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방법 논문

선캄브리아 해양 용승 시스템 광합성 박테리아의 성장을 탐구하는이 풍부한 철 (II)의 실험실 시뮬레이션

11.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54251

⸱

2016년 7월 24일

 ,  ,  , 
1Department of Geosciences, University of Tuebingen, 2Department of Geological and Atmospheric Sciences, Iowa State University

이 논문에서

요약

우리는 실험실 규모의 수직 흐름을 통해 열에서 선캄브리아 철분을 함유 해양 용승 시스템을 시뮬레이션. 목표는 O 2 및 Fe (II)의 방법 화학적 프로파일을 이해 시아 노 박테리아의 생산 O 2로 진화했다. 이 결과로 인해 광합성 제조 O 2에 의해 철 (II) 산화에 chemocline의 설립을 나타낸다.

초록

일부 선캄브리아 줄무늬 철 구조물 (BIF)을 증착하기위한 종래의 개념 선캄브리아 바다 열수 출처 1 철 [철 (II)] 승이은 분자 산소에 의해 산화 된 것으로 가정하여 진행한다 O 2] 박테리아에 의해 생산. 전 약 24억년 (Gy를)에서 이전에 좋은 산화 이벤트 (GOE)에 증착 된 가장 오래된 BIFS는, 무산소 조건에서 anoxygenic photoferrotrophs에 의해 철 (II)의 직접 산화에 의해 형성 할 수 있었다. 다른 생물학적 시나리오에 따라 개발하는 지구 화학적 및 광물 학적 패턴을 테스트하기위한 방법으로, 우리는 실험실 규모의이 풍부한 해양 용승 시스템 고대 바다의 대표적인 무산소의 Fe (II)을 시뮬레이션 할 수있는 40cm 길이의 수직 흐름을 통해 열 설계 . 실린더는 화학적 구배를 안정화 다공질 유리 비드 매트릭스로 포장하고, 철 정량 액체 시료 수층에 걸쳐 수행 될 수있다. 용존 산소이었다외부에서 optodes를 통해 비 침습적 발견했습니다. 물 열에서 하단, 상단에서 별개의 빛 그라데이션 및 시아 노 박테리아의 존재에서의 Fe (II)의 용승 플럭스를 포함 생물 실험, 철의 형성을위한 쇼 명백한 증거의 결과 (III) 미네랄 침전물과 chemocline 개발 철 사이 (II) 및 O 2. 이 열은 우리가 시뮬레이션 해양 선캄브리아 조건 (미래 photoferrotrophs에서) 시아 노 박테리아를 배양하여 BIFS의 형성 가설을 테스트 할 수 있습니다. 얕은 바다 또는 호수의 퇴적물을 포함하여 - 또한 우리는 우리의 열 개념은 다양한 화학적, 물리적 환경의 시뮬레이션 수 있다는 가설.

서론

선캄브리아는 (4.6 Gy를 0.541으로 전) 분위기가 광합성 생산 된 산소의 점진적 형성을 경험 (O 2), 아마도 약 2.4 Gy의에서 이른바 "위대한 산화 이벤트"(GOE)에서 단계 변화에 의해 구두점 전 및 다시 대기 O와 신 원생대 (1-0.541 Gy를 전) 2 현대 레벨 1에 접근했다. 시아 노 박테리아는 산소를 광합성이 할 수있는 첫 번째 생물의 진화 잔재입니다. 지구 화학적 증거 및 모델링 연구는 주로 무산소 분위기 3-5 아래 표면 바다에서 로컬 산소 오아시스를 생성, 시아 노 박테리아 또는 산소를 광합성 또는 산소를 광 영양 생물의 수 생물의 활동 지역 사회를 품고 얕은 연안 환경의 역할을 지원합니다.

철 선캄브리아 점 걸쳐 해수 줄무늬 철 구조물 증착 (BIFS) (II) (철 (II))의 주요 화학적 C로서이들 증착 동안 적어도 국부적 해수 onstituent,. 가장 큰 BIFS 중 일부는 대륙붕 및 사면을 형성, 깊은 물 예금이다. 증착 철의 양은 주로 대륙 (즉, 풍화) 소스와 질량 균형의 관점에서 호환되지 않습니다. 따라서 철의 많은에 mafic 나에 ultramafic 해저 지각 (6)의 열수 변질로부터 공급되어 있어야합니다. 철의 비율의 추정은 연안 환경의 아웃 보드가 용승 (7)을 통해 표면 바다에 공급 철 (II)와 일치 증착. 철은 용승 전류에 전송 받으려면 감소, 모바일 형태로 존재되어 있어야합니다 - 철과 같은 (II). BIF 보존 철의 평균 산화수는 2.4 (8)이며, 일반적으로는 철 BIF는 산소 가능성, (II)이 산화 된 철을 승이시 형성된 철 (III), 퇴적 유지한다고 생각된다. 따라서, 경사 environme 따라 전위의 Fe (II) 산화 메커니즘을 탐구국세청은 BIF 형성 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 또한, 해양 퇴적물의 세련된 지구 화학적 특성은 철 (Ⅱ) 무산소 물기둥의 존재 철분을 함유 조건, 선캄브리아에 걸쳐 바다의 지속적인 기능이었고, 단지 시간과 장소에 제한되지 않을 수 있음을 확인했습니다 여기서 BIF 9 증착 하였다. 따라서, 지구 역사의 적어도 이십억년를 들어, 얕은 바다에서의 Fe (II)와 O (2) 사이의 산화 환원 인터페이스 가능성이 평범했다.

