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방법 논문

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

10.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54127

⸱

2016년 7월 4일

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

이 논문에서

요약

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

초록

이온 채널 게이팅은 단백질 운동의 자극 주도 오케스트레이션으로, 닫힌 상태, 열린 상태 및 둔감한 상태 사이의 전환으로 이어집니다. 이러한 전이의 기본은 단백질의 고유한 유연성이며, 이는 막 지질 조성에 의해 비판적으로 조절됩니다. 채널 기능의 구조적 기초를 더 잘 이해하려면 생리학적 막 환경에서 단백질 역학을 연구해야 합니다. EPR(Electron Paramagnetic Resonance) 분광법은 기능 상태 간의 구조적 전이를 특성화하는 중요한 도구입니다. NMR 및 X선 결정학과 비교할 때 EPR에서 얻은 정보는 본질적으로 해상도가 낮습니다. 그러나 다른 기술과 달리 EPR에서는 단백질의 분자량에 대한 상한이 없고, 샘플 요구 사항이 현저히 낮으며, 더 중요한 것은 단백질이 결정 격자력에 의해 제약되지 않는다는 것입니다. 따라서 EPR은 재구성된 시스템에서 큰 단백질 복합체 및 단백질을 연구하는 데 매우 적합합니다. 이 기사에서는 Gloeobacter violaceus(GLIC)의 원핵생물 양성자 개폐 펜타메릭 리간드 개폐 이온 채널(pLGIC)을 예로 사용하여 부위 지정 스핀 라벨링 및 멤브레인 재구성을 위한 일반적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 채널 역학의 완전한 정량적 특성화를 가능하게 하는 정상 상태 연속파(CW) 및 펄스(이중 전자 전자 공명-DEER) EPR 접근 방식의 조합에 대해 설명합니다.

서론

지난 10 년간, 펜타 머 리간드 관문 이온 채널의 구조 이해 (pLGIC)는 여러 가족 구성원의 고해상도 구조 군중에 의해, 비약적으로 성장했다. 분야에서 현재 발전을 주도하는 중요한 요소는 구조 결정 방법의 원핵 pLGIC 채널 발견, 진핵 생물의 세포막 단백질 발현 1-3 주요 진행됨 4-6 엄청난 돌파구를 포함한다. (7) 이러한 구조가 명확한 합의 제공 pLGIC의 3 차원 구조의 전체적인 보존. 그러나 뒤에 흔적 것 두 가지 주요 영역이 채널 준비의 기능적 특성 및 채널 기능의 기계 론적 설명이다.

게이팅 구조적 변화는 복잡하고, 채널의 길이를 따라 60 Å 거리에 걸쳐 발생하고 이러한 전환을 광범위에 의해 조절되는막 지질. 특히, 음의 지질, 콜레스테롤 및 인지질 pLGIC 8-11의 기능을 조절하는 것으로 나타났다. 채널 기능에서 이러한 지질 성분의 정확한 역할을 알 수없는 남아 있지만, 게이트의 완전한 분자 이해는 그 나라의 환경에서 이러한 채널을 연구 필요합니다. 사이트 감독 스핀 라벨 (SDSL) 및 전자 스핀 공명 (EPR) 분광법은 재구성 시스템에서 단백질 역학 연구를위한 선택의 기술이다. (형광 스펙트럼은 그대로), 이로써 천연 지질 조건 재구성 전장 구조체의 측정이 가능 EPR 분광법은 분자 크기에 의해 제한 (NMR처럼) 또는 시료의 광학 특성 아니다. 이 기술은 매우 민감하고 (피코 몰 범위에서) 상대적으로 낮은 샘플 요구 사항이 있습니다. 이 두 측면은 밀리그램 이상에서 표현하기 어려운 큰 막 단백질 연구에 대한 기술이 적합하다수량.

부위 - 스핀 표지와 함께 EPR 분광법의 사용 웨인 Hubbell의 연구진에 의해 개발되었고, 단백질 종류의 범위를 학습하도록하고있다. 12-24 EPR 데이터 이차 구조를 조사하기 위해 사용 된, 단백질의 변화 형태, 막 - 삽입 깊이 및 단백질 - 단백질 / 단백질 - 리간드 상호 작용.

상기 방법은 부위 - 특이 적 돌연변이 유발에 의해 주목 위치의 시스테인의 치환을 포함한다. 부위 - 특이 적 표지를 보장하기 위해, 시스테인이없는 템플릿을 생성하기 위해 다른 아미노산과 (예., 세린) 천연 시스테인을 대체 할 필요가있다. 이황화 결합 다리를 통해 부착 단백질 (1- 옥실-2,2,5,5- 테트라 메틸 - 피 롤린 Δ3 -3- 메틸) methanethiosulfonate : 지금까지, 가장 인기 스핀 라벨 티올 특정 MTSL이다. 그것의 높은 특이성, (트립토판보다 약간 큰) 비교적 작은 크기, 플렉시에링커 영역의 부 합성,이 스핀 라벨에도 매립 시스테인 우수한 반응성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, 반응성을 극대화하기 위해, 단백질의 표지 반응은 세제 - 가용화 된 형태로 수행된다. 크기 배제 크로마토 그래피에 의한 과잉 자유 스핀 라벨 분리 후, 단백질 또는 리포좀 정의 지질 조성물의 이중층 흉내 낸 시스템으로 재구성된다. 일반적으로, 시스테인 돌연변이가 아니라 단백질의 대부분의 부분에서 허용되고, 스핀 프로브의 상대적으로 작은 크기의 2 차 및 3 차 구조로 최소한의 혼란을 일으키는. 수정이 야생형 기능을 유지하도록하려면 표지 및 재구성 된 채널은 패치 클램프 측정에 의해 공부하실 수 있습니다.

