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방법 논문

대한 대퇴골 창 회의소 모델

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54205

⸱

2016년 7월 28일

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Techna Institute, University Health Network

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

초록

골수는 다양한 조혈 및 비조혈 세포를 포함하는 복잡한 기관입니다. 이 세포는 조혈, 면역 조절 및 종양 조절을 포함한 많은 생물학적 과정에 관여합니다. 조직학 및 혈구 수와 같이 골수 내 세포 활동을 이해하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 생체 내에서 여러 세포 구성 요소의 동적 작용을 포착하기보다는 정적 정보를 제공합니다. 표준 방법을 보완하기 위해 쥐 골수에 있는 세포와 구조의 연속 생체 내 이미징을 가능하게 하는 창 챔버(WC) 기반 모델이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 대퇴골수에 대한 장기적인 광학적 접근을 용이하게 하기 위해 대퇴골에 WC를 설치하는 수술 절차를 설명합니다. 특히, 실험적 유용성을 입증하기 위해 이 WC 접근법을 사용하여 대퇴골의 혈관 네트워크 내에서 호중구를 이미지화하고 추적하여 골수에서 면역 세포 이동 및 조절을 시각화하고 정량화하는 새로운 방법을 제공했습니다. 이 방법은 조혈, 줄기세포 이식, 암을 포함한 병리학적 상태에서의 면역 반응과 같은 쥐 골수에서 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

서론

골수는 조혈 및 면역 조절에 관여하는 중요한 기관이다. 이는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)를 함유하는 성분으로 구성 조혈 및 중간 엽 세포 하나를 야기 비 조혈 전구 세포를 포함하는 기질 성분. 조혈 활동 3 분의 2는 골수 세포 2의 생성에 전념하고 있습니다. 1-2 × 10 11 세포는 정상적인 인간 성인이 하루 당 생성에 특히 호중구의 다수는 골수에서 생성된다. 호중구는 미생물 감염에 대한 방어의 첫 번째 줄에있는 스트레스가 주변 호중구 1,3-을 보완하기 위해 자신의 동원을 트리거 할 때까지 주로 골수에서 예약되어 있습니다. 그 항균 효과에 더하여, 최근의 연구에 따라 바뀌는 성장 프로 및 항 종양 표현형 모두 갖는 암 생물학에서 호중구의 주요 역할을 시사종양 미세 환경의 4,5에 신호 인자 베타 (TGF-β). 또한, 연구는 순환 호중구 세포 독성, 항 전이 효과를 발휘하면서 8 차 종양에 축적 호중구, T 세포의 세포 독성 -6,7- 기능을 억제함으로써 프로 종양 및 전이성 영향을 미치는 것을 설명했다. 이와 같이, 골수의 조혈 세포, 특히 호중구의 조사가 종양 면역 조절의 역할을 밝히기에 중요하다.

조직 병리학 및 전체 말초 혈액 카운트는 정기적으로 골수 구 셀룰러 및 구조적 변화를 평가하기 위해 사용된다. 그러나, 이들 방법은 단지 다른 세포 집단 또는 조직의 미세 구조의 정적 인 정보를 제공한다. 생체 내 이미징 종 세포에서 C뿐만 아니라 여러 세포, 혈관 및 간질 성분의 동역학을 평가하기 위해 표준 방법을 병용 할 수있다길이 방식으로 엘 상호 작용. 미세한 분해능 10 살아있는 동물의 생체 내에 촬상 정의 현미경 (IVM)는, 동일한 샘플 시간에 걸쳐 동적 세포 과정을 평가할 필요 실험 동물의 수를 감소하는데 특히 유용하다. IVM은 종종 주 개월의 기간에 걸쳐 이미징 관심의 기관에 액세스 할 수있는 만성적 이식 윈도우 실 (WC)와 결합된다. 두개골과 지​​느러미 - 피부 집계 WC 모델은 다시 1990 년대 중반까지 거슬러 올라가는 사용의 긴 역사를 가지고 있습니다. 최근 이러한 유방 지방 패드 및 다양한 복부 장기의 것과 다른 기관 특이 WC 모델 (11)이 개발되었다.

