방법 논문

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

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DOI:

10.3791/54203

⸱

2016년 6월 29일

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, New York University School of Medicine, 2Department of Pathology, New York University School of Medicine

이 논문에서

요약

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

초록

전반적으로, T 세포 유착, 면역 시냅스 형성 항원 제시 세포 (APC)와 상호 작용 및 염증 부위로 세포 모집 고유 프로세스에 기여 함수의 중요한 구성 요소이다. T 세포의 혈관 작용은 순환 자체에 의해 발생되는 전단 응력에 의해 도전하는 동안 T 세포 유착이 두 상황은 휴대 APC 상호 정적으로 간주 될 수있는 T 다르다. T 세포 APC 상호 작용은 두 개의 휴대 파트너가 서로 정적 상대적 점에서 정적으로 분류하고 있습니다. 일반적으로, 이러한 상호 작용이 임파절 내에서 발생한다. T 세포가 혈관의 벽과 상호 작용으로 세포를 구속하고 생성 된 전단 응력에 저항해야한다. -1,2- 이러한 차이는 더 두 가지 규정하는 처리와 유동 조건에서 고정 부착 및 접착 성 증진의 필요성을 강조. T 세포 접착의 조절이 가장 간결 단점이라고 할 수있다세포 표면에 발현 분자 인테그린과 상호 작용하여 세포의 표면에 발현되는 접착 분자 인테그린 리간드의 상호 작용을 조절하는 친 화성 상태 조업. 인테그린 선호도 상태의 규제의 우리의 현재 이해는 체외 모델 시스템에서 종종 단순한에서 온다. 접착 여기서 설명 유동 조건을 사용하여 분석하고 시각화 자극 다음 실시간 T 세포 상피 세포 상호 작용의 정확한 정량을 허용한다. 유동 검정 하에서 접착 저해 또는 자극 물질로 처리 다음 T 세포 내 시그널링 밀착성 시험에 적용될 수있다. 또한,이 분석은 접착제 백혈구 집단 및 인테그린 접착 분자 쌍 T 세포 신호 전달을 넘어 확장 될 수있다.

서론

T 림프구 접착 성 T 세포 트래 피킹 및 항원 제시에 중요한 역할을 수행하는 3 건강한 면역 시스템의 고유 프로세스들을 중재한다. 면역 감시 또는 접착이 두 가지 역할이 중요한 활성 면역 반응 동안의 여부. 4 T 세포 - 내피 세포 상호 작용의 생리 학적 신호 이벤트 (APC) 상호 셀 제시 T 세포 항원을 구별하고, 따라서의 구분 방법을 필요 연구는 가장 관련된 신호 폭포를 이해합니다. 림프구 넘쳐 중에 혈관 벽에 대한 T 세포의 밀착성 신속한 동적 인테그린 활성화를 필요로한다. 내피 따라 액티브 상태 인테그린 접착 분자 간의 긴밀한 상호 작용은 T 세포가 세포 통로 허용 영역 검색에 표면을 따라 기어 있도록 혈류에 강한 접착력을 이끈다. 5 T 세포의 Bi 크롤링 -directionally 아론GA 혈관벽은 T 세포의 구별 접착제 선단부와 편광 접착시에 의존한다.도 6은 가장 중요한 것은, 밀착성 및 윤회 혈류 순환에 의해 발생되는 전단력에 대한 저항을 요구한다.

림프구 접착력을 연구하는 실험을 설계 할 때,주의가 관심있는 특정 자극에 지불해야한다. 인테그린 활성화하는 T 세포 유착 모든 형태의 일반적이고 중요한 요소이지만, 활성화 캐스케이드의 개별 수용체 공동 수용체의 하류 고유 할 가능성이있다. 마찬가지로, 인테그린 및 접착 분자 쌍은 전문 미세 환경에서 특정 소집단에 작동합니다. 이와 같이, 이러한 쌍은 매우 다르게 조절 될 수있다. 여기에 제시된 모델은 전단 응력 조건에서 발생하는 활성화를 인테그린에 이르는 폭포 신호의 연구에 이상적입니다. (7) 이러한 상호 작용이 적절히 정적 adhesi에서 이해 될 수 없다시스템에 의한 충격이 힘은 8 비록. T 세포의 행동을 직접 갖고 도시 한 인간 ICAM-1 (CHO-ICAM 세포)를 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포 및 CHO (중국 햄스터 난소) 세포 시스템을 수 여기서 제시 쉽게 백혈구 집단 또는 다른 부착 분자 연구를 수정할.