표지 된 기능성 단백질은 다음 본질적으로 정보의 세 가지 주요 유형을 제공 분광 측정을 실시 : linesh에 의해 12,14,15,20,22,23,25-27 스핀 프로브 역학을원숭이 분석; 상자성 이완 에이전트 프로브의 접근성; 거리 분포. 27 EPR 거리는 두 개의 서로 다른 접근 방법에 의해 측정된다. 첫번째는 스핀 라벨 간의 극성 상호 작용에서 발생하는 스펙트럼의 폭이 넓어합니다 (8 - 20 Å 거리 범위) 연속파 (CW) 기술에 기초한다. 거리를 결정하는 데 사용되는 28, 29 번째 펄스-EPR 인 거리 측정 이중 전자 전자 공명 (DEER) 70 Å. 30-34까지 연장 될 수있어서, 상기 스핀 에코 진폭의 진동이 거리와의 거리 분포를 결정하기 위해 분석된다. 여기 스핀 에코는 쌍극 상호 작용의 주파수로 변조된다. 함께, 이러한 파라미터는 단백질 토폴로지 이차 구조 요소 및 단백질 구조적 변화를 결정하기 위해 사용된다.

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프로토콜

1. 부위 특이 적 변이 및 시스테인 돌연변이

  1. 복제와 돌연변이 유발
    참고 : GLIC 야생형 (중량) (35)는 시스테인없는 배경을 만드는 세린으로 변이 된 단일 기본 시스테인 (C27)를 가지고있다. 시스테인 돌연변이는 원하는 위치 36에 시스테인 코돈을 가지고 프라이머를 이용한 부위 특이 적 변이에 의해 시스테인없는 배경에 도입된다.
    1. 10 배 반응 완충액 5 μL, 100 ng의 1 μl를 혼합 / μL 시스테인없는 GLIC 템플릿 DNA (35), 0.5 ㎕를 앞으로 40 μM의 각 및 역방향 프라이머 (36)의 dNTPs (100 밀리미터) 1 μL, 탈 이온수 41 μL . 철저하게 혼합 시료를 몇 번 피펫, 스핀 (6000 RPM) 그리고 마지막으로는 DNA 중합 효소 1 μl를 추가합니다.
    2. 다음 프로토콜에 열 자전거 타는 사람을 설정합니다 :
      1. 4 분 95 ºC에서 변성.
      2. 30 초 95 ºC에서 변성.
      3. 어닐링1 분 55 ºC에서 보내고.
      4. 10 분 68 ºC (킬로바이트 플라스미드 길이 당 약 1 분)에서 신장.
      5. 18 사이클 1.1.2.4 - 반복 1.1.2.2 단계를 반복합니다.
      6. 10 분 68 ºC에서 최종 신장.
      7. 4 ºC에서 온도를 들고
        주 : 소둔 온도가 Tm은 프라이머에 기초하여 계산된다.
    3. , 반응 혼합물에 DpnI 1 μl를 추가 피펫에 의해 철저하게 혼합하고, 1 분 동안 (6000 RPM) 스핀 다운. 37 ° C에서 2 시간 동안 품어.
  2. 변환
    1. 해동 E. 얼음에 대장균 유능한 세포. 나누어지는 30 14 ml의 멸균 변환 튜브에 세포의 μL 및 세포에 소화 DNA 1 μl를 추가합니다. 튜브의 측면에 눌러 섞는다. 얼음에 20 분 동안 품어.
    2. 45 초 동안 42 ºC 물을 욕조에 튜브를 삽입하고 다음 2 분 동안 다시 얼음에 배치합니다. 인큐에서 세포를 400 ㎕를 멸균 SOC 매체를 추가하고 흔들1 시간 37 ºC에서 울란바토르.
    3. 카나마이신 플레이트 (50 μM), 1 % 포도당을 함유하는 LB 플레이트 상에 세포를 100 ㎕. 37 ºC에서 판 O / N을 품어.
    4. 플레이트에서 하나의 식민지를 수확하고 5 ml의 LB / 카나마이신 미디어를 포함하는 O / N 배양에 접종. 인큐베이터 통에서 37 ºC의 문화 O / N (~ 16 시간)을 품어.
    5. minipreparation (37)에 의해 O / N 문화에서 DNA를 추출합니다. 260 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 분광 광도계를 사용하여 DNA의 수율 정량화. 200 NG / μL - 농도는 ~ 100이어야한다. 표준 재조합 DNA 시퀀싱 전략 (38, 39)에 의한 돌연변이의 존재를 확인합니다.