생체 내에서 골수 이미징의 일반적인 접근 방식은 얇은 뼈가 최소한의 수술 적 치료 12-14 단일 세포의 직접 시각화를 가능하게 마우스의 덮개 뼈, 주로 참여 노출을 보유하고 있습니다. 그러나, 두개골 골수 ㄱ 수도E HSPCs (15)의 유지 보수 및 개발 감소 나타낸다의 두개골에 HSPCs 저산소 세포의 낮은 숫자에 의해 입증 된 바와 같이, 이러한 긴 뼈 다른 뼈의 구별. 따라서, 긴 뼈의 세포 구성 요소를 평가하기위한 다른 방법을 조사하고 있습니다. 다음은 대퇴 골수 (16)의 직접적인 노출과 등쪽 피부 집계 WC (17)의 분할 대퇴골의 이소성 이식을 포함한다. 그러나, 전자는 더 긴 기간에 걸쳐, 셀룰러 구조적 및 기능적 변화를 추적하는 것을 허용하지 않는 터미널 절차이고, 후자의 가능성 때문에 등쪽 피하 지방 WC 내부 자궁외 사이트 대퇴골 이식 정상적인 골수 기능을 방해한다. 시간이 지남에 따라 대퇴골 골의 소성을 연속 촬영을 가능하게하는 또 다른 방법은 대퇴골의 WC의 사용이다. 하나의 이전 보고서는를 사용하여 대퇴 골수 미세 장기 영상을 보여쥐 18 WC를 대퇴골. 또한 저자는 모니터링 골수 전이에서의 유틸리티를 나타내는 대퇴골에서 종양 세포의 가시화를 보여 주었다. 그러나,이 WC 설계가 큰 마우스 (26-34g 나이 3-6 개월)에만 적합했다 대형 사이즈 (1.2 cm 직경)과 상대적으로 작은 이미징 영역 (4mm 직경)에 의해 제한되었다함으로써 제조 일상적인 사용을위한 실용적 접근.

따라서, 작은 전체 크기 새로운 WC 큰 내부 이미징 영역이 연구의 목적으로 설계되었다. 본 연구의 목표는 대퇴골 골 다양한 세포 유형을 묘화 방법을 제공하는 것이다. 대퇴골의 WC 모델은 자체 개발하고, 3D 혈관 네트워크 내에서 호중구를 시각화하고 추적하는 데 사용되었다. 이 모델을 이용하여, 골수 IVM 40 일간 연속적으로 수행 할 수있다. 이 방법은 면역 조절 A를 조혈 과정의 해명을위한 다양한 분야에 적용될 수있다차 종양 개발.

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프로토콜

참고 : 모든 동물의 작업은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜 # 2615에 따라 실시 하였다.