많은 연구는 캄브리아기 바다의 다양한 기능의 화학적 및 / 또는 생물학적 유사체있는 현대적인 사이트를 사용합니다. 좋은 예는 광합성 활동 (시아 노 박테리아에 의해 포함) 동안의 Fe (II)는 10 ~ 13을 검출 하였다 햇볕에 쬐 표면 바다에서 안정적으로 존재하는 철분을 함유 호수입니다. 이 연구의 결과는 / FER을 무산소 할 수있는 호기의 지구 화학적 및 미생물 특성에 대한 통찰력을 제공ruginous chemocline. 그러나이 위치는 일반적으로 물리적으로 거의 수직 오히려 승이 시스템에서 발생하는 화학 인터페이스보다 14 믹싱 층화하고, 4 시간 선캄브리아 가장 산소 생성을 지원하는 것으로 생각된다.

자연 아날로그는 무산소 분위기 아래 해양 산소 오아시스의 발전을 탐구하고, 햇볕에 쬐 지표수 열에서의 Fe (II)이 풍부한 용승 시스템에서 현대 지구에서 사용할 수 없습니다합니다. 따라서, 함철 승이 영역을 시뮬레이션하며 박테리아 및 photoferrotrophs의 성장을 지원할 수있는 실험실 시스템이 필요하다. 선캄브리아 해수를 나타내는 이해와 미생물 공정의 식별과 용승 수성 매질과의 상호 작용에 대한 이해를 촉진하고 완전히 고대 지구에 특유의 생지 화학적 과정을 이해하기 위해 암석 기록에서 얻은 정보를 보완 할 수 있습니다.

이를 위해 실험실 규모 컬럼되는 철 (II)이 풍부한 해수 배지 (중성)이 컬럼의 바닥으로 펌핑 설계하고, 상부에서 펌핑. 조명은 최고 3cm의 시아 노 박테리아의 성장을지지 4cm 폭 "빛의 영역"을 만들기 위해 상단에 제공되었다. 자연 환​​경은 일반적으로 층화 및 염분이나 온도 등의 물리 화학적 구배에 의해 안정화된다. 실험실 규모의 수층을 안정화시키기 위해, 열 실린더는 실험 기간 동안 개발 된 화학적 패턴의 설정을 유지하는 데 도움이 다공질 유리 비드 매트릭스 채워졌다. 연속적인 N 2 / CO 2 가스 유동은 GOE 15 전에 바다 반사 무산소 분위기를 유지하기 위해 컬럼의 상부 공간을 세척하기 위해 적용 하였다. 철의 일정한 플럭스 (II)를 설치 한 후, 시아 노 박테리아는 열에 걸쳐 접종 및 growt했다H는 샘플링 포트를 통해 제거 된 샘플을 세포 수로 모니터링 하였다. 산소는 열 실린더 측정 내벽 열 외부 광섬유로 만들어진 상 산소 민감성 optode 박을 배치하여 현장에서 모니터링 하였다. 수성 철의 분화는 깊이 해결 수평 샘플링 포트에서 제거 샘플에 의해 정량화하고 Ferrozine 방법으로 분석 하였다. 비 생물 제어 실험 결과는 개념 증명을 보여 - 대기로부터 격리 유지 고대의 물기둥의 실험실 규모의 아날로그, 달성이다. 시아 노 박테리아가 성장하여 산소를 생산하고, 철 (II)와 산소의 반응을 확인할 수 있었다. 해양 cyanobacterium 인 Synechococcus 특검팀 접종 동안 여기서, 디자인, 제조, 조립, 실행, 이러한 열의 샘플링의 방법은 컬럼의 84 시간 실행에서 결과와 함께 제공됩니다. PCC (7002).

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프로토콜

배양 매체의 1. 준비

주 : 배지 제조에 필요한 설비 및 화학 공업 용품 정보는 표 1에서 괄호 이탤릭 문자 숫자 코드는 표 2 세분화도 1에 도시 된 장치를 참조..

  1. 해양 광 영양 생물 (MP)의 중간 5 L를 준비하면 우 외. (16)의 다음과 같은 프로토콜 ( "매체"이라고 함). 무산소 및 멸균 1 M 염산 또는 0.5 M 나코 3 사용하여 6.8으로 산도를 조정합니다. 철에 대한 소스로 (II), 다음 단계에서 배지 액을 여과 후, 500 μM의 (II) 농도를 최종 철을 달성하기 위해, 1 M 무산소 멸균 50ml을 -solution이 3.5를 가하여.
  2. 철 (II), 탄산 및 인산염 광물을 침전하기 위해 48 시간 동안 5 ° C에서 미디어 솔루션을 저장합니다. pH가 물의 Fe (Ⅱ) 및 Fe 외에 미네랄 침전 결과 변화는 따라서 6.8로 다시 pH를 조정 해 주어야합니다. 0.22 μm의 필터 부를 통해 무산소 (100 % N 2) 글로브 박스에서 중간 필터. 멸균 부틸 고무 마개로 멸균 5 L 유리 병 (E.'1) 글로브 박스 내부 캡으로 여과 매체 분배.
  3. 한 스토퍼에 가스 라인에 접속 일회용 바늘 및 배기구로서 작용하는 제 바늘을 삽입하여 N 2 / CO 2 (V / V를, 90/10)로 배지 병의 상부 공간에 플러시. 헤드 스페이스 볼륨 10 번을 변경해야합니다. 예를 들어, 10 ㎖ / sec의 일정 가스 유량으로, 적어도 50 초 (Hungate 및 메이 17과 비교) 50 ㎖가 헤드 스페이스 부피 세척.
  4. 지금의 Fe (II)의 광산화을 방지하기 위해 어두운 조건에서 실온에서 알루미늄 호일 및 저장에 사용할 준비가 매체 병 (E)를 커버. 매체 준비를위한 3 일 수 있습니다.

문화의 2. 준비

"> 참고 :.. 열 실험에 사용되는 인 Synechococcus 특검팀 PCC (7002)의 문화가 그것은 박사 M. Eisenhut (식물 생화학 연구소, 뒤셀도르프, 독일의 대학)에 의해 제공되었다 (18) 단세포 해양 photoheterotrophic 시아 노 박테리아 속으로 설명 . 주식 문화는 추가의 Fe (II)없이 무산소 MP 매체에 성장이 연구하십시오.