2. GLIC의 발현 및 정제

  1. 변환
    1. GL를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 - (200 NG / μL ~ 100)로 1 μL C43 적격 세포를 30 ㎕의 변환, 섹션 1.2에 기술 된 절차에 따라인간 리노 바이러스 (HRV) -3C 프로테아제 절단 부위와 함께 IC (35) (단계 1.2.5에서) (플라스미드 유전자 서열의 경우는 보충 텍스트 참조).
    2. 플레이트 (100) 1 % 당 50 μg의 / ㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 한천 접시에 세포의 μL 및 인큐베이터에서 37 ºC에서 그들을 O / N (~ 16 시간)을 품어.
    3. 식민지에 대한 시각적으로 확인하고 그들이 이상 성장되지 않도록 또는 위성 식민지의 존재를 보여줍니다. 즉시 파라 필름과 판을 밀봉 4 ºC에 저장합니다.
  2. O 설정 / N-문화와 성장 배지의 제조
    1. 루프 접종 와이어를 사용하여 하나의 고립 된 식민지를 선택하고 루리아 국물의 20 ㎖를 포함하는 100 ㎖의 멸균 플라스크에 전송 (LB) 미디어는 50 μg의가 / ㎖ 카나마이신 멸균 1 % 포도당 보충합니다. 250 rpm에서 진탕 기에서 37 ºC에서 / O N (~ 16 시간)을 그들을 품어.
    2. 오토 클레이브 900 ml의 좋아요 국물 (TB) 미디어 2.8에서 (미디어 및 버퍼 구성 참조)20 분 동안 121 ºC에서 증기 사이클의 세균 배양 용 L FERNBACH의 유리 플라스크.
  3. 큰 성장 문화를 설정
    1. 멸균 TB 미디어에 멸균 인산 칼륨 완충액 100 ㎖를 (미디어 및 버퍼 구성을 참조하십시오)를 추가합니다. 멸균 포도당 (0.2 % 최종 농도), 카나마이신 (50 μg의 / ㎖) 및 O / N 문화의 10 ML을 추가합니다. 250 rpm에서 진탕 기에서 37 ºC에서 품어.
    2. 이 0.5 (~ 2 시간)에 도달 할 때까지 600 nm 파장 (OD 600)를 사용하여 농도계 또는 분광 광도계 매 시간마다에서 광학 밀도를 확인합니다. 이 시점에서 150 rpm으로 속도를 줄이고 18 ºC까지 온도를 낮 춥니 다. 이 0.8 (~ 1 시간)에 도달 할 때까지 OD 600 매 30 분을 모니터링합니다.
    3. (- 30 분 ~ 15) 1.2 - 글리세롤의 50 ML을 추가하고 OD 때까지 진탕 배양 계속 600 1.0에 도달한다.
      참고 : 문화 ºC 37에서 18 ºC에 도달하기 위해 이러한 조건에서, 그것은 시간 정도 소요됩니다. 그것은 꼬마 도깨비입니다이 18 ºC로 냉각 한 후 ortant 그 글리세롤은 문화에 추가됩니다.
    4. 200 μM IPTG (이소 프로필 티오-β-갈 락토)와 세포를 유도하고 다시 250 rpm으로 진탕를 재설정하고 18 ºC에서 ~에 대해 추가로 16 시간을 배양한다.
  4. 단백질 정제
    1. 확인 16 시간의 끝에서 OD (600)가 있음 ~ 16 - 8,500 × g으로 15 분 동안 4.0 ºC에서 회전 1.0 L 원심 분리 병 (18)을 수확 세포. 뜨는을 가만히 따르다 및 세포 펠렛와 병의 무게. 총중량에서 빈 용기의 중량을 뺀 펠릿의 중량을 계산한다.
      참고 : 예상 세포 펠렛 무게 ~ 30 - 35g / L. 이 주목되어야한다 비록 돌연변이 걸쳐 최종 OD 600 세포 펠렛 중량에 변화가있을 수 있음.
    2. 문화의 1.0 L 당 얼음처럼 차가운 버퍼 (A)의 150 ㎖ (100 mM의 염화나트륨, 20 mM 트리스, 산도 7.4)에서 세균 펠렛을 다시 일시 중지합니다. DNase의 I (100 μg의 / ㎖)와 카린 추가E 억제제 (페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (1 ㎜), 류 펩틴 (2.0 μg의 / ㎖), 아프로 티닌 (2.0 μg의 / ㎖) A (1 μg의 / ㎖ 펩 스타틴)).
    3. 4.0 ºC 차가운 방에서 세포 교란을 통해 전달하여 세포를 균질화. 박테리아의 대부분이 용해되도록하는 과정을 세 번 반복한다. 15 분 동안 14,000 XG에서 세포를 원심 분리기 상층 액을 피펫 깨끗한 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 취소 용해 세포와 봉입체를 포함하는 펠렛을 폐기하십시오.
    4. 1 시간 동안 168,000 XG에 뜨는을 원심 분리기. 조심스럽게 막 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 가만히 따르다.
    5. 배양 한 L에서 막 펠렛을 수영장, 50 ㎖의 최종 부피 (10 % 글리세롤이 보충 된) 완충액 A에서 다시 대기. 4.0 ºC에서 2 시간 동안 막 서스펜션과 nutate에 n 형 Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) 0.5 g을 추가합니다.
    6. 막 가용화 한 후, centrifug에 의해 해물에서 세포 파편을 제거1 시간을위한 168,000 XG에 ATION. 한편 아밀로스 수지를 준비합니다. 전송 빈 폴리 프로필렌 크로마토 그래피 칼럼에 피펫을 사용하여 수지의 3 ㎖. 0.5 mM의 DDM을 포함하는 완충액 A의 10 상 부피와 다음 물 3 회 10 침대 볼륨을 전달하고하여 수지를 씻으십시오.
    7. 원심 분리 후, 부드럽게 피펫을 사용하여 상층 액을 꺼내 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 배치 식 바인딩의 경우, 원뿔 튜브에 미리 평형 아밀로스 수지를 추가합니다. 4.0 ºC에서 2 시간 동안 혼합물을 하향 경사에 의해 아밀로스 수지 추출 된 단백질을 결합한다.