마우스 1. 수술 준비

  1. 이전 수술로, 모든 수술기구 및 고압 증기 멸균하여 윈도우 챔버 (WC)를 소독. 2 일전 수술 아목시실린의 50 mg / kg 체중으로 식수를 보충합니다. 복강 4 시간 전에 수술 부 프레 노르 핀의 0.1 ㎎ / ㎏ 체중와 마우스를 주입한다.
  2. 80 ㎎ / ㎏ 케타민 13 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (주를 포함 350-400 μL 식염수 용액을 복강 내 주사에 의한 무 흉선 누드 마우스를 마취 :이 기관 동물 관리위원회의 승인을하고, 우리는 부작용 어떤 경험이 없었어요 ). 발 반사를 테스트하여 적절한 마취를 확인합니다. 절차를 수행하는 동안 호흡 패턴, 점막 색상과 발 반사에 대한 관찰을 계속합니다.
  3. 수술 홍보를 수행바이오 안전성 캐비닛에서 ocedures 수술시 무균 상태를 유지합니다. 수술 동안 체온을 유지하는 수술 용 드레이프 피복 전기 난로에 마우스를 놓는다. 실체 현미경 아래에있는 모든 수술 절차를 수행합니다.
  4. 수술하는 동안 촉촉한 눈을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 수술하는 동안 필요한 경우 반복합니다. 연속적으로 7.5 % 포비돈 - 요오드, 70 % 이소 프로필 알코올 10 % 포비돈 - 요오드 닦아 마우스의 조작 영역을 소독 회이 과정을 반복한다.
  5. 측면에서 대퇴골에 접근, 블레이드 (# 15)와 메스를 사용하여 10mm 길이의 피부 절개를합니다. 근육의 기능을 보장하기 위해 집게와 지혈제를 사용 무딘 절개하여 굴근과 신근 근육 사이의 대퇴골을 노출.
  6. 뼈 아래에있는 U 자형 막대를 삽입하고, WC (그림 1)를 설치합니다. 2 개의 너트를 사용하여 창 막대를 고정하고, 용와 너트를 조이CEPS. 뼈 및 치과 시멘트와 화장실 사이의 공간을 채 웁니다.
  7. 골수 공동 광학 액세스하는 마이크로 드릴 6 × 2 ㎜ × 2 영역의 피질골을 분쇄.
    참고 :이 절차를 수행하는 동안 조심스럽게 현미경으로 피질골의 숱을 검사합니다. 뼈의 손상, 거의 투명 골막 층을 둡니다.
  8. 창에 8 밀리 커브 글라스를 놓고 장소에 보관하는 스냅 링과 커브 글라스를 고정합니다.
  9. 수술 다음 그 기능을 유지하기 위해 집게를 사용하여 다시 원래 위치로 굴근과 신근의 근육을 조정합니다. 5-0 봉합사와 바늘 홀더를 사용하여 진피 봉합사.
  10. 이 의식 자유롭게 움직일 수있을 때까지, 복구를 위해 마우스를 모니터합니다. 복구 할 때 새 케이지에 동물을 넣습니다.
  11. 복구 후, 같은 날 또는 다음 날 동물의 이미지 수집을 수행 (섹션 2 참조). 풍모를 모니터링매일 마우스의 칼 상태.
    참고 : 무게가 빠르거나 얕은 호흡, 뒷다리의 부종, 자기 절단, 봉와직염, 심한 피부염을 hunching, 사지에 베어링과 같은 물리적 조건을 모니터링합니다.
  12. 3 일간의 부 프레 노르 핀 / kg 체중 0.1 mg을 복강 내 주사를주고, 수술 - 후 통증 및 염증 치료를위한 수술 후 5 일간 멜 록시 캄의 1 ㎎ / ㎏ 체중. 5 일간 아목시실린 - 보충 물을 제공하는 계속합니다.
  13. 실험 엔드 포인트, CO에 의해 보조 방법 (예를 들어, 경추 탈구)이어서이 마취를 동물을 안락사.

