일차 인간 기관지 상피 세포는 형질도입이 어렵습니다. 이 프로토콜은 렌티바이러스의 생산과 농도뿐만 아니라 가성층화된 상피로의 분화를 통해 이러한 세포에서 매우 효율적인 형질도입을 달성하는 데 필요한 최적의 배양 조건을 설명합니다.
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방법 논문
최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포
이 논문에서
요약
초록
호흡기 세포 분화 및 기능의 처리를 연구하는 유용한 모델을 공기 - 액체 계면 상태를 제공하여 기본 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 시험 관내 배양한다. 지난 몇 년 동안, 유전자 전달에 대한 렌티 바이러스 벡터의 사용은 일반적인 관행이되었다. 특정 비 HIV 의사 입력 렌티 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입의보고가 있지만, 전체의 전달 효율이 일반적으로 15 % 미만이다. 여기에 제시된 프로토콜은 신뢰할 수 있고 효율적인 방법 렌티 바이러스를 제조하고,이 차 인간 기관지 상피 세포를 형질 도입하기를 제공한다. 세포가 부착하는 동안 4 감염 인자의 다양성과 함께, 미분화 기관지 상피 세포, 기관지 상피 성장 배지에서 형질을 사용하여 100 %에 가까운 효율을 제공한다. 이 프로토콜은, 단계적으로 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 및 제의 제조와 농도를 설명전자 전달 방법. 이는 일차 인간 기관지 상피 세포 transductions 고효율을 달성하기 위해 최적 배양 조건을 결정 실험을 설명한다.
서론
복제 결함, pseudotyped 렌티 바이러스의 개발 (LV)는 관내 1 유전자를 전달하기 위해 안전하고 효율적인 방법으로 연구자를 제공하고 있습니다. 그들의 장기 표현이 LV는 또한 생체 내에서 2,3- 치료제의 전달을 위해 사용될 수있다. LV의 생산은 여러 플라스미드 인간 배아 신장 (HEK) 세포의 공동 - 형질 필요 전이 벡터 포장 개그 / 폴, 포장의 회전을하고, 수 포성 구내염 바이러스 당 단백질 (VSV-G) 플라스미드 봉투. 레브 유전자하여 복제 가능 렌티 바이러스를 생산하는 재조합의 가능성을 감소시키는, 별도의 패키징 플라스미드 인코딩되기 때문에 제 3 세대 포장 시스템은 제 2 세대 시스템보다 안전한 것으로 간주된다. 2 세대 포장 시스템 다섯 배 더 높은 총 전달 유닛을 수득하지만, 원래의 바이러스 게놈의 분할 만드는3 세대 시스템은 최소한 3,4- 전달 레벨이 감소하고있다.
세포주를보다 쉽고 효율적으로 형질 도입 될 수 있지만 이러한 생체 더 대표는 5,6 어떤 조직이 있기 때문에, 연구자들은 일차 전지에 그들의 초점을 이동하....
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프로토콜
1. 1 단계 : HEK 293T의 문화
- 고 글루코스 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 (HEK 매체로 칭함) HEK 세포 매체를 준비한다.
- 코트 콜라겐 콜라겐 I. 믹스 30 μL I 증류수 2 ㎖에 한 10cm 조직 배양 접시. 접시에 믹스를 확산하고 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 품어.
- 믹스를 제거하고 15 분 동안 층류 캐비닛의 접시를 건조하게 할 수 있습니다.
- HEK 10 ㎖ 배지에서 1 × 106 세포의 밀도로 피복 된 접시 상에 플레이트 HEK 세포를 37 ℃에서 배양한다, 5 % CO 2.
- HEK 세포 (2~3일 도금 후 그림 1a) 50-60% 합류 경우, 포화 상태의 2 비주얼 평가를 충분한되는 무대로 진행합니다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다.
참고 : HEK 세포 (위 참조) HEK 미디어에서 배양한다. 그들이 포화 상태에 도달 t헤이 분할 (예 : 1/5) 또는 나중에 사용하기 위해 아래로 고정 할 수 있습니다.
