Method Article

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

DOI:

10.3791/54252

⸱

October 8th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

Abstract

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다분화능 중간엽 줄기세포/기질 세포(MSC)는 해부학적 조직 위치가 불분명한 상태에서 1차 조직 소화물로부터 플라스틱 부착을 통해 일반적으로 분리되었습니다. 최근 우리 그룹과 다른 연구자들이 여러 조직에서 혈관 주위 세포에 의해 정의된 혈관 주위 및 MSC 세포 마커 발현을 발견한 것은 다분능 혈관 주위 전구 세포의 특정 균질한 하위 집단을 전향적으로 분리하고 정제할 수 있는 기회를 제공했습니다. 우리는 이전에 인간 골격근에서 미세혈관 CD146+CD34- 주피세포 및 혈관 CD34+CD146- 외래 세포를 정제하기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하는 것을 입증했습니다. 본 명세서에서는 양성 및 음성 선택에 대해 정의된 세포 표면 마커 세트의 발현을 기반으로 FACS에 의해 인간 심근에서 이러한 두 개의 혈관 주위 세포 하위 집합을 동시에 분리하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 방법은 기초 연구 및/또는 치료 조사에 사용하기 위해 다분출 심장 MSC 유사 전구체 세포의 두 가지 특정 하위 모집단을 사용할 수 있도록 합니다.

Introduction

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마음은 긴 후 유사 분열 기관으로 간주되고있다. 그러나 최근의 연구는 성인 인간의 마음 (1) 제한 심근 매출의 존재를 증명하고있다. 심근 분화 가능성을 가진 기본 줄기 / 전구 세포는 혈관 주위 전구 세포 2, 3, 가장 최근에 성인 설치류와 무서-1 +를 포함하여 인간의 마음, C-키트 +, cardiosphere 형성의 심근 내에서 확인할하고있다. 이러한 세포는 세포 이식 또는 원위치 증식 자극으로 심장 수선 / 재생을 향상시키는 목적으로 치료를위한 매력적인 후보를 나타낸다.

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)가 심혈관 수리 6으로 MSC의 치료 응용 4,5- 임상 시험은 여러 병리학 적 조건에서 수행 된 거의 모든 인간의 조직으로부터 분리 된, 이식편 대 숙주 질병 7 및 간경변 8. 유익한 효과에 중간 엽 줄기 세포의 능력에 기인 한 : 염증 9의 사이트에 홈; 상이한 세포 유형으로 분화 10; 프로 수복 분자 (11)을 분비; 호스트 면역 반응 (12)을 변조한다.....

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Protocol

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인간의 심장 샘플 1. 처리

  1. 모든 유체, 용기, 악기 및 전용 운영 지역은 멸균 있는지 확인합니다.
  2. 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 얼음에 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 함유하는 냉각 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)으로 이루어지는 기억 매체 (조직 은행 또는 수술 팀 조달) 심장 조직 샘플을 놓고 교통 3.
  3. 기억 매체로부터 심장 샘플을 제거하고, 2 % FBS와 1 % P / S가 보충 인산 완충 용액 (PBS)으로 이루어지는 세척 배지로 세척 하였다. 샘플을 취급 할 경우, 대형 선박 또는 심낭을 파악하고 심근의 분쇄 최소화하기 위해 좋은 팁 집게를 사용합니다.
  4. 페트리 접시에 세척 매체에 샘플을 잠수함과 3 설명한 바와 같이 살균 홍채 가위와 뾰족한 집게로 심낭, 내막과 큰 혈관을 제거합니다.
  5. 나머지 myoca 컷하나의 측면 면도날이나 날카로운 홍채 가위를 사용하여 약 1mm 3의 작은 조각으로 rdium. 참고 : 샘플을 즉시 처리하는 경우 최고 세포 수율을 얻을 수 있습니다. 지연이 불가피한 경우, 새로운 기록 매체에 처리 된 심장 조직의 스토리지 (> 1cm 3 조직 당 5 ㎖)를....

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Results

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단일 세포를 전방 및 측면 산란 분포에 기초하여 파편과 이중선 구별 하였다. 라이브 세포는 DAPI 염색을 차지하기 위해 자신의 실패에 의해 확인되었다. 게이팅 전략이 라이브 전체 심근 세포의 분리 (도 1)의 이소 제어 라벨에 기초하여 선택되었다. 살아있는 세포에서 CD45 + 세포는 먼저 밖으로 게이트 된 CD56 + 세포 하였다. CD144 + 내피 세포 다음 CD56에서 제거 - 분획. 마지막 인구에서 CD146 + / CD34 - 혈관 주위 세포와 CD146 - / CD34 + 외막 세포는 수집 된 이후에 (그림 2)을 선택했다. 즉시 세포 수집 한 후, 각 모집단의 작은 샘플 (500 ~ 1,000 세포) 초기 정렬에 기록 된대로였습니다 세포의.......

