로서 포스.
    2. 제 1베이스 1 μmol으로 수정 고상과 CPG (제어 세​​공 유리)를 포함하는 열을 탑재 신디사이저로 (DNA 합성은 '5'3에서 수행된다).
    3. DNA의 합성 (11)의 합성을 시작합니다.
  3. 합성 된 DNA 가닥의 정밀 검사
    1. 진공 O의 /의 N에서 합성 된 DNA 가닥과 열을 건조시킵니다.
    2. 열을 열고 반응 유리 병에 CPG를 해제하기 위해 협공을 사용합니다. 올리고 뉴클레오티드를 탈 보호 및 CPG에서 DNA 가닥을 해제 농축 암모니아 수용액의 700 μl를 추가합니다.
    3. 18 시간 동안 50 ° C까지 바이알을 닫고 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 반응 용기에 보안 덮개를 적용하고, 가열.
    4. 30 분 동안 30 ° C에서 감압 (100 밀리바)에서 원심 분리하여 암모니아를 제거합니다.
    5. CPG에서 여과를 시작 원심 분리기 용기를 11,000 XG FO에R 3 분. 상등액을 취하여 0.45 ㎛의 세공 크기를 갖는 원심 분리 장치로 옮긴다. 4 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
    6. 한편 3 분 동안 11,000 XG에 20 초 원심 분리기의 CPG, 소용돌이에 두 번 증류수 300 μl를 추가합니다. 4 분 동안 1,000 XG에서 원심 장치와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 두 번이 세척 절차를 반복합니다.
    7. 0.1 밀리바 25 ° CO / N에서 원심 분리하여 결합 된 수용액에서 물을 제거합니다.

3. "클릭"절차

  1. (0.1 [(1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 - 50 μL 이중 증류수, 나트륨 아스 코르 베이트 용액을 25 μL (물 중 0.4 M), 34 ㎕의 트리스 추가 DMSO의 M /을 tBuOH 3 : 아 지드의 1) 114 μL (0.01 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 및 테트라 키스 17 μL (아세토 니트릴), 구리 (I) 헥사 플루오로 포스페이트 용액 (0.1 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 동결 건조 된 알킨 변성 DNA 샘플이다.
  2. 1.5 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션.
  3. 실온으로 냉각.
  4. 150 μL 나 2 EDTA (물에 0.05 M) 및 10 ML 튜브에 DNA 샘플 및 전송에 450 ㎕의 아세트산 나트륨 (물에 0.3 M)를 추가합니다.
  5. 10 ml의 에탄올 (100 %)를 추가하고 16 시간 동안 -32 ℃에서 보관하십시오.
  6. (15) 1000 XG에 분, 상층 액을 제거하기위한 원심 분리기 용기.
  7. 2 ml의 차가운 에탄올 (80 %)와 DNA-펠렛을 씻으십시오.
  8. 감압 건조 펠렛.

4. HPLC 정제

참고 : 분리하기 전에 DNA 가닥이 HPLC가 제대로 작동하는지 확인, 충분한 용매를 사용할 수 있으며 열은 깨끗합니다. 버퍼 / 아세토 니트릴의 시작 농도 열을 씻어.

  1. HPLC 바이알에 이중 증류수 및 전송의 250 μL의 원유 DNA-펠렛을 녹인다.
  2. 염료 1 및 GRADI 대한 아세토 니트릴의 15 % 0 % 아세토 니트릴 구배로 45 분 HPLC 실행 시작 염료 2의 아세토 니트릴 17 % 0 % 아세토 니트릴의 엔트는 260 나노 미터 (DNA 흡수) 및 459 nm의 (염료 1) 또는 542 nm의 (염료 2)를 확인하여 실행을 모니터링합니다. 두 파장 채널에서 흡수를 보여 그 분수를 수집합니다.
  3. 3- 하이드 록시피 콜린 산 (3HPA) 및 diammoniumhydrogencitrate로 구성된 행렬을 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분석에 의해 오른쪽 대량의 수집 분수를 확인합니다.
    1. 물에 diammoniumhydrogencitrate 용액 (100g / L)를 100 ㎕의 아세토 니트릴과 물의 혼합물을 1 : 1 포화 3-HPA 용액 900 μL를 혼합하여 매트릭스를 준비한다.
    2. 대상의 DNA 프로브의 1-2 μl를 피펫 공기에 건조 할 수 있습니다.
    3. 샘플로 3 HPA는 / diammoniumhydrogencitrate 행렬의 0.2 μl를 추가하고 결정화 될 때까지 섞는다.
    4. MALDI 질량 분석을 수행합니다.
    5. 오른쪽 질량을 전시하는 HPLC의 분수를 결합합니다.
농도의 _title "> 5. 결​​정

주 : 농도는 DNA 염기와 염료의 흡광 계수 (ε 260)에 근거하여 UV / 비스 분광하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정된다.