이 분석은, 백혈구의 혈관 외 유출의 밀착성 스테이지에 대한 모델을 제공하고, 전단 응력을 이용하여 T 세포의 접착 성 및 인테그린 활성화를 정량하는 방법을 제공한다. CHO-ICAM 세포를 이용하여 살아있는 세포에서의 리간드 LFA-1의 친화 관심 다양한 자극에 응답하여 실시간으로 검사 할 수있다. 이러한 기술은 용이하게 크게 다른 모델에 비해 혈류 및 전단 응력을 모델링하는 데 필요한 장비를 단순화 주사기 펌프를 조합하여 시판 미세 유동 챔버를 얻을 필요. (9) 상기 분석의 다른 주요 장점은 특정 시그널링 있다는캐스케이드 개별 인테그린의 결과 활성화 상태는 깨끗하게 관심 인간 부착 분자를 발현하는 CHO 세포 공학을 사용하여 조사 할 수있다. 또한, 생균 이미징 정량적 데이터의 조합이 방법의 중요한 장점이다. 정적 T 세포 부착 분석법 다수 좋게 T 세포 APC 상호 작용을 모델링하는 설명되었지만 전반적으로,이 모델은 T 세포의 상피 부착 동적 프로세스 포착이 불충분하다. 접착 시험을 선택할 때이 때문에, 당해 자극을 고려해야한다.

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프로토콜

1. 도금 CHO-ICAM 세포

주 :이 단계의 목적은 합류 단층을 생성하는 것을 목표로 밤새 성장 유동 챔버의 CHO-ICAM 세포 플레이트이다.

  1. 5 %, 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (CHO-ICAM 완전 배지)로 보충 된 10 ml의 RPMI 배지에서 10cm 조직 배양 처리 된 배양 접시에서 CHO-ICAM 세포 유지 CO 2.
  2. 세포를 수집하기 위해, 1 ml의 0.5 % 트립신 EDTA를 추가하고 온화한 진탕 1 분 동안 실온에서 배양한다. 미디어의 4 ml의 트립신을 중화.
  3. hemacytometer를 사용하여 CHO-ICAM 세포를 계산하고 챔버 당 0.75 × 10 5 세포를 계산합니다. 참고 :이 실험에서 : 2.25 × 10 5 세포 3 실 시드 필요합니다.
  4. 원심 0.75 × 105 CHO-ICAM의 500 XG, 실온에서 5 분 동안 실 당 세포 및 CHO의 챔버 당 30 μL의 세포 펠렛을 재현 탁-ICAM 전체 문화 미디어.
    참고 :이 실험에서는 90 μl의 3 챔버 시드 필요합니다.
  5. 천천히 유량 용기의 한 저수지로 세포를 추가합니다. 세포가 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 5 분 동안 정착하도록 허용합니다.
  6. 각 실의 두 저수지에 걸쳐 완전한 배양 배지 200 μl를 추가합니다. 시스템이 평형화 같이 둘 사이의 추가는 다른 세포의 이동을 방지한다.
  7. 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기 내에서 하룻밤 세포를 품어.

T 세포의 제조 2

주 :이 분석은 일차 인간 T 세포 또는 T 세포 라인으로 수행 될 수있다. 혈액 T 세포의 분리에 대한 프로토콜은 이전에 설명되었다.하여 10 일차 인간 T 세포가 최상의 결과를 새롭게 분리 된 세포를 사용하는 경우. T 세포 라인을 사용하는 경우, 셀의 소스에 의해 지정된 배양 프로토콜을 따른다. 형광 microsco에 세포를 검출하기 위해T 세포가 카복시 플루오 레세 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 표시되어 퍼가기.

