표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

요약

여기에서는 바이러스에 감염된 미성숙한 림프구성 융모수막염 마우스에서 분리된 조절 T(T_reg) 세포의 표현형을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, T_reg cell의 억제 활성을 평가하는 프로세스를 제공합니다.

초록

전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 _REG) 세포, CD4 ⁺ T 세포의 서브 세트이다. T의 _{등록 세포는} 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 _{등록 세포의} 주요 역할은 효과기 T (T의 _EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. _EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 _레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T _{세포에 등록하는} 기능, 마우스 또는 인간 T _{등록 세포를} 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 _등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T _레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T _{세포는 등록} 나이브 마우스로부터 단리 된 T _{세포를 등록} 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 _등록 된 T _세포 휴식에서 활성화 된 T _{세포를 등록} 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 _{등록 세포의} 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.

서론

규제 T (T의 _REG) 세포는 개발 및 기능 ¹ 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 _{등록 세포는} ^CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) ^(3), 글루코 코르티코이드 - 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 ⁽⁴⁾ 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) ⁽⁵⁾ 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 ^{6,7, 8,9} 박테리아, 기생충 ^10-12 또는 암 ^13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 _{등록 셀은} 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 ^+와 CD8 ⁺ T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 _{등록 세포가} 손상된 CD8 ⁺ T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 ^{15 ~ 17시} 전자. FV 유발 T에 _{등록 셀은} IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 ⁺ T 세포의 세포 독성 ^15-17 반응성을 억제한다. 또한, 단순 포진 바이러스 감염 모델에서, 이는 바이러스 - 특이적인 CD8 ⁺ T 세포 및 immunopathogenic CD4 ⁺ T 세포를 ^18-20의 침윤 심각한 조직 손상의 확대 결과 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T에 _{등록 세포의} 고갈을보고 하였다.

림프 구성 맥락 수막염 바이러스의 복제 13 균주 만성적으로 감염된 마우스 (LCMV CL13) ^{21-24 널리} 만성 바이러스 감염 동안 효과기 T 세포 (T의 _EFF) 및 T의 _{등록 세포의} 표현형 및 기능을 특성화하는데 사용되어왔다. 영구 LCMV 감염시 바이러스 관련 T _EFF의 세포는 점차적으로 자신의 이펙터 기능을 잃고 지쳐 T (T의 _배기) 세포가된다. 한편, T에서_{레지 세포는} 바이러스 특이 적 T 세포 반응 ^(25)을 억제하는 능력을 강화한다. T 개의 _EFF 셀의 작동 능력의 감소는 이러한 T _EFF 세포 억제 성 수용체의 상향 조절, 항원 제시 세포의 변경 기능, 면역 조절 사이토 카인의 생산 및 증가 된 주파수 또는 T의 _등록 향상된 기능 등 여러 가지 요인들에 의해 설명 될 수있다 세포 ^26. T 세포 억제에 관여하는 요소 중에서, 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1) 발현 T의 _{배기 세포와} T에 _{등록 세포} 널리 항원 지속성 및 억제 환경의 특징으로 간주되어왔다. 최근에는 T의 _{등록 셀의} PD-1 경로의 폐색 및 제거를 향상 T 세포의 기능을 야기한다는보고 LCMV 만성 감염시 바이러스로드 ^(27)가 감소 하였다. 또한, T의 _{등록 세포는} LCMV ^{(23, 25)와} 쥐의 만성 감염시 활성화 과 억제 기능 ^(25)을 강화한다. PD-1은 높은 T에 _{등록 세포뿐} 아니라 T의 _{배기 세포} 발현되며, PD-1 T에 _{등록 세포에} 의해 발현 수준은 T 세포의 증식 ^(25)을 억제하는 그들의 억제 기능의 강도와 상관 관계.

여기서는 LCMV CL13 및 나이브 마우스로부터 단리 휴지 T에 _{등록 세포} 감염 쥐로부터 분리 활성화 T _{등록 세포의} 특성을 비교하는 방법을 설명한다. 더욱이, 우리는 활성화 된 T 세포의 _레지 분리 및 표현형 생체 검사뿐만 아니라 시험 관내에서의 억제 활성을 측정하기위한 일련의 처리를 설명한다.