    8. 크로마토 그래피 칼럼을 통해 전체 슬러리를 전달하고 흐름을 통해 수집합니다. 이어서 수지 위에 결합 극대화 두 번 전체 수집 관류를 통과한다.
    9. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해, 0.5 mM의 DDM 0.5 mM의 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 완충액 A의 10 베드 부피 합격.
    10. 를 버퍼 10 mL로 GLIC 단백질을 용출0.5 mM의 DDM 0.05 mM의 TCEP 외에 40 MM의 말 토스를 포함하는 FER를했다. TCEP는 시스테인 사이드 체인의 산화를 방지 할 수 있습니다. 전체 용출를 수집합니다.
    11. 4 원심 농축기 (분자량 컷 - 오프 = 50 KDa의)를 사용하여 용출 된 단백질을 집중 - 6 ㎎ / ㎖ 및 HRV-3C 프로테아제 (200 μg의 10 mg의 당 단백질)을 추가하고 4.0 ºC에서 O / N을 품어.
      주 : SDS PAGE의 겔 샘플을 실행함으로써, 프로테아제의 분해의 완료를 확인한다 (단계 2.5.5도 1 참조).
  5. 사이트 감독 스핀 라벨
    1. DMSO (1 옥실-2,2,5,5- 테트라 메틸 Δ3 - 피 롤린 -3- 메틸) MTSL (40)의 200 mM의 주식의 약 100 μl를 확인하고 25 μL 씩 -20 ºC에서 주식을 저장합니다.
    2. MTSL와 스핀 라벨의 단백질 분해 효소 소화 샘플을 사용합니다. (: MTSL 1시 10분 몰비 GLIC 모노머) MTSL 스핀 라벨의 10 배 몰 과량을 추가합니다. 1 시간 동안 얼음에서 인큐베이션. 5 배 몰 과량에서 스핀 라벨의 두 번째 샷 추가비와 다른 시간 동안 배양한다.
      주 : (후술 낮은 스핀 표지 효율) 매립 위치에 대한 스핀 라벨의 30 배 몰 과량을 첨가하고 단백질을 6 시간 동안 배양한다.
    3. 쪼개진 MBP와 GLIC의 량체의 과잉 무료 스핀 라벨을 분리하기 위해 버퍼 A와 0.5 mM의 DDM 사전 평형 수있는 크기 제외 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 칼럼을 통해 샘플을 전달합니다. 30 ㎖의 용출 총 1 ml의 분획을 수집한다. GLIC의 량체 (그림 1)을 포함하는 분수 수영장. FPLC를 실행하려면 제조업체의 지시 사항을 따르십시오.
    4. 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 분광 광도계를 사용하여 샘​​플의 농도를 결정한다. 몰 흡광 계수 GLIC 모노머의 예상 분자량은 각각 49,850 M -1 cm -1 36380 다이다. (분자를 원심 농축기를 이용하여 단백질 용액을 농축시켜~ 8-10 ㎎ / ㎖ 및 얼음에 배치 최종 농도 중량 컷오프 = 50 KDa의). 샘플은 지금 재구성을위한 준비가되어 있습니다.
    5. 추가의 품질 검사가 준비 생화학 균질 것을 보장하기 위해, 환원 (1.0 % β-ME) SDS-PAGE 젤을 실행.
      참고 : commassie 스테인드 겔 33 kDa의이 GLIC 단량체 (그림 1)에 해당 ~에 하나의 밴드를 표시해야합니다.
    6. , 극성 폭이 넓어을 나타내는 의심 스핀 표지 돌연변이를 들어 반자성 라벨 (41)의 존재 샘플을 아래-레이블을 붙입니다. 0.1 배의 MTSL으로 용출 된 단백질을 품어 1.0 시간 동안 얼음에 품어. 이후, 반자성 라벨 (1- 아세 톡시 2,2,5,5- 테트라 메틸 - 피 롤린 Δ3 -3- 메틸) 메탄 티오의 20 배 몰 과량을 추가한다.
      참고 : 여기에 사용 된 반자성 시약은 동일한 라벨 화학으로 상자성 레이블 이소 입체입니다.
    7. 2 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. SIZ를 통해 샘플을 전달단계 2.5.3의 완충액 A로 0.5 mM의 DDM으로 미리 평형화 E 배제 크로마토 그래피 칼럼.
  6. 스핀 라벨의 효율성
    1. 스핀 표지 효율 시스테인 측쇄 (GLIC 모노머)의 농도, 스핀 라벨 농도의 비율로 정의된다. 샘플의 스핀 - 표지의 효율을 결정하기 위해, 시료의 적분 강도는 알려진 농도의 표준 교정 곡선을 사용하여 비교한다. 물에 용해 - (250 μM 10) 농도의 범위 (TEMPO 예컨대 2,2,6,6- 테트라 메틸 -1- piperidinyloxyl)는 EPR 표준 용액을 만든다.
    2. 각 솔루션에 대한 EPR 신호를 측정하고 (단계 6.1에 기재된 바와 같이) 각 농도 곡선 하 면적 (EPR에 신호의 이중 적분)을 결정한다. 템포 농도의 함수로 측정 된 영역을 플로팅 직선으로 피팅하여 검량선을 생성한다.
      참고 :이A A 유도체 EPR 신호에 따라 피크의 진폭에 대한 피크보다 분광 광량을 더 설명한다. 제 파생 EPR 신호를 적분하여 흡수 스펙트럼을 제공한다, 제 통합은 (스핀 농도에 비례) 흡수 스펙트럼을 아래의 면적을 줄 것이다. 스펙트럼의 저 - 필드 하이 필드 영역에서 일정한 기준 모두를 보장한다.
    3. (단계 2.5.4에서와 같은) 분광 광도계를 사용하여 세제 스핀 표지 된 단백질의 농도를 측정한다. 이제 샘플의 EPR 신호를 측정 한 다음 6.1의 단계 다음 EPR 신호의 이중 적분의 영역을 결정합니다. 교정 곡선을 사용하여 측정 된 EPR 신호에 대응하는 레이블의 농도를 결정한다. 스핀 라벨 및 단백질 농도의 몰비로 스핀 표지 효율을 계산한다.