  1. 이중 증류수 200 μL - 100의 DNA를 녹여.
  2. 자외선은 / 마주 분광 광도계에 DNA 용액 1 μL를 적용합니다.
  3. 260 nm에서 흡광도를 측정한다. 세 번 반복합니다.
  4. 용액의 농도를 계산하는 평균값을 가지고. 흡광 계수의 계산, 전체 DNA 가닥의 ε의 260 나노 미터를 얻기 위해 네 천연베이스 (12)의 ε 260 나노 미터 및 (천연 딘으로 간주) 구입 빌딩 블록 CU의 ε의 260 나노 미터 (12)를 사용한다. 염료 1, 사용 ε의 260 나노 미터 = 10,200 L를 들어 * 몰 -1 * cm -1 염료 2를 사용 ε의 260 나노 미터 = 13,100 L의 * 몰 -1 * cm -1. 흡광 계수 측정 한 흡광도에 기초 램버트 - 맥주의 법칙 다음, 용액의 농도를 계산한다. 13

6. 샘플 준비 및 분광학

  1. 단일 가닥 샘플의 제조
    1. 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼에서 수정 된 DNA1 및 DNA2 각각 2.5 μm의 솔루션을 개별적으로 1 ml의 pH는 7을 준비합니다.
  2. 이중 가닥 샘플의 제조
    1. 반응 용기에 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 NAP 나 버퍼, pH가 7 DNA2 2.5 DNA1의 μM 2.5 μM을 함유 한 용액 1 ㎖를 준비한다.
    2. 10 분 동안 90 ° C에 안전 캡과 열로 뚜껑을 고정합니다. 그리고 난방을 끄고 RT O / N로 냉각 할 수 있습니다.
  3. 흡광
    주 : 형광 스펙 대 여기 파장을 결정하려면troscopy 흡수​​ 스펙트럼이 기록됩니다.
    1. 단일 가닥 측정
      1. 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼, pH는 7이 포함 된 빈 측정을 기록합니다.
      2. 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 준비된 용액을 전송하고 흡수를 기록한다. 빈 데이터에 대한 측정을 수정합니다. 염료의 흡수 최대 값을 결정한다.
      3. DNA2에 대해 반복합니다.
  4. 형광 분광법
    1. 단일 가닥 측정
      1. 200 mM의 NaCl을, 내가 버퍼 50 mM의 낮잠을 포함하는 빈 측정을 기록, 산도 = 7; 염료 (1)의 여기 파장을 사용.
      2. 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 용액을 전송.
      3. 형광 스펙트럼을 기록합니다.
    2. 두 가닥 측정
      1. 석영 유리 큐벳에 이중 가닥 용액을 전송.
      2. 염료 (1)의 여기 파장을 이용한 형광 스펙트럼을 기록한다.
  5. 시각화 실험
    주의 : 적절한 눈 보호는 눈에 자외선 손상을 방지하기 위해 착용한다!
    1. , 기록 된 스펙트럼이 표시 무엇의 더 나은 이해를 얻을 휴대용 자외선 램프 (그림 5)와 큐벳을 조사합니다. 이중 가닥 DNA에 하나의 형광 색상의 변화를 관찰한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 4에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥 DNA의 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록한다.

기록 된 흡수 스펙트럼 (그림 4 오른쪽) 단일 가닥 DNA1 (염료 1) 및 단일 가닥 DNA2 (염료 2)에 대한 546 nm의 465 nm에서 쇼 흡수 최대의 λ 최대. 어닐링 DNA1_2 (염료 1 염료 2) 469 nm 내지 567 nm의 모두에서 최대 값을 보여줍니다. 모두 최대 흡수는 장파장 이동, 염료 1 4 nm의 이러한 작은 분광 변화가 이중 나선 DNA 구조 내에서 염료 사이의 엑시톤 상호 작용의 결과 염료 2에 대한 21 나노을 보여줍니다.