프로토콜

본 연구에서는 마우스는 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균이없는 시설에서 유지 하였다. 모든 동물 실험은 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 국제 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 한국 식품 의약품 안전청 지침에 따라 실시 하였다.

솔루션 1. 준비

1. RPMI 1 % 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신에 소 태아 혈청 (FBS)을 희석하여 2 % RPMI 배지를 준비
2. 전체 RPMI 미디어를 준비합니다. RPMI 미디어는 FBS의 10 %, 페니실린 - 스트렙토 마이신의 1 %, L- 글루타민의 1 %, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다.
3. 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 버퍼를 준비합니다. FBS의 2 %에 그래서, 보충 인산 완충 식염수 (PBS)를 수행합니다.
4. T 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 이렇게하려면, FBS의 2 %, 2 MM의 ethylenediaminetetraa와 PBS를 보완cetic 산.

비장 림프구 2. 분리

1. 이전 ¹⁹ 설명 된 바와 같이 순진 또는 LCMV CL13에 감염된 마우스에서 비장을 제거하고 2 % RPMI 배지 10 ㎖를 포함하는 X 15mm 배양 접시 60mm에 배치합니다.
   참고 :이 연구의 실험에서, 5 ~ 6 주령에 C57B1L / 6J 암컷 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사를 통해 LCMV CL13의 2 × 10 ⁶ 플라크 형성 단위 (PFU)를 받았다. 16 일 후 감염 (16 D 파이) ^(25)에 쥐를 희생. 분석 GE의 일치 순진 마우스는 같은 날이었다.
2. 50 ㎖의 튜브에 세포 여과기를 넣고 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 씻어. 70 μm의 셀 스트레이너에 비장를 놓고 주사기의 플런저를 사용하여 분쇄. 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 셀 스트레이너를 씻어 50 ML 튜브에서 제거합니다.
3. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 뜨는을 취소하고를 재현 탁ACK 용균 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛. 5 분 동안 실온 (RT)에서 샘플을 인큐베이션.
   참고 : 위의 표시 ACK 용균 버퍼의 볼륨이 하나의 비장입니다. 풀링 비장 샘플 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
4. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁.
   참고 : 트리 판 블루 만 혈구를 사용하여 염색되지 않은 세포를 살고 카운트 라이브 셀 카운팅, 얼룩 세포하십시오.

지라 기존의 T (T의 _전환) 세포와 T의 _{등록 세포의} 3 표현형

참고 : T의 _{등록 세포} 분리하기 전에 다양한 항체와 세포를 염색 및 유동 세포 계측법에 의해을 분석하여 순진하거나 감염된 마우스에서 분리 된 비장 림프구의 표현형을 검사합니다.

1. 세포의 50 μl를 전송새로운 U 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 전체 비장 림프구 중 (5 × ¹⁰⁵ 세포) 및 웰 당 FACS 완충액 150 μL를 추가한다. 4 ℃에서 2 분 300 XG에 원심 분리기.
2. 상층 액을 버린다. 세포 펠렛을 선동하고 잘 당 FACS 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 4 ° C (2 회)에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
3. 다음 항체 및 시약 잘 당 FACS 버퍼의 50 μL에 염색 세포 표면 마커에 대한 항체 칵테일을 준비합니다. 안티 CD4 보라색 염료, 항 CD25 녹색 염료, 항 PD-1 바이올렛 염료 항 CD8를 PerCP-Cy5.5 염료 및 세포 생존 검출 시약 근적외선 (IR​​) 형광 반응성 염료.
   주 : 상기 활성화 된 T _{등록 세포의} 표현형을 분석은 항 CD103 ^{(23, 25)은} 세포 표면 마커 염색을 첨가 할 수있다.
4. 웰 당 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 로 두 번 세포를 씻으4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 FACS 버퍼입니다.
5. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 가만히 따르다 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 제조 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다.
6. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 (제조사의 프로토콜에 따라 제조)을 permeabilization 세척 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오.
7. Foxp3의 세포 내 염색 용 항체 용액을 제조하고, 반대로 Foxp3의 항체 용액 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁.
   주 : 상기 항 CTLA이 단계에서 첨가 될 수있다 T _전환율 및 T의 _{등록 세포의} 표현형을 분석.
8. 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어 및 단계 3.6를 반복합니다. 최종 세척 단계 후, FACS 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계수기 ^(25)에 의해 세포의 표현형을 조사한다.
9. 게이트 살아있는 세포의 popula기. CD4 ⁺ 또는 CD8 ⁺ T 세포 중에서 PD-1 ⁺ 세포 ^- LCMV CL13 감염 동안 _전환율 T _세포의 표현형 분석을 위해 Foxp3의 빈도를 조사한다.
   주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 비율 ^- PD-1 ^+는 LCMV CL13 16 D 파이에서 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포 집단을 모두 50 % 이상이다.
   1. T의 _{등록 셀의} 주파수 및 표현형을 분석, CD4 ⁺ T 세포 사이 Foxp3의 ⁺ 또는 ⁺ Foxp3의 PD-1 ⁺ 세포의 빈도를 조사한다.
      주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 ⁺ 또는 ⁺ Foxp3의 PD-1 ⁺ 세포의 비율은 각각, CD4 ⁺ T 세포 집단에서 20 % 이상이다.

CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 4. 분리

참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된위한1 × 10 ⁽⁷⁾ 총 비장 세포의 세포 수를 시작.

1. 순진하고 LCMV 만성적으로 감염된 마우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 격리 완충액 10 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
2. 자기 세포 분리 장치를 사용하여 CD4 ⁺ T 세포 농축을 위해, 바이오틴 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 10 분 동안 품어.
3. 버퍼의 30 μL, 비 CD4 ⁺ T 세포의 라벨링에 대한 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 20 μL와 CD25 ⁺ 세포의 형광 라벨에 대한 CD25-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
4. 완충액 2 ㎖를 첨가하고 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 셀을 통과한다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.완전히 뜨는을 취소하고 최대 1.25 × 10 ⁽⁸⁾ 세포의 밀도로 500 μL 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend.
5. 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 추가하여 열을 씻으십시오. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 90 μL에 고립 된 CD4 ⁺ T 세포를 재현 탁.
6. CD25 ⁺ 세포의 자기 표시를 들어, 안티 - PE 마이크로 비즈의 10 μl를 추가 잘 혼합, 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
7. 버퍼 2 ㎖를 추가하고 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻는다. 완전하게 상층 액을 제거하고 최대 1 × ¹⁰⁸ 세포의 밀도로 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
8. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포를} 풍부하게하기 위해, 긍정적 인 선택을위한 칼럼에 세포를 적용하고, 콜 럼을 씻어완충액 2 ㎖를 첨가하여 N. 세탁 세 번 반복합니다.
9. 열이 최종 세척 단계 후 비면 컬럼 상 완충액 1 mL를 넣어 자화 표지 CD4 ⁺ CD25 ^+, 플런저를 사용하여 세포 플러시.
10. 반복 고립 된 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 순도를 향상시키기 위해 4.8-4.9 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 격리 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T에 _{등록 세포를} 재현 탁.
11. 단리-CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 순도를 확인하려면 총 격리-CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포에서} 2 × 10 ⁵ 세포를 사용합니다. FACS 완충액 50 μL 안티 CD4 FITC를 함유 세포 생존율이 거의 IR 형광 반응성 염료 시약을 검출하여 세포를 염색.
    참고 : CD25는 이미 분리시 PE로 표지 하였다.
12. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의해 순도를 확인한다.
13. 게이트 라이브 세포 인구. T의 _{등록 세포의} 순도를 분석, CD4 ⁺ CD25 ⁺ 세포의 비율을 확인.
    주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD4 ⁺ CD25 ⁺ 세포의 비율은 약 80 % 이상이다.

CD8 ⁺ T 세포와 CD8 ⁺ T 세포의 라벨링 5. 분리

참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된 1 × 10 ⁽⁷⁾ 총 비장의 시작 세포 수에 대한 것입니다.