Asolectin 막 3. GLIC의에서 재구성

    리포좀의 제조
    1. 클로로포름 5 ml의 깨끗한 25 ㎖의 둥근 바닥 플라스크를 씻어 흄 후드에서 N 2 가스의 흐름에 플라스크를 건조. 플라스크에 asolectin의 양도 10 밀리그램 (클로로포름 콩 극성 추출물 25 ㎎ / ㎖ 주) 및 N 2 가스의 연속 스트림에서 지질 건조.
      주 : 재구성을위한 지질의 선택은 4 장에서 실험 결과를 기반으로합니다.
    2. 클로로포름이 증발되면 완전한 건조를 보장하기 위해 1 시간 동안 진공 플라스크를 배치합니다. 건조 된 지질로 재구성 버퍼 (A)의 1 ML을 추가하고 현탁액에 지질 펠렛을 얻기 위해 적극적으로 플라스크를 소용돌이.
    3. (- 15 분 약 10)를 소형 단일 층 소포를 준비하려면 소포 솔루션은 다소 반투명 될 때까지, 감기 목욕 초음파기의 지질 현탁액을 초음파 처리하고 더 덩어리가 관찰되지 않습니다. 이 혼합물에, 4 mM의 최종 농도 DDM을 추가 30 분 동안 RT에서 배양한다.
    <리>에서 재구성
    1. 지질 혼합물 단계 2.5.4에서 정제 된 단백질을 추가합니다.
      주 : 단백질 대 지질의 비율은 실험의 유형에 의존한다. 육안 전류 측정을 위해 1 : 10,000의 비율이 사용된다. 신호를 최대화 할 : EPR 연구 내용 재구성 지질 비 (2500 1)에 높은 단백질로 이루어진다. 이전에 이러한 농도에서 어떠한 측면 집계 42 관찰되지 것을 나타낸다.
      주 : 프로브 위치에 기초하여, 낮은 양 잘 작동하지만 EPR GLIC위한 일반적인 작동 량은 1 ~ 밀리그램이다.
    2. 다음 버퍼 A. 15 ml의 샘플을 희석 부드러운 회전 1 시간 동안 4 ºC에서 샘플을 품어
      참고 :이 단계는 임계 미셀 농도 (CMC) 아래의 세제 농도를 제공합니다.
    3. (소수성 모공이 트랩 세제) 폴리스티렌 비즈를 추가하여 서스펜션의 잔류 세제를 제거합니다. 구슬 깨끗한의 80 밀리그램을 추가하고 lipos를 품다4 ºC에서 nutator에 오메 서스펜션 O / N.
      1. 사용을위한 비드를 제조하기 위해, ~ 100 mg의 무게 한 50㎖ 원추형 튜브에 옮긴다. , 격렬하게 흔들어, 메탄올 10 ㎖ 추가 2 분 동안 8,000 XG에 구슬을 아래로 회전하고, 메탄올을 가만히 따르다. 메탄올이 과정을 세 번 반복 세척. 세 번 세척 탈 이온수 30 ml의와 같은 과정을 반복합니다.
    4. 다음날, 비드를 제거하고 추가로 25 ml의 샘플을 희석하는 컬럼 필터를 사용하여 25 ㎖의 초 원심 분리 튜브에 리포솜 옮긴다. 2 시간 동안 168,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다 및 버퍼 (B)의 100 μl를 사용하여 펠렛을 다시 일시 중지

4. FRET에 의해 재구성 될 최적의 지질 구성을 결정

  1. 단백질이 단 분산 유지 막 조성을 결정하는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) - 기반 분석을 사용한다.
  2. 중량을 정화 10에서 부 (2) 레이블에서 단백질을 설명하는 단계에 따라 (기본 시스테인, C27)와 GLIC : 1 (라벨 / 모노머) 형광 - 말레이 미드 또는 테트라 메틸 말레이 미드 중 하나가 섹션 2.5 단계에와 몰비.
  3. 각 지질 조성물을 시험 할 세 개의 다른 샘플을 준비 재구성 섹션 3.2의 단계에 따라, 먼저, (1)의 몰비 GLIC을 형광 표지 :. 1500 (량체 : 지질) 둘째, 로다 민 - 표지 몰비 GLIC 1,500 : 1의 (량체 : 지질). (: 1 몰비 1) 셋째, 혼합 세제 용해 형광 및 로다 민은 GLIC을 표시. 750 (량체 : 지질) 비율 1이 혼합물을 복원합니다.
    참고 asolectin, POPC : POPG (3 : 1 몰비) 및 E. 우리는 세 지질 시스템을 사용 대장균 극성 추출물. (1 : 1과 비교하여 750 : 1500 EPR 연구에 사용됨) FRET 실험에서 단백질을 재구성 지질 비 EPR 측정에 사용 된 것보다 더 높다.
  4. 묽게 한리포좀 현탁액 (빛 산란 신호를 줄이기 위해, 버퍼 (A)의 995 μL에 ~ 5 μl를) 다음 석영 큐벳에 샘플을 피펫과 형광 계에 넣습니다.
  5. (: 형광 기증자의 최대 흡수에 해당) (490)의 여기 파장을 설정합니다. 제조업체의 지침을 사용하여, 500 nm 내지 660 nm의 발광 스펙트럼을 기록한다.
    참고 : 형광 표지 GLIC 샘플 들어, 518 nm에서 피크가 (로다 민 방출에 해당) 572 nm에서 어떤 피크 (형광 방출에 해당)이 표시됩니다. 로다 민 표지 GLIC 샘플의 경우, 518 nm에서 피크를 볼 수 없습니다 대신 572 nm에서 490 nm에서 로다 민을 직접 여기에서 발생. 플루오 레세 인 및 로다 민 라벨 모두를 함유하는 샘플에 대해, 형광 피크 강도의 감소 및 로다 피크에 대응하는 증가 가능성 멤브레인 단백질의 응집 측면의 지표 인 FRET 신호이다.
  6. 모니터다양한 시간 간격으로 572 nm에서 로다 민 방출의 진폭 (0 - 24 시간) 처음 6 시간 동안 다음 O / N 배양 (그림 2) 후 매 시간마다의 기록. 각 간격 (로다 용 : IA) 572 nm에서 형광 강도를 측정하고, 518 nm에서 (플루오 레세 인 경우 : 이드). IA (IAC)에서 직접 로다 민 활성화 (단계 4.3 샘플 2)의 기여를 뺍니다. IAC / (IAC + IB)과 FRET 비율을 결정합니다. 서로 다른 시간 간격으로 서로 다른 지질 조성에 걸쳐 FRET을 비교합니다.
    참고 : 대조군으로 세제 용해 샘플 단계 4.5 및 4.6을 수행하고 재구성 리포좀에서 이들에 발광 스펙트럼을 비교합니다. 세제 표지 단백질의 몰 혼합물을 사용하여 (단계 4.3에서 설명) 및 버퍼 A는 0.5 mM의 DDM 보충에 희석. 이는 세제 샘플을 최소한 FRET 신호를 보여주는 것으로 기대된다.