  1. hemacytometer를 이용하여 T 세포를 세어 챔버 당 2 × 106 개 세포를 계산한다. 주 :이 실험에서는 6 × 106 세포를 3 챔버에 대해 필요하다.
  2. 원심 분리 (2)는 T × 106 500 × g으로 실온에서 5 분 동안 세포 챔버 당 1 % 글루코스 또는 2 % FBS를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖의 세포 (PBS)에 재현 탁.
  3. 1 CFSE 추가 : 1000 희석 (주 5 mm로했다). 빛 덮고 실온에서 8 분 동안 품어
  4. 5 분, RT 500 XG에 스핀.
  5. 조건 당 240 μL에 재현 탁 세포 펠렛을 RPMI 미디어 부족 혈청 (4 절 "주의"를 참조하십시오). 이 실험에서는, 일반 RPMI 720 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 각 챔버, 튜브 당 240 ㎕의 표지 빈 1.5 ml의 튜브에 세포를 나눈다. 사용할 때까지 37 ° C 열 블록의 세포를 유지합니다.

3 일 설정전자 입력 / 출력 뿌리고과 주사기 펌프

  1. 37 ° C에 현미경 라이브 영상 실을 따뜻하게.
  2. 입력 뿌리고을 준비합니다 :
    1. 물 500㎖의 유리 병을 채우고 뚜껑으로이 구멍을 만든다. 그리고 "의"구멍 레이블을 "알아." 이 입력 매체 가열 수조로서 작용한다.
    2. 뚜껑과 수조 내로 관통 뿌리기 입력을 실행. "출력"구멍을 통해 제공되는 주사기에 연결 뿌리고의 측면 구멍 "에서", 입력 저수지에 연결 측면을 통해 오는 있는지 확인합니다.
    3. 시스템에서 모든 공기를 제거하기 위해 물 60 ㎖로 뿌리기 입력을 플래시합니다.
    4. 프라임 RPMI 미디어 혈청 부족으로 뿌리기 입력은 37 ° C로 예열. 60 ML의 주사기를 입력하고 뿌리고 완전히 끝났다과 공기 방울을 결여 될 때까지 미디어를 통해 밀어 넣습니다.
      참고 : lengt 기반으로 주사기 Z- 추적 injection.Size에 따라튜브의 시간은 달라질 수 소수에 필요한 볼륨을 사용했다.
      1. (여기서 3) 실험 챔버의 수에 의해 분 (5 분)의 개수에 의해 흐름 (여기에서는 0.3 ㎖ / 분)의 속도를 곱함으로써 실험에 필요한 매체의 부피를 계산하게하고; 이 실험에서, 4.5 ml의 용지를 사용합니다. 참고 : 우리는 프라이밍 후 주사기에 남아있는 (여기에 9.5 ㎖의 총) 5 ml의 여분의 체적을 갖는 것이 좋습니다.
    5. 37 ° C를 유지하기 위해 현미경의 라이브 영상 인클로저에 전체 입력 설정을 놓습니다. 뿌리고을 실행하고 인클로저 밖으로 주사기와 주사기 펌프에 주사기를로드합니다.
  3. 출력 뿌리고을 준비합니다 :
    1. 출력 폐기물로 사용하는 250 ml의 병의 뚜껑에 구멍을 만듭니다.
    2. 구멍을 통해 병에 출력 튜브를 실행합니다. 느슨하게 뚜껑을 고정하는 모든 방법을 폐쇄하지.
    3. 마일의 라이브 영상 인클로저로 출력 설정을 배치croscope.
  4. 원하는 전단 응력 (DYN / cm 2)을 생성하기 위해 상기 유량 (ml / 분)에 필요한 계산. 전단 응력 따라서 계정으로 세포 연구 할 유형과 치료 전단 스트레스 수준 결정을 포함하여 전체 모델을, 다른 혈관 구획에 따라 다릅니다.
    참고 :이 실험은 밀접하게 작은 정맥 설정을 모방하기 위해 0.4 DYN / cm 2에서 수행된다.
    1. 전단 응력을 계산할 때 고려 챔버의 크기를 가져 가라. 여기에 사용 된 흐름 챔버 용 (제조업 (11)에 의해 제공) 다음 공식을 사용 (재료의 표 참조) : T = η * 176.1 *의 ø는 T = 전단 응력, η = 동적 점도, ø는 = 유량 곳. 참고 : 37 ° C에서 RPMI 미디어의 동적 점도는 0.007이다.

