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방법 논문

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

14.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54256

⸱

2016년 9월 20일

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

이 논문에서

요약

이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

시험 관내 전사 분석법이 개발되어 널리 전사에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수년 동안 사용된다. 이 프로세스는 다중 서브 유니트 DNA 의존성 RNA 폴리머 라제 (RNAP) 유전자 발현시 RNAP의 활성을 조절하는 작용을하는 전사 인자의 연속을 필요로한다. 방사성 표지 성적 시퀀싱 겔 전기 영동이란 파라미터를 미치는 영향 전사 진행하여 기계적 상세한 정보를 제공하기 위해 사용된다. 본 논문에서는 필수 연장 인자는 전사 누사 일시뿐만 아니라 RNAP 완전 효소 형성의 억제를 통해 전사 개시 타겟팅 항균제를 식별하는 방법을 조절하는 방법을 연구하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 아직 불분명 남아있는 전사 인자의 작용 메커니즘뿐만 아니라 새로운 항균 카발라을 탐구하는 추가 방법의 개발을위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다TS는 항생제 연구 개발의 활용도가 낮은 약물 표적 인 전사를 대상으로.

서론

RNA 전사는 특정 DNA를 주형으로 합성되는 과정이다. 진핵 세포에서 세 가지 RNAPs있다 : RNAP 내가 rRNA의 전구체 사본을 만듭니다가, RNAP II는 mRNA의 특정 작은 핵 RNA를 합성에 대한 책임이며, 5S rRNA의와의 tRNA의 합성은 RNAP III에 의해 수행된다. 박테리아에서, RNA의 모든 클래스의 전사에 대한 책임 하나만 RNAP있다. 개시, 신장 및 종료 : 전사의 세 단계가 있습니다. 전사는 셀의 가장 높은 조정 프로세스이다. 전사주기의 각 단계는 하나의 유전자 발현의 조절에 대한 검사를 나타낸다. 개시 내용 RNAP 오픈 프로모터 복합체를 형성 촉진제 2라고 특정 사이트에 효소를 유도 할 필요가있는 완전 효소 형성 시그마 인자와 연관이있다. 그 후, 전사 인자의 넓은 스위트 룸은 규제 오에 대한 책임이 있습니다신장 및 종료 단계에서 F RNAP 활동. 여기서 조사 전사 인자는 누사 고도로 보존 필수적인 단백질이다. 이것은 rRNA의 합성 3-5 중에 전사 일시 정지 및 종료뿐만 아니라 항 - 종단 조절에 관여한다.

시험 관내에서 전사 분석은 전사 6시 복잡한 규제 단계를 연구하는 강력한 도구로 개발되었다. 일반적으로, 프로모터 영역을 포함하는 DNA의 단편은 선형 전사 주형으로 요구된다. DNA를 템플릿은 일반적으로 PCR에 의해 또는 플라스미드를 선형화에 의해 생성된다. 정제 된 단백질 (검출을 위해 하나의 방사성 NTP 포함) NTPS을 첨가하고 생성물을 배양 필요한 기간 후의 분석된다. 적절한 템플릿과 반응 조건을 사용하여, 전사의 모든 단계는 transcr의 상세한 분자 특성을 활성화 한이 접근법을 사용하여 검사 된지난 반세기 이상 7 iption. RNAP의 3 차원 구조에 대한 정보와 함께 또한 항생제 항생제 리드에 의해 전사 억제의 분자 메커니즘을 조사하고, 새롭게 개선 된 약제 8-10의 개발에이 정보를 사용할 수있다.

본 연구에서 우리는 전사 분석법 전사 신장 / 종료 인자 누사 방법 및 신규 한 전사 개시 저해 리드의 작용 메카니즘이 결정될 수에 의해 규제기구를 결정하는 데 사용될 수있는 방법의 예를 제공한다.