  1. 6 ㎎ / ㎖에서 1 ㎖ / L 철 암모늄 시트르산과 우 등. (16) 그러나 대신 염화 제이철의 프로토콜 다음 100 ㎖ MP 매체를 준비합니다.
  2. 무산소 조건 (글로브 박스 100 % N 2), 살균 부틸 고무 마개 한 120 ㎖의 멸균 혈청 병 뚜껑에 매체를 분배하고, 알루미늄 캡으로 압착. N에 헤드 스페이스 변경 2 / CO 2 (V / V를, 90/10) (Hungate & 메이시 (17)를 비교) 및 주식 문화의 5 % 접종. 이어서 툰에서 25 ° C와 600 럭스에서 빛 인큐베이터에서 배양를 저장전구를 gsten.
  3. 인 Synechococcus 특검팀입니다. PCC (7002)는, 전송 다음, 빛 인큐베이터 내에서 처음 24 시간 동안 얇은 종이 타월로 혈청 병 감광성 커버입니다. 문화 6-8 일 동안 성장하도록 허용합니다. 광합성 활성은 따라서 (II) 배지 및 세포의 Fe로 구성된 철을 유지하기 위해 7 일 후 배양을 전송하고, 세포 성장의 척도 정적 없습니다 (II) 및 Fe (II)의 Fe의 산화를 초래한다 (II).
  4. 광학 밀도 (OD) 측정 용 샘플을 채취하여 세포 밀도 모니터 : 배양 세포 밀도 (세포 / ml하는) (750) 내지 (19)의 파장에서 광 분광계 세포 현탁액 시료의 흡광도를 통하여 측정 될 수있다. OD 750 로그 단계에서 문화를 직접 현미경으로 세포 수 사이의 선형 관계는 절대 세포 밀도 (20)를 결정합니다.
  5. 즉시 10 8 세포의 세포 밀도로 / ㎖에 도달 할 때,광합성 산소 생성을 막기 위해 알루미늄 호일로 혈청 병 포장.
  6. 액체 매질에 삽입 길이 (100mm) 일회용 바늘이 부착 된 주사기 0.22 ㎛의 멸균 필터를 사용하여 세포 현탁액의 O 2를 제거한다. 헤드 스페이스 및 기포 5 분 / CO 2 N 2 (Hungate & 메이시 (17)를 비교)와 문화를 플래시합니다. 컬럼에 접종 할 때까지 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오.

실험 셋업에 대한 항목 및 개별 부품의 3. 준비

참고 : 실험 셋업에 필요한 장비에 대한 정보를, 수량 및 사양은 표 2에 나열되어 있습니다.   실험 셋업에 사용되는 항목의 일부는 미리 준비하고 개별적으로 표 2에 나열된 하나의 대문자 (AG)로 표시되며 그림 1과 클로즈업을 표시 뿐만 아니라. 이탤릭체 문자 숫자 코드는 표 2에 항목별로 장비를 참조하여 그림 1에 나타내었다.

  1. 열의 샘플링 포트 (D)를 준비하기 위해, 꼭 끼는 부틸 고무 마개 (A.3)와 포트를 닫는다. 부틸 고무 마개로 하나의 스테인레스 스틸 바늘 (D. ')를 삽입합니다. 바늘의 끝이 칼럼의 중심에 있는지 확인합니다.
    1. 고무 튜브 (D.2)에 바늘을 연결하고 열 수축 튜브 (D.3)과의 연결을 봉인. 작은 루어 락 튜브 커넥터 ( 'D.5) 열 수축 튜브 (D.3)와의 연결을 밀봉하고 적절한 플라스틱 캡 튜브 커넥터를 덮도록 상기 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 (D.6) .
      주 : 샘플링 포트의 수에 따라 요구는 다양한 샘플링 포트와 하나의 메인 포트를 제공 할 필요가있다 - therefo부틸 고무 마개로 경사각에 스테인리스 바늘 (D.1)를 삽입 재.
  2. 다음 단계에 따라 부틸 고무 마개를 열 매체로 방전 병 연결 수정하려면 :
    1. 부틸 고무 마개 (E.2)에 (E.4 E.3)이 스테인레스 스틸 모세 혈관을 삽입합니다. 이러한 모세 혈관에 해당하는 고무 튜브 (E.6)를 연결하고 열 수축 튜브 (E.5)과의 연결을 봉인.
    2. 긴 모세관 (E.3)의 관의 타단 튜브 커넥터 (E.7)를 첨가하고, 또한, 열수축 튜브 (E.5)와이 커넥터를 고정한다.
    3. 튜브 (E.5)를 열 수축으로 연결 봉인 짧은 모세관 (E.4)에 부착 된 다른 튜브의 자유 단부에 스테인리스 바늘 (E.11)을 연결하고, 다른 쪽 끝을 삽입 적은 부틸 고무 마개로 스테인리스 바늘 (E.10).
    4. 큰 부틸 고무 마개 (G.2)에 두 개의 스테인레스 스틸 모세관 (G.3)를 삽입하고 적절한 고무 튜브 (G.4, G.5)를 연결합니다. 중간 방전 병 모세관 (W2)에 짧은 고무 튜브 (G.4)의 끝을 연결합니다. 작은 튜브 커넥터 (G.6)와 긴 튜브 (G.5)의 끝을 착용. 두 번째 방전 병에 대한 또 다른 부틸 고무 마개를 준비하기 위해이 단계를 반복합니다.
  3. 열 두 용지 공급 라인을 생성하기 위해 부틸 고무 마개 (F.2)로 두 스테인리스 바늘 (F.3)을 삽입하여 배지 분전반 (F)를위한 스토퍼를 준비한다. 바늘의 각각에 고무 튜브 (F.4)를 부착하고, 각각의 고무 튜브 일대일 매체 병 모세관 (C1)를 연결한다.
  4. 매체 공급 라인 땀샘 (B)를 제조하기 위해, 한 매체에 연결고무 튜브 (B.4)와 작은 튜브 커넥터 (B.3)에 공급 모세관 (C2). 다른 매체 공급 선에 대해이 단계를 반복합니다.
    1. 중간 배출 라인 땀샘을 준비하는 대신 더 이상 매체 방전 모세관 (W1)를 사용하고 이전 단계를 수행합니다 (그림 1) (B 비교).
      참고 : 입구 라벨과 적절한 조립을 지원하기 위해 테이프의 다른 색상으로 콘센트에 도움이됩니다.
  5. 2 개의 긴 루어가 고무 튜브 (C.1)로 스테인레스 스틸 바늘 (C.2)를 고정하고, 바늘의 끝은 다른 외부 4cm에 도달하는지 확인 삽입하여 헤드 스페이스 가스 교환 패널 (C)의 부품을 조립 튜브의 끝. 폴리머 접착제 (C.8)와 튜브를 작성하고 적어도 6 시간 동안 조립 건조를 할 수 있습니다.
    1. 느슨하게면 (C.4) 두 루어 잠금 유리 주사기 (C.3)를 입력합니다.
    2. 별도로 두 부틸 마찰을 준비BER 스토퍼 (C.5) 삽입 스테인리스 바늘 (C.6) 및 스테인리스 바늘 (C.7)와 다른 하나. 아직, 유리 주사기에 연결하지 마십시오.
  6. 매체 병 및 가스 팩 (GP)에 맞춰 나중에 사용하기 위해면 (E.9)로 채워진 유리 주사기 (E.8)를 준비합니다.
  7. 가스 팩 밸브에 고무 튜브 (gp.1)를 연결하여 10 L 가스 팩 (GP)에 대한 장치를 조립한다. 고무 튜브의 자유 단부에 튜브 커넥터 (gp.2)를 삽입한다. 제 10 L 가스 팩에 대해이 절차를 반복합니다.