복합 다중 광자 및 공 초점 현미경을 사용하여 2. 이미지 획득

  1. 종래 이미징 80 밀리그램 / kg 케타민, 13 밀리그램 / kg 자일 라진 함유 350-400 μL의 생리 식염수를 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 가능한 경우 또는 흡입 마취제를 사용합니다.눈 연고를 적용합니다.
  2. 라벨 혈관에 대한 혈관 내 염료의 혼합물 (0.65 2 MDA 형광 (FITC) -dextran의 mg) 및 호중구 (Allophycocyanine (APC의 4 μg의) - 반대로 Ly6G 항체)를 주입한다.
  3. 청색으로부터 적색에 여기 파장을 제공하는 705-980 nm 내지 이광자 여기 레인 징 다중 광자 레이저뿐만 아니라, 단일 광자 레이저를 구비 한 직립 결합 다중 광자와 공 촛점 현미경을 사용한다.
  4. 현미경 (그림 1B)에 사용자 정의 만든 영상 단계를 설정합니다. 악어 클립으로 WC의 두 끝을 체결하여 무대에 마우스를 고정합니다.
    WC를 유지하기 위해 두 악어 클립 및 가열 요소는 이미징 동안 마우스의 생리적 온도 (37 ° C)를 유지하기 위해 다음 단계의 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 있습니다.
  5. 두 광자 레이저 공 초점 시스템의 전원을 켜고 "시작 시스템"을 클릭하여 이미지 수집 소프트웨어를 실행합니다. 4 탭 창이 (찾아획득, 처리 및 유지) 열립니다.
  6. 이미징 채널을 설정합니다. 획득 탭에서 "스마트 설치"를 클릭하고 영상에 사용되는 염료를 선택 FITC (488 nm의 여기, 493-588 nm의 방출)와 APC (633 nm의 여기 및 638-743 nm의 방출을). "최고의 신호"를 선택하고 "적용"을 클릭합니다.
  7. 수동 제 2 고조파 발생 (SHG) 화상 취득 채널을 추가한다. 획득 탭에서 "레이저"창 아래에있는 두 광자 레이저를 켭니다. [채널] 창에서 트랙을 추가하려면 "+"기호를 클릭합니다.
  8. SHG 트랙을 설정합니다. 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 채널 창 아래 840 nm의 파장을 변경하고 슬라이더 막대를 사용하여 "빛의 경로"창에서 415-425 나노 미터로 검출 범위를 선택합니다.
  9. 찾기] 탭에서 "접안 온라인"을 클릭합니다. FITC 관심의 영역을 확인하고 t을 돌려 초점을 수동으로 조정에 대한 필터 설정에서 FITC를 클릭합니다그 현미경 측에 손잡이를 집중한다. 관심 영역이있는 경우, 찾기 탭에서 "접안 오프라인"을 클릭합니다.
  10. 획득 탭을 클릭합니다. 채널 창에서 FITC 트랙을 선택하고, 5 배 목표와 FITC-덱스 트란의 이미지를 미리 "라이브"를 클릭합니다. 필요에 초점을 조정하고 미리보기를 중지 취득 탭에서 "중지"를 클릭합니다.
  11. 수동 렌즈 위의 휠을 이동하여 20 배의 물 목표로 설정합니다. 20 배 목표를 사용하여 FITC-덱스 트란에 대한 이미지를 다시보기 및 최적의 신호와 대비를 달성하기 위해 채널 창에서 마스터 게인 및 핀홀을 조정합니다. [채널] 창에서 APC 및 SHG 트랙을 선택하여 다른 채널에 대해 반복합니다.