셀 흐름 챔버와 자극 4.로드

주 : 접착을 개시하기 위해,T 세포를 자극한다. 다음 실험에서 세포를 자극되지 남아 있거나 SDF-1α (12) 또는 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA, 양성 대조군)으로 자극 13. T 세포에 대한 케모카인의 적절한 프리젠 테이션을 위해, CHO-ICAM 세포는 세포 표면에 프레 수 (연속 세척 하였다) SDF-1α와 함께 예비 인큐베이션한다. PMA는 제 톡 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사한 포르 볼 에스테르; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다. T 세포는 바로 전에 유동 챔버 내로 로딩하기 PMA로 처리된다.

  1. 현미경의 흐름 챔버 슬라이드를 놓고 20 배 목표를 사용하여 CHO-ICAM 단층에 초점면을 설정합니다.
  2. 37 ° C 열 블록에있는 다른 모든 조건 CFSE - 스테인드 T 세포를 유지합니다. 그 조건에 대한 분석 직전에 다음과 같이 CHO-ICAM 또는 T 세포를 준비합니다
    1. 비자극 조건 (챔버 (1))의 경우, 하나의 튜브 / 유동 채널을 유지치료 황색, 자극에 대한 부정적인 제어를 제공합니다.
    2. PMA 자극 (챔버 (2))의 경우, 양성 대조군으로서 역할하는 PMA (10 NG / ㎖)와 T 세포를 자극 한 튜브; 유량 용기에 넣기 전에 즉시 처리합니다.
    3. SDF-1α 자극 (챔버 (3))의 경우, 상부 리저버 (출력 저장조)에서 한 번에 3 회 70 μL를 제거하고 SDF의 70 μl를 첨가하여 SDF-1α (100 NG / ㎖)와 제 3 유동 챔버를 자극 -1α (100 NG / ㎖) 하부 통 (입력 저수지)로. 5 분 동안 품어.
  3. 하나의 챔버의 출력 저장소로부터 3 회 제거하고 시간에 70 μl를 버린다.
  4. 입력 저수지로 3 회를 전처리 (해당되는 경우) T 세포 현탁액의 70 μl를 추가합니다. 세포가 챔버 ( "에서")의 입구에서 이동할 수 있도록하기 위해 5 분을 기다린 챔버의 근위 출구 ( "아웃")에 도달 할 수 있습니다.
  5. 이 시간 동안, 화상 (5)CFSE - 스테인드 T 세포에 대한 필드. 챔버 (그림 1)의 중심에 걸쳐 분산되어있는 필드를 선택합니다. 여기 레이저 파장 : 다음 여기 / 방출 488 nm의 조건으로 사용하는 단계; 발광 컬렉션 필터 : 500-540 나노. 이러한 이미지는 미리 유동 세포 수의 역할을한다.
  6. 유량 용기 저수지에 동시에 입력 및 출력 튜브를 연결합니다.
    주 : 챔버 내에 기포를 도입하여 챔버 내의 전체적인 균형을 유지하지 않도록 동시에 튜브를 부착하는 것은 매우 중요하다.
  7. CFSE - 스테인드 T 세포를 시각화하는 동안 0.3 ml / 분 (0.4 DYN / cm 2)에서 흐름을 시작합니다. 흐름은, 특히 제 1 챔버와, 시작으로, 따라서 T 세포 이동의 개시 타이밍에서 5 분 시작 종종 유동을 시작 및 T 세포를 관찰 압연의 차이도있다.
  8. 5 분 후, 흐름을 종료하고 CFSE 채널에서 이미지 필드 5. 무작위로 죽 분산 필드를 선택유동 챔버의 중심 ughout (도 1). 이러한 이미지는 이후 흐름 세포 수의 역할을 할 것이다.

5. 접착 세포의 비율을 결정

주 : 획득 된 영상에서 세포 수의 측정은 자동 소프트웨어 객관적으로 이루어진다. 우리의 연구에 우리는 ImageJ에 (버전 1.48V)와 같은 소프트웨어 Volocity (버전 6.2.1)하지만 다른 소프트웨어를 사용하여도 적용 할 수있다.