열 및 장비 4. 살균

주 : 재료 특성에 따라, 장치는 다음의 세 가지 방법 중 하나에 의해 살균된다 :

  1. 건조 오븐 (425 시간 동안 180 ° C)로 유리 장비 소독 :
    1. 매체를 만들기위한 장비를 소독 (참조 표 1 및 1.2 절) 별도로 사전한다. 따라서, 2 × 5 L 유리 병을 제조하고, 개구부에 알루미늄 호일 병목 커버. 팩은 내열 용기에 4 × 5 mL 및 5 × 2 mL 유리 피펫 모든 장비를 오븐 - 소독.
    2. 제 2 단계에서 설정 한 컬럼에 대한 장비를 소독. 알루미늄 호일로하고 해당 부틸 고무 마개가 제거되었는지 확인 - (섹션 3에서 제조 F.1을; E.8 C.3)을 유리 주사기를 감싸.
    3. 유리 비커에 유리 구슬 (A.2)을 넣고 알루미늄 호일로 상단 커버. 또한 투명 유리 접시 (A.4), 4 개 대형 튜브 커넥터 (B.2)와 알루미늄 호일 및 모든 오븐 소독과 3 방향 커넥터 (G.7)를 커버한다.
  2. 오토 클레이브 (120 ° C, 10 줄, 20 분)에 의해 오토 클레이브 플라스틱 및 액체를 소독 :
    1. 첫 번째 단계, 인트에서5 L 유리 병에 대한 매체의 NaHCO3을 -buffer 솔루션 2 부틸 고무 마개로 Widdel 플라스크를 rilize.
      주 : 부틸 고무 마개는 제 초순수로 3 회 비등에 의해 제조 한 후, 알루미늄 호일로 덮여 약간의 물과 함께 유리 비이커에 멸균된다. 젖은 스토퍼는 유리 병에 삽입하기가 더 쉽습니다.
    2. 제 2 단계에서 설정 한 실험 열의 장비를 소독. 고압 증기 멸균 전의 알루미늄 호일로 배출, 오토 클레이브 멸균의 열을 제조 상부 개구, 용지 공급 장치의 통풍구 용지 배출 통기구 및 상부 공간을 포장하기 위해.
    3. 적절한 플라스틱 캡 (D.'6)와 샘플링 포트 (D.'5)를 커버하고 고압 증기 멸균 전에 클램프 (D.4)를 제거해야합니다.
    4. 부틸 고무 마개와 매체 방전 병 (E.2에 해당하는 모세 혈관 감싸 라 2 × G.2을 - 준비 전을N 부 3) 유리 주사기 작은 스토퍼 (2 × C.5; E.'10 '; F.'2 - (3))과 매체 공급 및 배출 땀샘 (연결 모세관 제조 S2; W1 - 알루미늄 호일로 3.4) 제조 오토 클레이브에 모든 장비 소독.
    5. 멸균 후, 또 다른 4 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 열 살균 및 건조 장치.
  3. 펌프 관 (PT)을 멸균하지 않기 때문에, 에탄올 (EtOH 중) 용액 (EtOH 중 80 %, 20 % 물)에서 그들을 살균. EtOH로-용액으로 적절한 비커를 입력하고 튜브가 완전히 EtOH로-솔루션으로 가득 보장, 거기에 펌프 호스를 배치합니다. 3 시간 후 꺼내 (오븐 멸균) 사전 멸균 알루미늄 호일에 직접 랩 2 시간 동안 실온에서 건조 할 수 있습니다.