  12. 이미징 매개 변수를 선택합니다. 그 창을 엽니 다 "수집 모드"를 클릭합니다. 고품질의 이미지를 얻기 위해, 프레임 크기는 1024 X 1024 픽셀로 설정하고, 4 배의 평균.
  13. 2 차원 스냅 샷을 취득. 채널 승리에서 모든 채널을 선택다우와 획득 탭​​에서 "스냅"을 클릭합니다. 이미지의 품질을 확인하고 필요한 경우 영상 매개 변수를 변경합니다.
  14. 2D 시간 경과 이미지를 획득.
    1. 시계열 창을 엽니 획득 탭​​에 "시간 시리즈"를 해제하십시오. 시간 간격없이 연속 40 이미지를 취할 검사의 총 수의 간격에 따라 0, 40을 입력합니다.
      참고 : 40 스캔은 7.5 초 / 프레임의 스캔 속도 및 600 μm의 × 600 μm의 이미지 크기는 약 5 분 장시간 시리즈를 생성한다. 간격과 현미경 화상 취득 설정 및 카메라의 프레임 레이트에 따라 스캔의 수를 조정한다. 일정 간격의 시간 (> 0 초)은 상이한 시점에서 취득한 타임 랩스 영상과 비교하기 위해 사용될 수있다. 더 긴 시간 경과 영상 시간은 실험 조건에서 호중구 (또는 관심의 다른 세포)의 예상 평균 속도에 따라 요구 될 수있다.
  15. 3D 이미지를 획득.
    1. Z 축 스택 창을 엽니 획득 탭​​에 "Z-스택"을 해제하십시오. FITC-덱스 트란의 "라이브"미리보기 모드를 시작합니다. 샘플의 상단에 초점 "우선 설정"을 클릭하고 샘플의 다른 쪽 끝을에 초점을 클릭 Z 스택 창에서 "최근 설정".
    2. Z 축 스택 창에서 10 μm의 것으로 간격을 설정합니다. 이전 단계에서 선택된 제 1 및 최종 광학 슬라이스에 따라이 90-180 ㎛, 전체 광학 두께, 10-20 슬라이스를 생성한다.
      주 : Z 스택 간격 광학 슬라이스 두께를 결정 핀홀의 크기에 의존한다. 광학 슬라이스의 두께 이상이어야 간격을 설정합니다.
    3. 이미지를 수집하기 시작 획득 탭​​에서 "시작 실험"을 클릭합니다.
  16. 3D 시간 경과 이미지를 획득.
    1. 시계열을 열 획득 탭​​에 "시간 시리즈"와 "Z-스택을"오프 확인그리고 Z-스택 창.
    2. 단계 2.14과 2.15에 설명 된대로 시간 시리즈 설정하고 Z 스택 획득 매개 변수를 설정합니다. 이미지를 수집하기 시작 획득 탭​​에서 "시작 실험"을 클릭합니다.
  17. 이 안정적이고 의식이 있는지 확인하기 위해 촬영하는 동안 마우스를 모니터합니다. 마우스가 촬영 중에 불안정 및 / 또는 의식이있는 경우, 무대에서 마우스를 제거 복강 마취 솔루션의 추가로 100 ~ 150 μl를 주입하고, 영상을 계속합니다.
    참고 : 불안의 징후가 빠른 호흡과 획득 된 영상에서 아티팩트를 변화로 볼 수있다 마우스의 움직임을 포함한다.
  18. 이미지 수집 한 후, 단계 떨어져 마우스를 가지고 케이지로 돌아갑니다. 따뜻하게 유지하고, 의식 때까지 마우스를 모니터링하는 가열 램프를 사용한다.