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결과
도 1은도 1a. 형질 감염 과정 셀 솔루션을 평가하는 다른 주요 단계를 도시 전에 바이러스 생산을위한 형질 전환에 HEK293T 세포의 최적의 포화 상태를 나타낸다. 이는 세포가 접시에 걸쳐 균등하게 분배하는 것이 중요하다.도 1b는 명 시야 광학계 및 10X 대물 렌즈를 이용하여 형질 전환 혼합물의 드롭 침전물을 보여주고있다. 더 많은 침전물이 모래 입자가 아닌 덩어리처럼, 더 효율적인 형질이 될 것입니다. 이 그림에서, 침전물 비트 조대하다. 침전물 형질 감염 바이러스의 높은 역가를 생성할지 여부를 신뢰성 지표이다. 재료 중 하나가 누락되거나 품질이 좋지 않은 (예를 들어 벡터 DNA) 중 하나 인 경우, 응집은 불길한 기호 인 형성 할 것이다. 이 경우, 그 확인하고, 중단하고 절차를 다시 현명모든 성분이 혼합에.......
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토론
여기에 설명 된 프로토콜은 100 % 전달 효율에 가까운 보장합니다. 그러나,이 목표를 달성하기 위해 중요한 과정에서 단계가있다. 예를 들어, 형질 전환 과정은 형질 믹스 석출물의 존재 (드롭) 또는 접시에 형질 도입 (도 1b 및 d) 다음날 좋은 형질 대한 중요한 양이다. 침전 또는 응집의 존재 유무는 형질 전환 시약 중 하나의 누락, pH가 문제 또는 불량 플라스미드 제조에 기인 할 수있다. 침전물이없는 경우, 아무도 그 다음날 볼 수 없습니다 가능성이 매우 높습니다. 또한, 형질 전환 및 수율을 방해은 HEK 세포가 분리 될 수 있습니다 너무 빨리 형질 혼합 또는 HEK 미디어를 추가. 좋은 수율의 또 다른 표시는 원심 분리 단계 이전에 6 일째에 있습니다 : 흰색 침전물 튜브의 하단에 표시해야한다. 거의와 나쁜 형질더 바이러스는이 백색 침전물을 생성하지 않습니다. 형질 도입 절차 동안, 탈 분화 높은 형질 도입 효율을 달성하기 위해 상태와 같은 줄기 세포에 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 폐를 제공하기 위해 마이애미 대학의 생명 얼라이언스 장기 복구 기관 감사합니다. 우리는 또한 우리는 또한 가브리엘 Gaidosh 감사도 2b 및 3-D, C.에도 3a에 실험에 사용되는 mCherry 바이러스 박사 벤 Gerovac 리사 노박에 나타난 실험에 사용되는 DNA의 준비를 위해 박사 리사 Künzi 감사합니다 이미징 시설에서, 마이애미 대학 안과학 교실.
본 연구는 NIH의 CF 재단과 박사 마티아스 Salathe에 승무원 의학 연구소에서 보조금을 후원하고있다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HEK293T/17 세포 | ATCC | CRL-11268 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Sigma | 12306C | , 10%DMEM에서 사용 |
| , Thermo Scientific | 11995-040 | ||
| 페니실린/스트렙토마이신(100x), | Thermo Scientific | 15140-122 | 1x |
| Collagen I | 사용, BD Biosciences | 354231 | 증류수에서 1:75 희석 |
| Calphos | Clontech | 631312 | 2 M 칼슘 용액, 2x HEPES 완충 용액(HBS) 및 멸균 H2O |
| 폴리틸렌 글리콜 8000 | VWR scientific | 101108-210 | 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | |
| 트립신 | Sigma | T4799 | |
| 대두 트립신 억제제 | Sigma | T9128 | |
| Transwell에서 사용 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | 증류수 1:10 희석 |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo에서 사용 Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | 렌티바이러스 발현 벡터 |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | 패키징 DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | 패키징 DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | 패키징 DNA |
참고문헌
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene thera....
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재인쇄 및 허가