1. 순진 마​​우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 분리 버프 10 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어어. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 폐기하고, 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
2. 자기 세포 분리 시스템을 사용하는 CD8 ⁺ T 세포의 분리를 위해, 비 CD8 ⁺ T 세포 비오틴 표지 용 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 5 분 동안 품어.
3. 버퍼의 30 μL 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 믹스 4 °​​ C에서 10 분 동안 배양한다.
4. 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 버퍼 세번 2ml를 첨가하여 열을 씻는다.
5. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼 2 ㎖에 고립 된 CD8 ⁺ T 세포를 재현 탁.
6. 분리 된 세포의 순도를 확인하려면, FACS 버퍼에 항체 용액 50 μl를 준비합니다. 절연 CD8 ⁺ T의 CEL 중에서 2 × ¹⁰⁵ 세포를 재현 탁항체 용액 50 μL에 LS.
   참고 : 안티 - CD8 FITC 추가, 항체 용액을 제조하고, 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료) FACS 버퍼로합니다.
7. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 유세포 분류법으로 세포의 순도를 확인한다.
8. 게이트 라이브 세포 인구. CD8 ⁺ T 세포의 순도를 확인하기 위해, CD8 ⁺ T 세포의 비율을 확인.
   주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD8 ⁺ 세포의 비율은 약 90 % 이상이다.
9. 격리 된 CD8 ⁺ T 세포에 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. PBS에 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 단리 CD8 ⁺ T 세포를 재현 탁.
10. CD8 ⁺ T 가전에 레이블을 지정하려면시험 관내 억제의 분석을위한 LLS은 RT에서 5 μM의 농도를 얻기 위해 PBS에 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석.
    참고 : 본 연구에 사용 된 세포 증식 추적 바이올렛 염료의 대략 여기 및 발광 피크는 각각 405 및 450 나노 미터이다.
11. 15 ㎖의 튜브에 세포 증식 추적 보라색 염료 (5 μM) 세포 현탁액 (CD8 ⁺ T 세포를 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml)의 균등 한 양을 혼합하고 37 ° C에서 20 분간 인큐베이팅 하였다. 튜브마다 10 분을 소용돌이.
12. 감기 전체 RPMI 미디어와 튜브를 입력하고 실온에서 10 분 동안 튜브를 둡니다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전하게 상층 액을 제거하고 예열 된 완전한 RPMI 배지로 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. RT에서 15 분 동안 세포를 인큐베이션.

6. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T를 <사용하여 체외 억제 분석 설정서브> 등록 번호 및 CD8 ⁺ T 세포

1. 항 CD3 / CD28 코팅 구슬을 준비하려면, 관의 15 ㎖ (2.5 μL / 1 × 10 ⁵ 세포)에 자석 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다. PBS의 동일한 볼륨을 추가하고 혼합한다. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세척하고 상층 액을 버린다. 전체 미디어의 자기 구슬을 (50 μL / 웰) 희석.
2. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 나누어지는 50 μL U-바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 (1 × 10 ⁵ 세포 / 웰). 응답자 T (T의 _RESP)와 같은 CD8 ⁺ T 세포 세포 물론 당 (1 × 10 ⁵ 세포 / 웰)의 50 μl를 추가합니다. 물론 당에 희석 항 CD3 / CD28 코팅 구슬의 50 μl를 추가합니다.
   참고 : 다음과 같이 제어 우물을 설정할이 단계, 레이블 및 : 없음 항 CD3 / CD28 코팅 구슬 "만 자극되지 CD8 ⁺ T 세포를"; "CD8 ⁺ T 세포 만"항 CD3 / CD28 코팅 구슬; "CD8 ⁺ T 세포 만"항 CD3 / CD28 코팅 구슬;". T의 _{등록 세포} 만 "항 CD3이 / CD28 코팅 구슬 T의 _{등록 세포는} T의 서로 다른 비율로 전체 미디어와 공동 배양 T의 _{인공 호흡기 세포에} 의해 희석 될 수있다 _{RESP 세포} : T 세포의 _레지 (1 : 0.25-1 : 1).
3. 200 μL의 총 부피에 대한 모든 우물에 50 μL 또는 미디어의 적절한 볼륨을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 72 시간 동안 37 ° C에서 CO ₂ 배양기에서 배양한다.