3. 이미지 분석 및 정량화

  1. 3 차원 및 시계열 데이터를 분석하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어를 열고"아레나"보기라고 열려있는 화면으로 드래그하여 이미지를 추가 할 수 있습니다. 를 열 수있는 이미지 파일을 더블 클릭; 이미지가 "능가"보기에서 열립니다.
  2. 2 차원 / 3 차원 이미지를 만듭니다.
    1. 오른쪽 상단에있는 "추가"줄에서 "디스플레이 조정"창을 엽니 다 "편집 /보기 표시 조정"을 클릭합니다. 각 채널에 대한 임계 값을 조정함으로써, 형광 표시를 최적화하며, 이미지를 저장하는 스냅 샷.
  3. 시간 경과 이미지를 사용하여 개체 트랙을 생성합니다.
    1. 이미지를 엽니 다하는 "능가"보기에 따라 분석한다. 은 "능가"아이콘 아래에있는 오렌지 도트의 이미지와 아이콘을 클릭합니다. 이 새로운 "관광 명소"창이 열립니다.
    2. "(시간 이상) 트랙 스포트를"오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. "소스 채널"에서 추적 할 개체를 포함하는 채널을 선택하고, 추정 된 개체 diamet 설정에 숫자를 입력하여 "예상 XY 직경"에서 어입니다. 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다.
      참고 : 호중구 추적의 경우, 호중구에 대한 APC 형광을 포함하는 채널을 선택하고 호중구의 알려진 크기에 따라 12 μm의 객체 직경을 설정합니다.
    3. 창에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 "품질"필터를 선택합니다. 소프트웨어에 의해 정의 된 지점을 관찰하고 포함하거나 지점을 제외 수동으로 임계 값을 조정합니다. 임계 값이 정의되면, "추적"단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다.
    4. 알고리즘에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 "회귀 모션 알고리즘"을 선택합니다. "최대 간격 크기"에 대한 "최대의 거리"에 대한 10 μm의 3 유형 매개 변수 아래에 있습니다. 추적을 시작하려면 "모든 탐지 된 개체와 격차를 채우기"오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다.
      주 : "회귀 모션 알고리즘"F를 사용또는 이전 운동에서 예측 된 위치에 따라 트랙을 생성하기 때문에, 운동을 지시 한 개체입니다. "최대 거리"와 "최대 간격 크기"추적뿐만 아니라, 시간 경과 이미지의 전체 지속되는 예상 치수 오브젝트의 속도에 따라 조정될 수있다.
    5. 필터 유형에서 '추적 기간 "필터를 선택합니다. 추적을 완료하고, 생성 된 트랙을 확인하기 위해 녹색 화살표를 클릭합니다. 수동으로 트랙을 정렬 할 필요하면 이전 단계로 돌아갑니다.
  4. 번역 드리프트에 대한 올바른 생성 된 시간 경과 이미지 드리프트, 경우.
    1. 연필의 이미지로 아이콘을 클릭합니다. 이것은 "편집 트랙"창을 엽니 다 편집 탭입니다. 시간 경과 이미지를 검사하고 모든 이미지를 이동하지 않아야 참조 지점을 찾을 수 있습니다.
    2. 화면의 왼쪽 상단 모서리에서 "포인터"창을 찾아 오프 확인 용돈을 활성화하기 위해 "선택"자리를 선택하는 rsor. 기준 지점을 클릭합니다.
    3. "편집 트랙"창에서 "올바른 드리프트"를 클릭합니다. "번역 상 드리프트"를 해제하십시오. 이 소프트웨어는 자동으로 이미지를 보정 시리즈를 생성합니다.
  5. 시간 경과 영상에서 객체 추적에 의해 정의 된 세포의 움직임을 측정한다.
    1. "편집 트랙"창에서 "트랙"오프 확인하고 세포의 움직임을 나타내는 트랙을 선택합니다. 선택한 트랙은 시계열 이미지에서 노란색으로 강조 표시됩니다.
    2. 은 "통계"창 (통계 탭) 열 그래프의 이미지로 아이콘을 클릭합니다.
    3. "선택"에서 트랙 속도가 선택한 트랙에 대한 의미 생성 아래쪽 화살표를 클릭하여 "트랙 속도 평균"을 선택합니다. 다른 트랙을 선택하고 트랙 속도가 관심의 모든 세포에 대한 의미 측정하는 단계를 반복합니다.

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결과

쥐 대퇴골 골 성공적 개별 호중구 및 혈관 네트워크의 시각화를 활성화 WC를 사용하여 액세스된다. 하나의 WC 구를 도시하고 내부 광 액세스하는 대퇴골과 피질골의 박형화의 노광을 수반 수술을 설명 도표 뼈. 수술은 생쥐에서 잘 허용된다 그들은 고통없이 보고서와 같은 오일 수술 후의 화장실에 뒷다리의 부종, 비 체중이 다리에 베어링, 자기 절단, 봉와직염 및 피부염뿐만 아니라, 손상 등의 부작용 물리적 반응에 대해 평가 하였다. 특히, 윈도우는 다음의 개입 셀룰러 및 구조 변경의 장기 평가를 가능하게 할 수있는 40 일 대한 IVM을위한 광학적으로 투명한 남아있다.

골수 내 혈관이 같은 FITC-덱스 트란과 같은 혈관 염료, 시각화 할 수 있습니다(그림 2). 콘트라스트 ...

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토론

실시간 골수에서 동적 세포 과정의 일련 촬상 그렇지 같은 조직학 총 혈구와 같은 종래 기술을 이용하여 수득 도전 정보를 제공한다. 여기에 설명 된 대퇴골 WC 모델은 시간에 따른 골수 세포 및 구조적 변화를 조사하는 독특한 기회를 제공한다. 대퇴골의 WC 모델은 이전에보고되었지만, 우리의 새로운 디자인 성인 마우스에 사용하기위한 더 호환도 작아 WC 전체 크기의 큰 이미지 필드를 제공한다. 대퇴골 WC 모델은 면역 및 / 또는 트랜스 제닉 리포터 생쥐 포함 마우스 균주의 다양한 이용 될 수있다.