열 및 장비 (5) 조립

  1. 평평한 표면에 열 (A)를 놓고 실험실 스탠드와 클램프 안정. 무균 조건에서 작동해야합니다 (예를 들어, 분젠 버너의 40cm 이내 또는 층류 흐름 후드 아래). 조심스럽게 상부 개구에서 알루미늄 호일을 제거하고 멸균 유리 구슬 (A.2)를 입력합니다.
    1. 이 열 접촉 될 영역에서 내측 표면에 고분자 접착제 (A.5)를 적용하여 단단히 확대하기 위해 열을 시계 접시 (A.4)을 준비한다. 가볍게 함께 단단히 두 부분 접착제 위해 칼럼의 상부에 위치에서 시계 접시를 누른다. 설치가 건조하기위한 적어도 6 시간을 허용합니다.
      주 : 쉽게 실험 후 시계 접시를 제거하기 위해 열 가장자리와 시계 접시 사이 멸균 미세 유연한 와이어를 배치 할 수있다.
  2. 멸균 조건에서 작업하는 동안 열을 다음과 같은 부분을 첨부 :
    1. 고무 튜브 (B.1)과 중간 공급 및 배출 통풍구에 해당 튜브 커넥터 (B.2)를 연결합니다 (그림 1 (B)를 비교).
    2. 열에서 해당 커넥터에 (3.4 절에서 제조 된) 용지 공급의 샘 (B.3)의 튜브 커넥터를 연결하고 방전 (그림 1 (B)를 비교).
    3. 헤드 스페이스 가스 교환 패널을 장착합니다 (그림 1 (C)를 ​​비교 - 섹션 3.5에서 준비) 헤드 스페이스에이 열을 배출하고 해당 스테인레스 스틸 바늘 (C.2) 및 삽입에 유리 주사기 (C.3)를 연결 해당 부틸 고무 마개 (C.6, C.7 - 섹션 3.5.2에서 제조)면 채워진 유리 주사기로 (C.3).
  3. (2 X를 방전 병 부틸 고무 마개를 삽입 G.20 - 두 멸균 3 L 유리 병 (G.1)에 3.2 절)에서 제조, 상기 3 방향 커넥터 (G.7)으로 병 (G.6)의 튜브 커넥터를 연결한다.
  4. 펌프 호스 (PT)과 방전 병 모세관 (W2)의 자유 단에 중간 방전 그랜드 모세관 (W1)의 끝을 연결합니다. 제 2의 매질 방전 선 모세관 및 제 2 방전 병에 대해이 절차를 반복합니다.
  5. 펌프 호스 (태평양 표준시)와 중간 공급 그랜드 모세관 (S2)의 자유 단 하나의 매체 병 모세관 (S1)의 끝을 연결합니다. 제 2의 매질 병 모세관 및 제 2의 매질 공급 선 모세관에 대해이 절차를 반복합니다.
  6. 매체의 유리 주사기로 - 대응 모세관 (3.3 제조 F.2)와 스토퍼를 삽입하여 배지 분전반 조립분전반 (F.1).
  7. 매체 병의 부틸 고무 마개의 커넥터에 매체 분배 패널을 연결합니다 (E.7 - 그림 1에서 F를 비교).
  8. 스테인리스 바늘 잠금 루어에 헤드 스페이스 가스 교환 패널에 N 2 / CO 2 가스 라인에 연결 (도 1의 위치 (LLF)를 참조), 및 낮은 압력에서 N 2 / CO 2 열 설치하고 모세관 시스템 플러시 (<10 밀리바). 배지 병 모세관 (E.3), 3 방향 커넥터 (G. 7) 샘플링 포트 (D.5)의 개방 단부에서의 가스의 유출을 유지한다. 따라서, 유출 가스의 과압을 통해 멸균 상태를 유지하기 위해 약간 오픈 샘플링 포트 (D.6)의 모자를 가지고 있는지 확인하십시오.
    1. 적어도 20 분 동안 전체 설치 플러시.
      주 : 또한, 상기 outgassi를 닫을 수있다적절한 고무 튜브 및 설치를 완료 세척의 효율을 증가시키기 위해 클램프 헤드 스페이스 가스 교환 패널 NG 바늘 (C.6).
  9. 한편, N에 10 L의 가스 주머니 (GP)을 충전 2 / CO 2 백을 위해 전체 볼륨 (진공 펌프를 사용하여) 충전 및 탈기 10 발사하기 (V / V, 90/10)을 완전히 무산소 인 . 최종 충전 후 가스 팩의 밸브를 폐쇄해야합니다. 제 2 가스 팩이 절차를 반복하지만, 탈기 한 후 밸브를 닫습니다 (즉, 빈두고).
    주 : N 2 / CO 2 가스 충전 팩 펌핑으로 인한 매체 손실 증가 헤드 스페이스 부피를 보상하기 위하여 배지 병에 연결된다. N 개의 2 / CO 2 플러싱하지만, 빈 가스 팩 나중에 가스로 인해 액체의 토출량을 증가시키는 상부 공간을 벗어날 수 있도록하기 위해, 방전 병에 연결된다.
  10. 삽입 t(- 3.6 절에 준비 E.8)면 가득 멸균 유리 주사기에 - 그는 고무 마개 (섹션 3.2.3에서 제조 E.10)를 부틸.
  11. 다음 매체 병 (E.2)의 스토퍼로 실험실 벤치에 - (섹션 1에서 제조 E) 충진 및 폐쇄 매체 병 배치 다음 절차를 이용하여 배지 병에 상기 스토퍼를 연결하는 제조 :
    1. 호스 클램프 대응 고무 튜브 (E.5)를 폐쇄하여 모세관 (E.3)로 N 2 / CO 2 가스 흐름을 닫습니다.
    2. 가볍게 매체 병 오프 부틸 고무 마개를 들어 올려 병목 현상으로 구부러진 긴 금속 바늘 (1mm X 140mm)과 멸균,면 - 채워진 주사기를 매달아 N 2 / CO 2 (50 밀리바)과 헤드 스페이스를 플러시 매체 병의 (Hungate & 메이시 (17)를 비교).
    3. 신속 배지 병에서 부틸 고무 마개를 제거하고 배지 병 (E)로 제조 된 부틸 고무 마개 (E.2)를 삽입한다.
    4. 일회용 바늘 (앞서 헤드 스페이스 플러싱에 사용) 주사기의 긴 금속 바늘을 변경 (0.9 mm X 45mm, 널리 사용되는) N 2 / CO와 배지 병의 상부 공간을 세척하기 위해 상기 스토퍼 내로 주입 2.
    5. 매체 병의 마개에 연결 - 가스 주사기 (섹션 5.10에서 조립 E.8)의 개방 단부에서 가스 약간의 유출을해야합니다. 매체 용기 (E) 및 적어도 4 분 동안 유리 주사기 (E.8)의 헤드 스페이스에 플러시.
  12. 한편, (D.'5)를 샘플링 포트의 플라스틱 캡 (D.6)를 조여 및 클램프 (D.4)에 대응하는 고무 튜브 (D.2)를 닫습니다.
    참고 : 필요한 경우, 열바늘의 개방 단부에서의 가스의 유출을 유지하기 위해 다시 헤드 스페이스 가스 교환 패널의 아웃 개싱 바늘 (C.6).
  13. 실험실 벤치에서 N 2 / CO 2 (섹션 5.9에서 준비) 가득 (10) L 가스 팩을, 놓습니다. 튜브 커넥터 옆에있는 매체 병에 연결된 유리 주사기 (E.8)의 개방 단부에 위치에 있는지 확인하십시오.
  14. 최소 4 분 동안 배지 병 (E)의 상부 공간을 세척 한 후, 세척 주사기의 N 2 / CO 2 가스 라인을 감고 빨리 스토퍼 (E.2)로부터 주사 바늘을 ​​당긴다. 매체 병의 헤드 스페이스 내의 가스의 나머지 과압 유리 주사기 (E.8)를 통해 발표 될 예정이다.
    1. 신속 가스 팩의 밸브를 개방하고 가볍게 튜브 가스 팩의 커넥터를 세척하기 위해 / CO 2 N 2의 유출을 유지하기 위해 가방 누른다.
    2. 즉시 과압이 병 매체로부터 해제 될 때, 신속하게 유리 주사기 (E.8)의 상응하는 커넥터에 가스 팩 (gp.3)의 커넥터를 연결한다.
  15. 이전에 방전 병에 연결된 3 방향 커넥터 (G.7)의 프리 포트에 N 2 / CO 2 (섹션 5.9에서 준비) 10 회 플러싱 빈 (10) L 가스 팩 (GP)를 연결합니다. 가스 팩의 밸브가 폐쇄 유지해야합니다.
  16. (; 위치 LLF 그림 1 C)를 가스 방출 바늘 (C.6)에서 가스의 유출을 유지하기 위해 헤드 스페이스 가스 교환 패널에서 N 2 / CO 2 가스 라인 (<0.1 밀리바)의 압력을 줄일 수 있습니다.
  17. 펌프 (P)에 펌프 호스 (PT)를 삽입하고 매체 병 (E)의 대응 고무 튜브 (E.6)에서 호스 클램프를 제거합니다.
    1. 가스 팩의 밸브 (GP)를 엽니 다방전 병 유출 배지로 채우는 동안 공기가 가스 팩으로 배출 할 수 있도록 배출 병 (G)에 접속되어있다.
  18. 펌프를 시작하고 중간 유통 패널을 모니터링하는 매체로 채우고 () (F 참조). 이 반전 된 위치에 그것을 들고 의해 채워으로 패널에 남아있는 가스를 제거해야합니다. 가스는 펌프에 연결되는 모세관을 통해 방출된다.
  19. 이 매체로 채워으로 열을 모니터링하고 시뮬레이션하기 위하여, 10 mM의 철 (II) / m 2 / (D)의 상하 유동으로 변환 할 수 0.45 L / 일의 적절한 펌핑 속도로 펌프를 조정 관심있는 화학 플럭스.
  20. 2cm 열의 상단부 상기 광원 (L)를 설치하고, 칼럼의 상부로부터 방사로부터의 광을 방지하기 위해 어두운 테이프 및 / 또는 알루미늄 호일로 열 주위 상부 (10)의 형상을 덮 컬럼의 밑 부​​분을 조명. 전체를 커버순서 어두운 섬유 커버 설치는 외부 광원에서 컬럼의 조명을 방지합니다.

