이 프로토콜은 서로 다른 유전적 배경을 가진 기생충 제브라피시 배아를 생성하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 제브라피시 배아의 탁월한 이미징 기능과 결합하면 이 방법은 관심 후보 유전자에 대한 세포 자율 기능과 비세포 자율 기능을 조사할 수 있는 독특하고 강력한 수단을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
다른 유전 적 배경이 동물의 수술 parabiosis는 세포 고유의 독특한 유전 적 설정에서 후보의 관심의 유전자, 세포의 철새 행동 및 분비 신호에 대한 세포 외부의 역할 비교 연구하는 독특한 시나리오를 작성합니다. parabiotic 동물이 공통의 순환을 공유하기 때문에, 하나의 동물에서 어떤 혈액 또는 혈액 매개 인자는 파트너와 그 반대의 경우도 마찬가지 교환 해주는 서비스입니다. 따라서, 하나의 유전 적 배경으로부터 유래 세포 및 분자 요인 제 유전 적 배경과 관련하여 연구 될 수있다. 성인 쥐 Parabiosis는 연구 노화, 암, 당뇨병, 비만, 뇌 발달에 광범위하게 사용되어왔다. 최근 제브라 피쉬 배아의 parabiosis는 조혈의 발달 생물학을 연구하는 데 사용되었습니다. 마우스와 대조적으로, 제브라 피쉬 배아의 투명한 성질은 F를 조사하기위한 고유 강력한 방법 만드는 parabiotic 맥락에서 세포의 직접적인 시각화를 허용undamental 세포 및 분자 메커니즘. 이 방법의 유용성은, 그러나, parabiotic 제브라 피쉬 배아 발생 가파른 학습 곡선에 의해 제한된다. 이 프로토콜은 관심의 후보 유전자의 역할을 조사하기 위해 서로 다른 유전 적 배경이 제브라 배아 blastulae 융합 수술 방법에 대한 단계적인 방법을 제공한다. 또한, 상기 제브라 parabiotic 배아 가능한 유전자 발현의 시간적 제어하게 열충격 내성이다. 이 방법은 복잡한 셋업이 필요하며 배아 개발하는 동안 생체 내에서 세포 이동, 운명 사양 및 분화 연구를위한 다양한 응용 프로그램을 가지고 있지 않습니다.
서론
야생 형 및 유전자 변형 동물 사이의 유전 적 모자이크 (키메라)의 생성은 세포 고유의 후보 유전자 1-6의 세포 외부 기능에 대 조사하는 잘 설립하고 고전적인 전략이다. 제브라 피쉬의 포배 이식 널리 세포 자율성 7-9의 연구를위한 키메라 배아를 생성하는 데 이용되고있다. 관심있는 조직에 따라, 그러나, 예측 원하는 조직 (예컨대, 혈액) 1-3, 7-9에 공여 세포를 대상으로 어려울 수있다. 마우스 유전 학자 긴 공유 순환 10-14으로 결합 된 유기체를 생성하는 parabiotic 수술 방법을 이용했다. parabiotic 동물이 공통의 혈류를 공유하기 때문에, 다른 유전 적 배경의 다른 동물의 세포 하나의 동물에서 유래 세포 사이의 상호 작용은 10 ~ 16를 공부하실 수 있습니다. 최근, 카 리마 Kissa의 그룹은 우아하게 CRE 할 수있는 능력을 입증결합 된 제브라 피쉬 배아를 먹은 후 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 마이그레이션 (15)을 연구하기 위해이 시스템을 사용합니다. 또한, 피쉬 parabiosis 최근 조혈 줄기 세포 (HSC) 출현 이전 16 내피 헤린 (5)의 역할을 조사하고 제브라 개발 17
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프로토콜
이 프로토콜은 보스턴 아동 병원 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시 된 방법 (15)에서 수정됩니다.
시약 1. 준비 (사전에 일 또는 주)
- 1.5 % 아가 로스 코팅 요리를 준비합니다. 삼각 플라스크에 100 ㎖ Zebrafish의 E3 매체에 1.5 g 아가로 오스를 추가합니다. 열, 아가로 오스를 분해 한 후 약 5 ml의 100mm 직경 X 20mm 깊은 페트리 접시에 붓는다.
참고 :이 배아의 dechorionation에 사용 (3.1 단계)과 parabiotic 수술 (3.3 단계)된다. 몇 주 동안 4 ° C에서 아가 로스 코팅 요리를 저장; 냉장고 밖으로 데리고와 따뜻한 parabiotic 수술 당일의 아침을 실온으로. - 4 % 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 교반 막대와 함께 삼각 플라스크에 E3 100ml에 메틸 셀룰로오스 분말 4g을 녹인다. 최저 속도로 설정 4 ° C에서 교반 접시에 플라스크를 놓고는 혼합 할 수최대 2 일.
- 일시적으로 메틸 셀룰로오스의 흰색 덩어리를 헤어 주걱을 사용합니다. 메틸 셀룰로오스 결정은 완전히이 농도에서 용해되지 않습니다. 용액을 명....