CD8 ⁺ T 세포 7. 분석 CD8의 ⁺ T 세포 증식 및 사이토 카인 생산

1. 사이토 카인 생산 분석을 위해, 문화 3 일 후, 물론 다른 플레이트에 각각의 상층 액을 분리하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행합니다.
   주 : 상등액을 분취하고 -70 ℃에서 저장 될 수있다. 이 실험에서, 항 마우스 IFN-γ 항체 - 코팅 된 플레이트는 IFN-γ 생산 일치를 검출하는 데 사용제조 업체의 프로토콜에 보내고. 단일 세포 수준에서 CD8 ⁺ T 세포 증식의 IFN-γ 생산을 결정하기 위해, 세포 내 사이토 카인 염색법을 행할 수있다.
2. 각 우물에서 뜨는을 분리 한 후, 4 ° C (3 회)에서 2 분 동안 300 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기로 세포를 포함하는 접시를 씻으십시오.
3. 세척 후, 상층 액을 버린다. 증식 된 CD8 ⁺ T 세포의 염색 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어.
   참고 : FACS 버퍼에 방지 CD4 FITC, 안티 - CD8를 PerCP-Cy5.5 및 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료)를 추가, 항체 칵테일을 준비합니다.
   참고 사항 : CD44 또는 CD69 각종 마커에 대한 항체는 CD8 ⁺ T 세포의 활성화를 확인하는 다른 항체와 결합 될 수있다. CD8 ⁺ T 세포가 이미 증식 추적 V로 표지 된 기억단계 5.10에서 iolet 염료.
4. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 제거하고, 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다.
5. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. FACS 완충액 200 μL로 세포를 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의한 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 ⁺ T 세포의 증식을 측정한다.
   1. 게이트 생균 중 CD8 ⁺ T 세포 집단. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 및하기 식에있어서 CD8 ⁺ T 세포 희석액의 희석에 따른 분할 전적인 세포의 비율을 측정한다. 억제 % = [(T의 _{등록 세포의} 부재하에 증식 된 CD8 ⁺ T 세포의 % - T에 _{등록 세포의} 존재 하에서 증식 된 CD8 ⁺ T 세포의 %) / (%에서 증식 된 CD8 ⁺ T 세포T _{세포의 등록의} 유무)] X (100)는 또한 소프트웨어 ⁽²⁵⁾ 유동 세포 계측법을 사용하여 데이터를 분석한다.

결과

우리는 정맥 LCMV CL13의 2 × 10 ⁶ PFU로 주입함으로써 지속적인 바이러스 감염 쥐를 생성합니다. T의 _{등록 세포} 및 만성 바이러스 감염시 T _전환 세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 순진 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구는 다양한 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. CD4 ⁺ T의 _전환 (그림 1A, 상단 패널)와 Foxp3의 ^{- -} CD8 ⁺ T의 _전환 (그림 1B, 상단 패널) 셀 (16) 라 파이에서, PD-1은 Foxp3를 모두 상향 조절했다. Foxp3의 ⁺ CD4 ⁺ T 세포의 _레지의 주파수는 나이브 마우스 (도 1...

토론

T _{세포의 레지} 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 ^15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 ^13,14 세포 증가 _REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. _{레지 세포} 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하기 위해, 자신의 억제 활성을 측정 할 필요가있다.

여기서는 T에 _{등록 세포의} 생체 표현형 분석 및 CD8 ⁺ T 세포와 T에 _{등록 세포의} 시험 관내 공동 배양 시스템을 사용하여 억제 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 현재 프로토콜의 중요한 단계는 분석 및 T의 _{등록 세포의} 분리이다. 라이브 갓 절연 T <...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FITC 쥐 안티 마우스 CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
고정 완충액		BD Biosciences	554655
FITC 쥐 안티 마우스 CD25	7D4	BD Biosciences	553072
세포 여과기, 70 mm		BD Biosciences	352350
세포 여과기, 40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081
마우스 IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1x)		GE 생명 과학	SH30256
ACK 용해 버퍼		Gibco	A10492-01
L-글루타민, 200 mM 용액		Gibco	25030
페니실린-스트렙토마이신, 10,000 U/ml		Gibco	제10378-016
LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트		Life Technologies	L-34975
CD8a+ T 세포 분리 키트, 마우스		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ 조절 T 세포 분리 키트, 마우스		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS 분리 컬럼, LD 컬럼		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS 분리 컬럼, LS 컬럼		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
소 태아 혈청		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II 유세포계		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
혈구분석기		Marienfeld superior