열로 박테리아 6. 예방 접종

주 : 비 생물 제어 실험이 단계를 건너 뜁니다.

  1. 세포 배양 직접 컬럼의 측면을 따라 메인 샘플링 포트의 부틸 고무 마개를 통해 컬럼에 주입되기 때문에, 열 본체의 중심에 도달하기에 충분히 긴 바늘 여섯 주사기를 제조 한 것으로 확인.
  2. 의 EtOH 용액 (80 %)과 열 (A.3)의 6 가지 주요 샘플링 포트 부틸 고무 마개의 외부를 소독.
  3. (섹션 2에서 제조) 준비 접종에 대한 문화와 혈청 병을 가지고 EtOH로 솔루션의 몇 방울을 불타는하여 부틸 고무 마개를 소독. 문화의 분취 량을 복용하기 전에 멸균 N 2 / CO 2 주사기를 플래시합니다. 1 ml의 오 타고무산소 셀 용액 F 메인 샘플링 포트 (A.3)의 부틸 고무 마개를 통해 컬럼의 중심에 주입한다.
    주 : 세균의 성장에 따라, 세척되는 배양 방지 세포 성장과 발전의 지연 위상의 제 일 동안 펌핑 속도를 조정 (또는 펌핑을 정지) 할 필요가있다.

7. 견본 추출

참고 : 컬럼 내부 개발 화학적 구배에 걸쳐 샘플을 수집하기 위해, 체적 감소가 발생하는 바와 같이, 깊은 포트 가기 전에 샘플링 포트에서 샘플링을 시작할 필요가있다. (분젠 버너의 40cm 이내 또는 층류 흐름 후드 아래에 협력하여, 예를 들어) 멸균 상태를 유지해야합니다.