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결과
이전에 발표 된 연구 (15)과 일치, 제브라 피쉬 배아의 성공적인 parabiotic 융합 준비와 방향 두 개의 배아 및 메틸의 농도에 따라 달라집니다. 몇 가지 간단한으로 저렴한 도구는 수술 융합 개발 blastulae 공유 순환 parabiotic 배아로 성장이 발생했다. 이 도구는 수정 된 파스퇴르 피펫, 10 ml를 피펫 펌프, 단독 또는 실험실 필름에 의해 단부에 고정 겔 로딩 팁 또는 유리 미세 주사 바늘 (그림 1)과 중 사용 된 목재 처리 괴롭 히고 바늘을 포함했다.
4 % 메틸 셀룰로오스에 두 blastulae을 배치하고 서로 (그림 2A)을 마주 보는 그들의 동물 극로 방향을 젤 로딩 팁을 사용 후, 배아는 신중하게 유리 마이크로 인젝션 N과의 접촉 자신의 지점.......
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토론
Parabiotic 융합은 성인 쥐 모델과 병아리 배아 10-14에서 후보 유전자의 세포 기능을 조사하는 강력한 도구왔다. 더 최근, 포배 융합 방법 연결형 제브라 배아 15를 생성하기위한 설명되었다. 본 프로토콜에서는, 비디오 기반 자습서 보여 더 나은 조혈 개발에 대한 관심의 후보 유전자의 시간적 세포 고유하고, 세포 외부의 역할을 연구하기 위해 서로 다른 유전 적 배경 parabiotic 제브라 피쉬 배아를 만들기위한 방법을 설명하는 데 사용되는 이후.
이 논문에 기술 된 방법은 최근 서로 다른 유전 적 배경의 배아, 이후 생착 및 분화 16, 하나의 배아 혈액 순환을 통해 마이그레이션을 HSC의 출현을 추적하는 데 사용되었다. Kissa 그룹의 조사 결과, 준비 및 배아의 위치와 일치 성공률을 결정하기 위해 발견그리고 parabiotic 융합의 해부학 적 특성. 프로토콜에 대한 몇 가지 주요 변경으로 parab.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
원고에 대한 유용한 의견을 주신 Julie R. Perlin에게 감사드립니다. D.I.S.는 미국 혈액학회, Cooley's Anemia Foundation, 그리고 NIH (K01DK085217와 R03DK100672)로부터의 보조금에 의해 지원됩니다. E.J.H.는 Helen Hay Whitney Foundation의 Howard Hughes Medical Institute Fellow입니다. B.L.은 Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow입니다. B.W.B.는 Cancer Research Institute의 Irvington Fellowship과 Young Investigator에 의해 지원됩니다. ASCO의 Conquer Cancer Foundation에서 수여하는 상입니다. L.I.Z.는 NIH(R01CA103846, P01HL032262, R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute의 보조금을 지원받고 있으며, Howard Hughes Medical Institute의 연구원입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 메틸 셀룰로오스 | 시그마 | M0387 | |
| E3/HCR용 개별 구성 요소: | 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl(염화나트륨) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl(염화칼륨) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (염화칼슘 이수화물) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4(황산마그네슘 헵타하이드레이트) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M) 완충 용액 | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog 번호 | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | |
| 50 mg/ml Streptomyces griseus | Roche | ||
| 바늘에 사용되는 모세관 유리(Capillary Glass & 필라멘트) | 셔터 기기 | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| 나무 손잡이가 있는 티징 바늘 | Fisher Scientific | S07894 | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10ml 피펫 펌프(녹색) (피펫 펌프 피펫터) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 직경 100mm/ 깊이 20mm의 플라스틱 페트리 접시(PETRI 접시, 100/20MM, PS, CLEAR, 통풍구 포함, HEAVY DESIGN, 15개/봉지) | Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000MW, 음이온성, 라이신 고정성 | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. 작업 재고는 0.003%(50x는 0.15%)입니다. 500ml의 경우 0.75g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 트리카인 (분말) (트리카인 메탄 설포나토, 트리카인 -S) | 웨스턴 케미컬 Inc | MS 222 | |
| LMP 아가 로스 (초순수 LMP 아가 로스) | Invitrogen | 16520100 | |
| 플라스틱 전사 피펫 (내가 생각하기에 넓은 끝) | Fisherbrand | 137115AM | |
| 이미징에 사용되는 유리 바닥 6 웰 플레이트 | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| 나무 손잡이 해부 바늘 끝에 고정된 플라스틱 웨스턴 젤 로딩 팁(GELoader 팁) | 경우 Eppendorf | ||
| Glass 커버 슬립, 슬라이드 및 진공 그리스: | |||
| 진공 그리스(Dow Corning® reg; 고진공 실리콘 그리스 무색, 무게 5.3oz(튜브)) Dow | Corning | Z273554 | |
| Glass 커버 슬립 | 코닝 생명과학 | 2960-244 |
참고문헌
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
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재인쇄 및 허가