패치 클램프 녹음 5. 기능 측정

  1. 홍보 준비EPR 연구 (3.1)과 똑같은 방식으로 패치 - 클램프 측정 oteoliposomes.
    참고 : 측정의 유형 (육안 녹음 대 싱글 채널) 만들어지고에 따라 지질 비율 : 그러나, 단백질을 조절합니다. -80에서 액체 질소와 저장소에 테오을 플래시 동결 ºC 사용할 때까지. 일반적으로, 1 GLIC을 재구성 : 10,000 단백질 거시적 인 전류에 대한 지질 (몰비) 및 1 : 단일 채널 녹음 50,000 몰비.
  2. 얼음에 해동 리포좀. 물과 에탄올 깨끗한 유리 슬라이드를 씻어 완전히 건조. / N 진공 하에서 4 ℃로 데시 케이 터에서 슬라이드 건조 O의 중심에 proteoliposome의 10 μl의 드롭 놓습니다.
  3. 버퍼 B (150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 HEPES, pH를 7.0) 20 μl를 추가하여 건조 테오을 수화물 - 다시와 촉촉한 필터 종이의 상단에 petriplate에서 슬라이드를 배치합니다. 플레이트를 커버하고 재수 약 2 시간 동안 진행 할 수 있습니다.
    참고 :이 프로세스 yieLDS에서 패치에 도움이됩니다 거대한 멀티 라멜라 리포좀.
  4. 제조업체는 피펫 끌어 당기는에서 권장 설정 사용 - 얇은 벽 붕규산 유리 모세관 (2 μm의 팁 직경 ~ 1)에서 패치 피펫을 당깁니다. 버퍼 B. 가득 할 때 2MΩ - 사용하여 열 폴란드어 1.5의 저항에 불이-위조
  5. 피펫을 사용하여 버퍼 B로 기록 챔버를 입력하고 자세 / AgCl을 접지 전극을 연결합니다. 2 μL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 가장자리 및 전송 기록 챔버에 현탁액의 1 μL에서 리포좀을 제거. 리포좀은 바닥에 정착하는 데 몇 분 정도 기다립니다.
  6. 비금속 주사기 바늘을 사용하여 버퍼 B와 패치 피펫을 입력하고 앰프 헤드 무대에 마운트. 패치를 단일 고립 된 소포를 확인합니다. 막힘 패치 피펫을 방지하고, 기록 챔버에 팁을 삽입하기 위해 약간 양의 압력을 적용한다.
  7. 피펫 resista을 측정하는 테스트 펄스를 적용후부 오프셋 피펫 전압을 보상. 소포 접근, 접촉이 이루어질 때, 부드럽게 기가 옴 밀봉을 형성하기 위해 패치 피펫에 대한 소포를 당겨 약간의 부정적인 압력을 적용합니다.
  8. 전체 과정 피펫의 저항을 모니터링한다. 기가 옴 시일이 형성되면 내부 아웃 패치를 형성하기 위해 조심스럽게 리포솜으로부터 피펫을 철회. 테스트 펄스 전원을 끕니다.
  9. -100 MV에 들고 잠재력을 설정하고, pH가 펄스를 적용합니다. 낮은 pH를 10 mM의 시트르산 나트륨 완충액 C (150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 시트르산의 pH 3.0)을 사용하여 수득 하였다. (그림 3)
    주 :이 레코딩 육안 10 kHz 및 단일 채널 측정을위한 40 kHz의 샘플링 주파수에서 이루어진다.