  1. 각 조건에 대한 필드 사전 흐름 당 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 "프리 플로우 평균 세포 수"입니다. (7)
  2. 각 조건에 대한 필드 이후의 흐름에 따라 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 "포스트 흐름 평균 세포 수"입니다. (7)
  3. 다음 수식을 사용하여 부착 된 세포의 비율을 계산 / (프리 플로우 평균 세포 수) = 부착 세포 (포스트 플로우 평균 세포 수)의 비율 × 100 %.

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결과

나타낸 바와 같이, 대표적인 결과 SDF-1α 자극, 주르 케트 일차 인간 CD3 + T 세포를 사용하여 유동 부착 분석법에서 도시된다. 모든 도시 실험에서 음성 대조군은 무 자극 세포이다. 자극되지 않은 셀의 문턱 기저 %의 밀착성 5 사이 - 10 %; 특히이 범위에서 상기 기재의 밀착성이 문제가 실​​험을 나타내고 T 세포의 시작 인구 비특이적 제제에 미리 활성화 하였다 나왔다. 자극되지 않은 세포의 위에 각 조건에서의 포스트 플로우 %의 밀착성의 계산에 더하여 계산 될 수 접착 세포 수의 증가를 접어. 이 두 가지 계산 방법을 나타내는 데이터는 여기에 포함된다.

도 2a는 각 조건의 전후의 유동 흐름 챔버 내의 필드를 나타내는 이미지를 나타낸다. 실험에 앞서, 주르 케트 (쇼n은 그림 2A...

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토론

올바르게 T 세포 유착을 분석하기 위하여, 자극은 시험관 내 방법을 선택할 때 고려되어야 연구에 포함된다. LFA-1의 활성화 및 바인딩 ICAM-1에 이르는 신호를 연구하는 여러 가지 분석이 있지만 모든 방법이 서로 호환되지 않습니다. 정적 접착 분석 (10)는 최적의 T 세포 APC의 상호 작용을 연구하는 데 적합하다; 대안으로, 여기에 설명 된 전단 응력 방법은 T 세포 상피 세포의 상호 작용을 모델링하기에 이상적이다. 생체 내, 케모카인 단단히 부착 및 혈액의 전단 응력은 14, 15, 흐름 저항에 의해 응답해야 T 세포 롤링, 내피 함께 제공됩니다있다. 이런 이유로, 케모카인 시그널링의 연구는 전단 응력을 통합 한 분석에서 연구 될 것이 가장 적합하다. 유동 조건을 사용하여이 접착의 주요 장점은 T 세포와 인테그린과의 상호 작용을 모델링 단순하다. 이 분석은 매우 독특한 기능과 기계적 결합하나 인테그린 접착 분자 쌍의 연구 환경을 모델링하여 연구....

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

류마티스학 연구 재단(Rheumatology Research Foundation)과 히르쉴 트러스트(Hirschil Trust)가 이 연구를 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
T 세포 샘플(세포주 또는 일차)ATCCTIB-152말초 인간 T 세포
CHO-ICAM-1 세포ATCCCRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreatibidi80606
500ml 유리병FisherFB800500
250ml 유리병FisherFB800250
실리콘 튜빙 0.8mmibidi10841
인큐베이터 챔버가 있는 컨포칼 현미경Ziess700모든 광시야 형광 현미경
주사기 펌프New Era 펌프 시스템NE-300
60ml 주사기BD309653
CFSEeBioscience65-0850
SDF-1αR& D350-NS-010/CF
RPMI론자12-702F/12
PBS Lonza17-516F
마이크로 원심분리기Eppendorf 5424
D-글루코스시그마 알드리치G8270 
PMASigma Aldrich16561-29-8
Volocity 소프트웨어Perkin Elmer버전 6.2.1
ImageJ 소프트웨어NIH버전 1.48V
조직 배양 처리 배양 접시Falcon353003
Trypsin-EDTA (0.25 %) Phenol RedGibco 25200114
Heat Inactivated FBS덴빌FB5001-H
페니실린/스트렙토마이신피셔BP295950

참고문헌

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CHO ICAMCFSEPMASDF 1

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