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Discussion

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증가 증거는 부상 후 성인 인간의 마음의 제한된 재생 능력을 지원합니다. 부상 마음에 이러한 재생 반응에 대한 책임 네이티브 전구 세포의 식별 및 특성화 관련 메커니즘 및 신호 전달 경로의 이해와 치료 이러한 세포를 활용하는 방법의 개발 모두에 중요하다.

이전 프로토콜 인간 골격근 (25)로부터 혈관 주위 전구 세포 서브 세트의 분리를 설명 하였다. 그러나, 심장 조직에 이러한 기술의 직접적인 응용 프로그램은 종종 매우 가난한 세포 수율을 초래한다. 따라서, 우리는 인간 심근 생검에서 혈관 주위 세포 전구체, 즉, 외막 세포 및 외막 세포의 두 개의 분리 된 부분 집단을 풍부하게하는 두 서브 세트들의 동시 정제를 용이하게하기 위해 프로토콜에 큰 조정을 만들었다. 의 S에서 모두 세포 집단의 분리AME 샘플뿐만 아니라 소중한 심장 조직 생검의 사용을 최적화뿐만 아니라 별개의 혈관 주위 세포 하위 집합의 직접 비교를 할 수 있습니다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 갈등이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 유세포 분석에 대한 전문적인 도움을 준 에든버러 대학의 Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi 및 Will Ramsay와 피츠버그 대학의 Alison Logar 및 Megan Blanchard에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 인체 조직을 확보하는 데 도움을 준 Anne Saunderson과 Lindsay Mock에게도 감사드립니다. 인간 성인 및 태아 심장 조직 샘플은 각각 NHS 스코틀랜드 테이사이드 의료 연구 윤리 위원회와 NHS 로디언 연구 윤리 위원회(REC08/S1101/1)의 완전한 윤리 허가를 받아 조달되었습니다. 이 연구는 의학연구위원회(Medical Research Council, BP), 영국심장재단(British Heart Foundation, BP), 펜실베이니아 연방(Commonwealth of Pennsylvania, BP), 피츠버그 아동병원(Children's Hospital of Pittsburgh, BP), 국립보건원(National Institute of Health R01AR49684, JH) 및 R21HL083057(BP), 피츠버그 대학교(University of Pittsburgh)의 Henry J. Mankin 기부 의장(Henry J. Mankin Endowed Chair)의 보조금으로 지원되었습니다. ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AbC 안티 마우스 비드 키트분자 프로브A-10344
콜라겐 분해 효소 IGibco17100-017필요에 따라 분말을 재구성하고 필터 살균
Collagenase IIGibco17101-015
Collagenase IVGibco17104-019
Anti-human CD34-PEBD Pharmingen 555822멸균 유지
안티 휴먼 CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833멸균
안티 휴먼 CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747멸균
안티 휴먼 CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566멸균
안티 휴먼 CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647멸균 유지
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162
DMEM, 고포도당, 피루브산나트륨이 없는 GlutaMAXThermoFischer Scientific10566-016
Fetal Bovine SerumThermoFischer Scientific10500-064분취량에서 동결하고 멸균 상태로 유지
GelatinSigma AldrichG1393멸균수로 희석
IgG1k-PEBD Pharmingen559320멸균 유지
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873멸균 유지
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872멸균 유지
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566멸균 유지
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647멸균
마우스 혈청유지 Sigma AldrichM5905Keep 멸균
파라핀 필름 - Parafilm MSigma AldrichP7793
페니실린-스트렙토마이신Gibco15979-063분취량에 동결하고 멸균 유지
인산염 완충 식염수 pH 7.4ThermoFischer Scientific10010-023멸균 적
혈구 용해 완충액 유지 Hybri-MaxSigma AldrichR7757멸균
Trypan 유지 블루 솔루션시그마 알드리치T8154
트립신-EDTA 0.5%(10x)인비트로젠15400-054
  FACSARIA FUSIONBD Pharmingen형광 활성 세포 분류기
가 부착될 때까지 세포 수집 및 배양용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al.

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