  1. 첫 번째 샘플을 접종 후 24 시간을 수집합니다. 멸균 N으로 샘플링을 위해 사용되는 주사기에 플러시 2 / CO 2 SA에 산소 주입을 방지하기 위해mpling 포트 (D). 샘플링하기 전에 / CO 2 N 2 주사기를 작성해야합니다.
  2. 신속 플라스틱 캡 (D.6)을 제거하고 튜브 커넥터 (D.5)에 샘플링 주사기를 삽입합니다. 주사기와 튜브 커넥터 사이에 작은 간격을 유지한다. 주사기에서 가스를 분리 및 / CO 2 N 2 튜브 커넥터를 세척합니다.
    1. 단단히 튜브 커넥터에 주사기를 연결합니다. 클램프 (D.4)를 제거하고 약 1 ML의 샘플을 복용 시작합니다.
  3. 샘플을 그린 후 주사기를 제거하기 전에, 클램프 (D.4)를 연결합니다. 그리고 샘플링 주사기를 제거하고 단단하게 대응하는 플라스틱 캡 (D.6)와 튜브 커넥터 (D.5)를 닫습니다.
  4. 즉시 모든 포트에서 샘플링 단계 7.1-7.3를 반복합니다.
  5. 샘플의 다음 세트마다 24 시간을 수집합니다.
    주의 : 다른 시간 단계에서 추가 샘플의 경우, 작은 AM을 제거 할 필요가있다샘플 ount (예를 들어, 0.2 내지 0.4 mL) 중 초기 샘플 전에는 샘플링 튜브의 내부에 잔존 매체를 제거하고, 컬럼 내부에서 대표 샘플을 달성하기 위해 수행 될 수있다.

분석 8. 방법

  1. 산소 정량 :
    주 : 관류 매질과 칼럼의 헤드 스페이스 내의 산소 농도를 비 침습적으로 정량화 비파괴 광학 산소 센서 및 0.5 × 0.5 cm (소위 optodes) 산소에 민감한 형광 호 패치를 사용하고, 함께 붙어 실리콘 접착제 (A.6)를 사용하여 칼럼의 내부 유리 벽. 또한, 산소에 민감한 포일 패치 안정적인 측정을 달성하기 위해 페 종 둔감 것을 확보 하였다.
    1. 열에서 사용되는 optodes에 대한 적절한 교정 매개 변수를 사용하여 컴퓨터 소프트웨어를 교정해야합니다. 광학 산소 센서는 특정 calibrat와 함께이온 측정에 대응하는 PC 제어 광섬유 산소 측정기를 사용.
    2. 측정을 시작하고 컬럼의 투명 유리 벽 안쪽에 붙어있는 산소에 민감한 호일에 직각으로 산소 측정기의 고분자 광섬유를 개최주의하십시오.
    3. 열 걸쳐 매 O 2 측정 지점에 대해 측정을 반복합니다.
  2. 철 (II) 수용액과 샘플의 총 철 분석 :
    1. 철 (II)은 중성 pH에서 빠르게 공기 중의 산소에 의해 산화되기 때문에, 1 M HCl 용액을 즉시 수성의 Fe (II) 정량 액체 샘플을 안정화. 하나의 최종 샘플 볼륨 ml를 0.5 ml의 2 M HCl로 0.5 ㎖의 액체 시료를 혼합한다.
    2. 30 분 동안 (1 M 염산 10 중량 % / V) 히드 록실 아민 염산염과 1 M 염산 - 안정화 된 샘플의 분취 량을 배양 한 후에 총 철 정량화. 이 시약은 감소 후 Ferrozine 분석을 통해 정량화 될 수의 Fe (II)에 대한 모든 철 (III), 21.
    3. 마이크로 타이 터 플레이트 판독기를 사용하여 분석을 수행 Ferrozine. 562 nm 파장에서의 흡광도를 측정한다. 검출 철 (II) 및 총 철 농도의 범위 내에서 기준을 가지고해야합니다.
      주 : 액체 시료에서 철 농도는 표준 교정을 초과하면, 1 M HCl로 안정화 된 샘플을 희석 할 필요가있다.
    4. 총 철 및 Fe (II)의 차이에 의해 철 (III)의 농도를 계산한다.

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결과

제어 실험

비 생물 제어 실험 (십일)이 지속적으로 낮은 산소 농도를 보여 주었다 (O 2 <유한 요소 (II에서 유의 한 변동와 0.15 ㎎ / ℓ)) -profile 위로 향하는 물기둥을 통해. 석출물의 형성은 (아마도의 Fe (III) (oxyhydr-)의 산화물) 배지 저장조와 연결을 통해 10 일 일부 산소 확산을 나타내는 500 μM 내지 440 μM의 총 철 (II) 농도의 약간의 감소 고무 (예 E.6도에서 gp.1 1) (22)이 실험은, 합리적으로 달성 하였다 최저 산소 농도 ≤0.15 ㎎ / ℓ이었고 민감한 산소 정량 및 검출 한계의 범위이다.<...

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토론

선캄브리아 바다에서 미생물 커뮤니티에 의해 규제, 또는 활동의 결과 및 일반적인 화학적 조건으로 수정되었습니다. BIF의 기원을 해석에서 연구자들은 일반적으로의 퇴적 또는 BIF의 지구 화학, 예를 들면, 스미스 등. (23)와 존슨 등. (24)에 따라 미생물의 존재 활동을 추론. 고대의 환경 지구 화학적 유사체가 현대적인 환경에서 현대 생물의 연구는 가치있는 접근 방식, 예를 들어, 크로우 등. (11)와 Koeksoy 등. (14)이다. 세 번째 방법은 선캄브리아 바다에서 일어나는 프로세스를 모의 실험 설계 시스템, 예 Krepski 등의 생물을 이용된다. 25. 이러한 유형의 접근법은 특정 가설 테스트, 화학 또는 현대 시스템에 존재할 수있는 생물학적 요인을 제거하기 위해 유용하지...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