6. EPR 측정

  1. 연속 웨이브 EPR 분광학
    1. 200 μL 튜브에 단계 3.2에서 리포좀 현탁액을 전송하고 원심 분리기를 사용하여 샘​​플을 펠렛. supernata 폐기NT 및 샘플 EPR 측정을위한 준비가되어 있습니다.
      주 : EPR 측정을 위해, 가능한 리포솜 샘플에서 다량의 버퍼를 제거하는 것이 중요하다. 수성 샘플을 가열 및 감도의 손실의 결과 전자 레인지의 전기 일부를 흡수하기 때문이다.
    2. 버퍼 교환을 수행하기 위해, 미세 원심 분리 튜브에 피펫을 사용하여 리포좀 펠릿 20 μl를 전송합니다. 버퍼 D (100 mM의 염화나트륨, 10 mM의 구연산, 산도 3.0) 180 μl를 추가하고 5 분 동안 42 ºC 수조에서 부화. 샘플을 원심 분리기 피펫을 이용하여 상층 액을 제거하고 전체 버퍼 교환을 보장하기 위해 과정을 세 번 반복한다.
      주 : 대안 적으로, 버퍼의 과거 여러 동결 / 해동 사이클에 샘플을 처리함으로써 제조 될 수있다.
    3. 가스 투과성 플라스틱 모세 혈관은 스펙트럼 라인 모양과 용매 접근성 모두의 측정에 적합하다. 내부 샘플을 그리고 뼈 왁스로 끝을 밀봉하기 위해 펠렛 proteoliposome에 모세관을 누릅니다.
      아니E : 일반적인 샘플 볼륨 ~ 5 μL하고 바람직한 스핀 농도는 150 μM이다. 대물 단독 광고 형상을 측정하는 경우, 하나는 0.4 mm OD 석영 모세관을 사용할 수있다. 필요한 경우, 피펫은 모세관 내부의 시료를 채우기 위해 사용될 수있다.
    4. 분광계를 작동
      1. 제조업체의 사용 설명서에 따라 유전체 공진기가 장착 된 X 밴드 분광계에 - RT (297 K 292)에서 CW-EPR 측정을 수행합니다.
      2. 물 냉각 장치, 전원 공급 장치, 전자 레인지 브릿지 본체를 켭니다. 열 기록하기 전에 약 30 분 동안 평형에 시스템을 허용합니다. 인수 소프트웨어를 엽니 다.
      3. 공진기에 샘플 튜브 / 모세관을 삽입 샘플로 채워진 튜브의 섹션은 공진기의 중심에 있는지 확인하십시오. 조정 분광계 설명서의 지시에 따라 공진기.
      4. 필드에서 스위프하여 1 차 미분 흡수 스펙트럼을 녹음1.0 mW의 100 kHz의 변조 주파수 100 G.의 스위프 폭 입사 마이크로파 전력은 누진 굴절력 포화 실험을 수행함으로써, 실험을위한 최적의 전력을 결정 여기서 1 차 도함수 CW의 피크 - 투 - 피크 높이 EPR 신호 입사 마이크로파 전력의 제곱근의 함수로서 측정된다.
        주 : 하부 마이크로파 전력에, 전력의 제곱근에 비례하는 신호의 강도가 증가만큼 스핀 상태의 평형 인구가 영향을받지 않는다. 전력이 더 증가되는 경우, 스핀 - 격자 완화 더이상 개의 스핀 상태의 평형 인구 차이를 유지할 수 없으며, 신호 진폭 고원 또는 시작 "포화." 이 점을 넘어, 신호 진폭은 실제로 인해 스핀 물리게의 인구 반전에 전력을 관찰 증가에 따라 저하 될 수 있습니다. 또한, 넓은 날개를 가진 확대 스펙트럼에 대한 위치를 잘 정의 된 평면 기준은 VI하지 않습니다영역의 손실을 방지하기 위해 200 G - sible, 150 스위프 폭을 확장한다.
      5. G. 1.0의 변조 진폭을 사용하여 시작
        주 :이 값은 샘플 의존적 신호 내의 저주파 노이즈를 감소하도록 조정된다. 너무 큰 값이 사용되는 경우에도 변형이나 신호 범위를 확장 할 수있다.
      6. 1024 점에 20.97 초, 해상도에 시간을 청소, 20.48 밀리 초에 시정 및 전환 시간을 설정합니다.
        주 : 일정 시간은 샘플을 기반으로 고주파 잡음을 제거하도록 조정된다.
      7. 처음 주사 후, EPR 신호의 중심에 중심 필드를 설정 및 추적 양쪽 신호 충분한 기준을 포함​​하도록 스위프 폭을 선택한다.
        주 : 또한, 신호 / 잡음비를 개선 EPR 신호의 강도에 기초하여 스캔 수를 늘릴. 스위프 폭과 포인트의 수를 포함
      8. 에이전트를 편안하게 충돌하는 스핀 라벨의 접근성을 측정 O (2) 또는 ethylenediaminediacetic 산 (NiEDDA)를 사용하여 전력 포화 프로토콜 27 단계 6.1.4.4에서 설명.
        참고 : 이전에 26 설명 된대로 NiEDDA를 준비합니다.
      9. 처음 5 분 동안 N 2 캐비티에 샘플을 관류 (세척하는 O 2). 30 G.의 스위프 폭 3dB의 단계에서 35dB - 5 사이의 각 마이크로파 전력에 대한 스펙트럼을 측정
      10. 그러면, 캐비티와 상기 샘플을 관류 10 분 동안 공기와 다른 마이크로 웨이브 전력의 스펙트럼 측정 - 단계 6.1.4.9에서와 같이 (5 3dB의 단계에서 35dB)을.
      11. 5 분 42 ºC의 물 목욕 (버퍼 B 또는 버퍼 D)에 50 mM의 NiEDDA 180 μL와 리포좀 펠릿 20 μl를 품어. 샘플을 원심 분리기와 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 모세관에 샘플을로드하고 공진기에 넣습니다. 단계를 반복 6.1.4.9.
        참고 실험 뒤의 원리는 그 상자성 relaxin과의 상호 작용하이젠 베르크의 스핀 교환을 통해 g 에이전트는 신호와 인구 반전의 포화를 방지 할 수 있습니다. 수용성 및 지용성 NiEDDA 분자 O 2 물 (모두 벌크 및 intraprotein 홀)에 대한 리포터로서 사용되는 멤브레인은 각각의 단백질의 위치를 노출시켰다.
  2. 데이터 분석:
    주 : EPR 데이터의 분석은 다음과 같은 단계로 이루어 14,22,23,25-27
    1. 스핀 프로브의 이동도를 계산한다 (ΔH O-1), 1 차 도함수 흡수 스펙트럼의 중앙 라인 폭의 역수로서. ΔH 오 -1 운동의 자유 또는 프로브의 역학의 반사이다.
    2. 아래에 설명 된 단계를 사용하여, 다른 상자성 충돌하는 편안한 에이전트 프로브의 접근성의 추정치 인 접근 매개 변수 (П)를 계산합니다.
      참고 : 상자성 편안한 에이전트와 스핀 프로브의 상호 작용하이젠 베르크 스핀 교환하여 질산화물의 스핀 - 격자 완화 율 (T 1)을 향상시킨다. 27
      1. 1 차 도함수 EPR 스펙트럼의 중심선의 수직 피크 - 투 - 피크 진폭이 상이한 마이크로파 전력을 측정하는 전력 포화 실험 (6.1.4.8)에서 접근성 파라미터 (П)을 추정한다. (25) 플롯을 신호의 진폭을 하기 식 (27)와 마이크로파 전력의 제곱근의 함수로서 맞추기.
        figure-protocol-1
        주 : A는 신호 진폭이고, (일반적으로 0.5 내지 1.5이다), 공진 선로의 채도의 균질성의 측정은, I는 스케일링 인자이고, P는 입사 전력이며,는를 나타낸다 값이되는 1 차 도함수는 불포화 진폭 값의 절반이다.
  3. 계산 ΔP P의 차이로 2 존재 (O 2 NiEDDA) 및 부재의 1/2 값은 상자성 편안한 에이전트 (N 2 관류). 방정식을 사용하여 액세스 매개 변수 (П)를 계산한다 :
    figure-protocol-2
    주 : P 1/2 기준과 ΔH 오 문헌 27 (예컨대 DPPH (2,2- 디 페닐 -1- 피 크릴) 등) 참조 표준에 대해 각각 절반 최대 전력 채도 값과 상기 중앙 라인 폭이다.