하나를위한 607...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 아 지드 수정 형광 염료에 의해 CuAAC 통해 DNA 후 합성 레이블의 전체 과정을 보여줍니다. 이 염료 및 알킨 변성 DNA의 합성뿐만 아니라, 표시 순서를 포함한다.

염료의 합성은 네 단계를 따른다. 모든 제품은 그들의 양전하로 비교적 간단 침전에 의해 수득 할 수 있고 시간 소모적 컬럼 크로마토 그래피는 필요하지 않다. 중앙 커플 링 단계 이전에 아 지드 기능의 도입은 네 대신 5 개의 연속 반응 단계에 염료의 합성을 단축. 1,3- diiodopropane 대신 알킬화 공정은 아펠 반응 및 요오 작용기로 수산기 함수 변환 다음 Finkelstein 반응을위한 3 iodopropanol의 적용을 회피 하였다. 게시 된 절차에 비해 이러한 변화는 우리가 더 큰 규모와 시간의 짧은 기간에 염료를 합성 할 수 있습니다.

인가 염료는 우수한 광 안정성 아니라 고상 DNA 합성 및 후 처리시 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

독일 연구 협회 (DFG, 1386 / 17-1 워싱턴)에 의해 재정 지원 연구 교육 그룹 (DFG에 의해 자금) GRK 2039 및 KIT는 기꺼이 인정한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강>합성< / 강>
4-Picoline시그마 Aldrich239615
1,3-Diiodopropane시그마 Aldrich238414
AcetonitrileFisher Scientific10660131HPLC 등급
에틸 아세테이트Fisher Scientific10456870기술 등급
아지드 나트륨시그마 알드리치71290p.a. 등급
디클로로메탄피셔 사이언티픽10626642기술 등급
인돌-3-카르복스알데히드;98%ABCRAB112969
탄산칼륨, 99+%아크로스424081000
디메틸카보네이시그마 알드리치517127
N,N-디메틸포름아미드, 99.8 %, 분자체Acros348435000
황산 나트륨Bernd Kraft12623.46
에탄올, 99.5 %397690010
피 페리 딘, 99 %147181000
DiethyletherFisher Scientific10407830기술 등급
2- 페닐 인돌 -3- 카르 복스 알데히드; 97 %ABCRAB125050
4-메틸퀴놀린ABCRAB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 핵산 합성제Applied Biosystems -
DMT-dA(bz) 포스포라미다이트시그마 알드리치A111081
DMT-dT 포스포라미다이트시그마 알드리치
DMT-dG(dmf) 포스포라미다이트시그마 알드리치G11508
DMT-dC(bz) 포스포라미다이트시그마 알드리치C11108
DNA 합성을 위한 아미다이트 희석제시그마 알드리치L010010
DNA 합성을 위한 초순수 아세토니트릴시그마 알드리치L010400
캡 A시그마 알드리치L840000
Cap BSigma AldrichL850000
CPG dT 칼럼 1.0  &마이크로; 두더지Proligo 시약T461010
CPG dA(bz) 열 1.0  &마이크로; 두더지Proligo 시약A461010
CPG dG(ib) 열 1.0  &마이크로; 두더지Proligo 시약G461010
CPG dC(bz) 칼럼 1.0  &마이크로; 암C461010Proligo 시약
 Fluka Analytical318612
원심 장치 나노셉 0.45  &마이크로; mPallODGHPC34
5-(벤질티오)-1H-테트라졸(활성제)시그마 알드리치75666
2'-O-프로파르길 데옥시우리딘포스포라미다이트화학 유전자ANP-7754
workup
vacuum concentratorChrist
clicking procedure
테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이시그마 알드리치346276
아세트산 나트륨시그마 알드리치S2889
(+)-L-아스코르브산나트륨 시그마 알드리치A7631
EDTA 다이소듐 염시그마 알드리치E5134
TBTA-리간드 - -문헌 절차에 따라 합성1
HPLC
HPLC-systemShimadzu
MALDI-Biflex-IV 분광계Bruker Daltonics
LC-318 C18 columnSupelcosil via Sigma Aldrich58368
농도 결정
ND 1000 분광 광도계nanodrop
sample 준비 및 분광학
Cary 100 BioVarian
Fluoromax-3 형광계Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.
트 T111081모니아 (수용액)몰 트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

DNA

관련 논문