마크 노프 호프는 배관 연결의 설계 및 구현에 도움. 엘렌 STRUVE 선택하고 사용하는 장비를 획득 할 수있었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Widdel 플라스크 (5 L)Ochs110015labor-ochs.de
유리 병 (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
유리 피펫 (5 ml)51714labor-ochs.de
0.22 µ m Steritop 필터 유닛 (0.22  &마이크로; m 폴리에테르설폰 막)MilliporeX337.1carlroth.com
알루미늄 호일
멸균 루어 잠금 유리 주사기, 면C681.1carlroth.com
루어 잠금 스테인리스 스틸 바늘 (150 mm, 1.0  mm ID)201015labor-ochs.de
NaCl시그마433209sigmaaldrich.com
MgSO4Sigma208094sigmaaldrich.com
CaCl2SigmaC4901sigmaaldrich.com
NH4Cl시그마A9434sigmaaldrich.com
KH< sub>2PO4SigmaP5655sigmaaldrich.com
KBrSigmaP3691sigmaaldrich.com
KClSigmaP9541sigmaaldrich.com
유리 실린더Y310.1carlroth.com
Glass wool7377.2carlroth.com
Glass beads (ø 0.55 - 0.7& 주의; mm)11079105biospec.com
부틸 고무 마개(ø 1.2cm)271024labor-ochs.de
페트리 접시, 유리(ø 8.0  cm)T939.1carlroth.com
폴리머 접착제OTTOSEAL S68adchem.de
광학 산소 센서 호일 (산소 분석을 위해, 아래 참조)– 요청시 –presens.de
고무 튜브(35mm, 7  mm ID)770350labor-ochs.de
Luer Lock 튜브 커넥터 (3.0 mm, Luer lock male = LLM)P343.1carlroth.com
Luer Lock 튜브 커넥터 (3.0 mm, Luer lock female = LLF)P335.1carlroth.com
고무 튜브 (25 mm, 0.72 mm ID)2600185newageindustries.com
고무 튜브 (50 mm, 7  mm ID)770350labor-ochs.de
Luer Lock 스테인리스 스틸 바늘(150mm, 1.0mm ID)201015
labor-ochs.de Luer Lock 유리 주사기(10ml)C680.1carlroth.com
루즈 코튼 –
부틸 고무 마개 (ø 1.75 cm)271050labor-ochs.de
스테인레스 스틸 바늘 (40mm, 1.0  mm ID)Sterican4665120bbraun.de
Luer Lock 스테인리스 바늘 (150mm, 1.5mm ID)201520
labor-ochs.de 위치: Luer Lock 암 커넥터 부분 C.7
폴리머 접착제OTTOSEAL S68adchem.de
스테인레스 스틸 바늘 (120mm, 0.7mm ID)Sterican4665643bbraun.de
고무 튜브(40mm, 0.74mm ID)2600185
newageindustries.com 열수축 튜브(35  mm, 3mm ID 축소)541458 - 62conrad.de
튜브 클램프STHC-C-500-4tekproducts.com
Luer Lock 튜브 커넥터(1.0mm, LLF)P334.1carlroth.com
Luer Lock 플라스틱 캡(LLM)CT69.1
carlroth.com 유리병(5L)RotilaboY682.1carlroth.com
부틸 고무 스토퍼( GL45)444704labor-ochs.de
스테인레스 스틸 캐필러리 (300 mm, 0.74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
스테인레스 스틸 캐필러리 (50 mm, 0.74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
수축 튜빙 (35 mm, 3  mm ID 축소)541458 - 62conrad.de
고무 튜빙 (100 mm, 0.74 mm ID)2600185
newageindustries.com Luer Lock 튜브 커넥터 (1.0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Luer Lock 유리 주사기 (10 ml)C680.1carlroth.com
루즈 코튼 –
부틸 고무 스토퍼 (ø 1.75 cm)271050
labor-ochs.de 스테인레스 스틸 바늘 (40 mm, 0.8  mm ID)Sterican4657519bbraun.de
Luer lock 유리 주사기(5ml)C679.1carlroth.com
부틸 고무 마개(ø 1.75mm)271050labor-ochs.de
고무 튜브(40mm, 0.74mm ID)2600185newageindustries.com
유리병(2L)RotilaboX716.1carlroth.com
부틸 고무 마개(GL45용)444704
labor-ochs.de 스테인리스강 캐필러리(50mm, 0.74mm ID)56736sigmaaldrich.com
고무 튜브(30mm x 0.74mm ID)2600185newageindustries.com
고무 튜브(100mm x 0.74mm ID)2600185
newageindustries.com Luer Lock 튜브 커넥터(1.0mm, LLF)P334.1carlroth.com
Luer Lock 3-way 커넥터 (LLF, 2x LLM)6134cadenceinc.com
광원삼성SI-P8V151DB1USsamsung.com
연동 펌프IsmatecEW-78017-35coleparmer.com
펌핑 튜빙 (0.89  mm ID)EW-97628-26coleparmer.com
스테인리스 스틸 캐필러리(200mm, 0.74mm ID)56736sigmaaldrich.com
스테인리스 스틸 캐필러리(400mm, 0.74mm ID)56737sigmaaldrich.com
Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) 가스 팩(10 L)30240-Usigmaaldrich.com
고무 튜브(30 mm, 6  mm ID)770300labor-ochs.de
Luer Lock 튜브 커넥터 (3.0 mm, LLM)P343.1carlroth.com
Luer Lock 튜브 커넥터 (3.0 mm, LLF)P335.1carlroth.com
Gas-tight syringe (20  ml)C681.1
carlroth.com Bunsen 버너–
산소 정량화를 위한 광섬유 산소 미터PresensTR-FB-10-01presens.de
진공 펌프–
산소 옵토데스용 실리콘 접착제PresensPS1presens.de

참고문헌

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