전체 기간과 영상의 품질을 결정하는 수술 중 중요한 단계가 있습니다. 대퇴골을 노출 할 때, 굴근과 신근 사이의 근육의 무딘 절개가 수행된다; 이러한 근육의 제거는 마우스와 뮤스의 감소 이동성 될 수 있습니다t는 회피 될 수있다. 또한, 피질골의 분쇄하는 것은 신중하게 수행해야합니다. 대퇴부 혈관 네트워크의 구조적 무결성을 유지하면서, 약 50 ㎛의 연삭 결상 적합하다. 뼈 시멘트 주...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

저자는 현미경과 지원을 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 시설 (www.aomf.ca)를 감사하고, 화장실, 이미징 단계의 제조 프린세스 마가렛 암 센터의 기계 공장에서 씨 제이슨 엘리스 것이다. 우리는 또한 원고 편집 박사 아이리스 Kulbatski에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NRCNU-F 흉선 누드 마우스TaconicNcr 누드8-10주령, 암컷
식염수BaxterJB1302P
케타민 염산염Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529
Xylazine바이엘 헬스케어, 바이엘 Inc.DIN 02169592
수술용 드레이프프록시마DYNJP2405
전기 가열 패드라이프 브랜드57800827375
스테레오현미경라이카라이카 M60
눈 연고 (눈물 젤)Novartis T296/2
7.5% 베타딘Purdue Frederick Co67618-151-16
70% 이소프로필 알코올GreenFieldP010IP7P
10% 베타딘Purdue Frederick Co67618-150-05
메스 핸들Fine Science Tools10003-12
메스 블레이드 (#15)VWR89176-368
봄 가위 곡선정밀 과학 도구15023-10
Baby-Mixter HemostatFine science Tools13013-14
Fine ScissorsFine science Tools14094-11
Extra Fine Graefe ForcepsFine science Tools11151-10
Halsted-Mosquito HemostatsFine science Tools13008-12
마이크로 드릴Harvard Apparaus72-6065
마이크로 드릴 버Fine Science Tools19007-14
대퇴골 창 챔버PMCC 기계 공장맞춤형 설계9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (외경에서 내경), 2.16 mm (두 구멍의 반경), 13.9 mm (두 구멍 사이의 거리), 0.7 mm (두께)
U 자형 막대PMCC 기계 공장맞춤 설계13.8 mm (길이), 1.6 mm (너비), 3.7 mm (높이)
커버글라스 (8 mm)워너 인스트루먼트 HBIO 64-0701 CS-8R
고정 링(8mm)ACKLANDS GRAINGERUNSPSC #
너트(육각 스테인리스 스틸)Fastenal70701
치과 시멘트3MRelyX U200
봉합사(5-0 Monosof black)CovioienSN-5698
Halsey 바늘 홀더Fine Science Tools12501-13
부프레노르핀 (Temgesic)레킷 벤키저DIN 0281251
멜록시캠 (메타캠)베링거인겔하임DIN 02240463
아목시실린 (클라마복스)화이자DIN 02027879
FITC-덱스트란시그마-알드리치FD2000S
APC- 안티-마우스 Ly-6G (Gr-1) eBioscience17-9668
이광자 현미경 LSM 710Carl ZeissZeiss LSM 710 NLO
이미징 스테이지PMCC 기계 공장맞춤 설계15.9cm(길이), 11cm(너비), 0.9cm(높이)
Imaris 소프트웨어BitplaneImaris 8.0프로토콜의 섹션 3에 설명된 이미지 분석 소프트웨어 
Zen 2012ZeissZen 2012프로토콜 섹션 2에 설명된 이미지 수집 소프트웨어 
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참고문헌

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