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결과

스핀 표지 GLIC 변이체의 생화학 적 특성

배양 12 ㎎ / ℓ - 일반적으로 10 내지 GLIC-MBP 융합 단백질을 수득 할 상기 프로토콜에 따라. 이 값은 특히 단백질 내에 매립 위치에 대한 다른 돌연변이마다 다를 수 있지만, 수율이 크게 저하 될 수있다. 이 경우, 문화 볼륨 업 스케일링이 필요할 수 있습니다. HRV3C 프로테아제는 편의를 위해 O / N을 수행하여 융합의 분열을 구성. 60 분 - SDS 페이지 젤에 샘플을 실행하면, 우리는이 분열 30 내에서 완료 한 것으로 나타났습니다. (도 1A). 크기 배제 겔 여과 컬럼상에서 정제 GLIC 11.3 ㎖를 보유 부피와 량체로서 주로 용출. MBP에 분획을 15 ml의 용출에 집계 컬럼 (~ 7.0 ㎖)의 공극 부피에서 용출. 스핀 ...

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토론

EPR 스펙트럼을 거의 네이티브 환경에서 막 단백질의 구조적 변화를 정량화에서 타의 추종을 불허하는 구조적 접근 것으로 입증되었습니다. 이러한 접근 방식은 우리에게 X 선 결정학 및 곳을 알아내는 - 전자 현미경에서 고해상도 구조에 가려하는 단백질 역학의 분자 세부 사항에 엿봄을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 시스템으로 일반적인 적용에 영향을 미칠 수 있으며 마음에 길을 따라 잠재적 실험 장애물을 유지하기 위해이 방법의 기술적 한계를 고려하는 것이 중요합니다. 우리는 아래의 문제 해결을위한 권장 전략과 함께 이러한 측면 중 일부에 대해 설명합니다.

일반적인 문제 중 하나는 광범위한 돌연변이 교란이 낮은 수율과 단백질의 가난한 올리고머 안정성이다 관련된 기술로 발생하는. 이온 채널과 같은 복잡한 다량 막 단백질로 작업 할 때 이러한 양상은 더욱 악화된다. 그것은 일입니다대폭적인 돌연변이에 착수하기 전에이 두 가지 생화학 적 측면을 최적화하는 것이 중요 erefore. 우리는 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 원고의 중요한 읽기와 의견의 차크라 실험실의 현재와 전 회원들에게 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 보건 부여의 국립 연구소 (1R01GM108921)와 미국 심장 협회 (NCRP 과학자 개발 그랜트 12SDG12070069)에 의해 SC에 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
부위 지시 돌연변이 유발 및 Cys 돌연변이
10x PfuUltra HF 반응 완충액Agilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 mM 각 dNTP
pfu Ultra DNA 중합효소Agilent Technologies600380-512.5 U/ul
DPNINew England BioLabs Inc‎R0176S20,000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC 미디어New England BioLabs Inc‎B9020S
KanamycinFisher ScientficBP905
LB 미디어Invitrogen127957084
Miniprep 키트QIAGEN27106
C43 유능한 세포Lucigen60446
발현 및 정제
포도당Fisher ScientficD16
트립톤피셔 생물 시약BP1421-500
효모 추출물AmrescoJ850
글리세롤피셔 생물 시약BP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (이소 프로필 - 티오 -& 베타, - 갈락토 시드)골드 생명 공학I2481C25
Trizma Base시그마 생명 과학T1503
NaCl시그마 - 알드리치S7653
DNase I시그마 생명 과학DN25
PMSFAmrescoM145
류펩틴AmrescoJ580
펩스타틴AmrescoJ583
DDM (n-docecyl-β-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
아밀로스 수지New England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
맥토스아크로스 유기물329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
빈 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼BioRad731-1550
현장 지정 스핀 라벨링
MTSL (1- 옥실 -2,2,5,5- 테트라 메틸 -3- 피롤린 -3- 메틸) 메탄 에티 오 설포 네이토론토 Reaserch 화학 물질O873900
(1- 아세톡시 -2,2,5,5- 테트라 메틸 - 델타; 3-pyrroline-3-methyl) 메탄에티오설포네이Toronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Reconstitution
Asolectin lipidAvanti polar lipids Inc541602C
Biobeads (폴리스티린 비드)Bio Rad152-3920
MethanolFisher chemicalsA413
FRET
플루오레세인-말레이미드ThermoFisher ScientificF-150
테트라메틸로다민-말레이미드ThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti 극성 지질 Inc850457C
POPGAvanti 극성 지질 Inc840457C
E.coli 극성 지질 추출물Avanti polar lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
EPR 측정
TPX 플라스틱 모세관BrukerER221
EDDA(Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)Aldrich158186
Ni(OH)2올드리치283622
, 트 트

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