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프로토콜

주의 : 실험 방사성 동위 원소 32 P의 사용을 포함하는 모든 적절한 안전 조건이 충족 될 때까지 어떤 작업이 수행되지 않을 것이다. 일반적으로 사람은 안전 코스에 참석 전에 방사성 시약을 사용하여 실험에 감독 관행을 받게해야합니다. 반응을 수행 할 때 개인 보호 장비를 착용하십시오 (열 발광 선량계, 보호 안경, 장갑, 방사선 실 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관).

분석 자료 ​​1. 준비

  1. 전사 분석을위한 단백질 필요를 얻습니다.
    1. 여기에 설명 된 실험, 과잉 생산 및 E.을 정화 대장균 RNAP은 실험실에서 상용 소스 (자료 목록)에서 11 설명, 또는 얻을 수있다.
      참고 : 모두 비슷한 결과를 제공합니다. 원시 또는 친화 표지 RNAP을 정제하는 다른 방법은 12, 13을 이용할 수있다. 시그마 / 누 인자 D로 얻을 수있다이전 작품 14, 15에 escribed.
  2. 디 에틸 피로 카보네이트의 제조 (DEPC) 처리 된 물
    참고 : 또는의 RNA 분해 효소가없는 물을 상업적 출처 (자재 목록)에서 얻을 수있다.
    1. 정제 물 1 L에 1 ml의 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC)를 추가 (0.1 % v / v)의 하룻밤 섞는다.
    2. 두 번 오토 클레이브 DEPC 물과 팁.
  3. DNA 템플릿 준비
    1. 플라스미드 정제 키트 제조업체의 지시에 따라 (자재 목록)을 사용하여 플라스미드 pSG1154 16 및 / 또는 17 pIA226 정제.
    2. 결선 전사 분석을위한 템플릿을 증폭합니다 (P xyl 프로모터 영역을 포괄하는 360 bp의 단편), 25 ㎕의 2 배 PCR 믹스 (자료 목록)를 포함하여 얼음에 PCR 반응을 조립 2 μL 프라이머의 각 (5 μM) 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(정방향) 및 5'-CCCATTAACATCACCATC-3'(리버스), 1 μL pSG1154 플라스미드 PReparation (250 μM) 20 ㎕의 정제수).
      1. 또는 대안 적으로, 하나의 원형 전사 분석법, pIA226 (17)로부터 λ의 P R 프로모터 영역을 포괄 447 bp의 단편을 증폭한다. 25 ㎕의 2 배 PCR 믹스 2 ㎕를 프라이머 각각 (5 μM)을 사용하여 얼음에 PCR 반응 설정 : 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(정방향) 및 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3'(리버스), 1 μL의 pIA226 17 플라스미드 준비 (250 μM) 20 ㎕의 정제수).
        참고 :이 템플릿 전사 시작 사이트에서 26 번째 염기 인 26 NT를 위치까지 시토신 없다. 따라서, 전사 개시, 프로모터 통관을 허용합니다이 템플릿을 사용하여 만 ATP, UTP 및 GTP 반응에있을 때 안정적인 전사 신장 복합체 (EC)을 형성 NT 26에 실속.
    3. 다음과 같은 조건으로 PCR 반응을 설정 : 95 °를30 사이클 반복 30 초, 30 초, 30 초 동안 50 ° C, 72 ° C에 대한 C.
    4. 제조업체의 지침에 PCR 청소 키트 (자료 목록)에 따라를 사용하여 제품을 정화하고 전사 분석 100 μl의 전사 버퍼에 용출.
    5. fluorospectrometer (자료 목록)을 사용하여 템플릿 DNA 농도를 결정합니다.
  4. NTP 준비
    참고 : NTPS가 다른 상용 소스 (자료 목록)에서 얻을 수 있습니다.
    1. -20 ° C에서 1.5 ml의 튜브 (각 관에서 50 μL) 및 저장소에 1 M 주식, 나누어지는 용액 1 ㎖를 만들기 위해 DEPC 처리 된 물 (≥99 % 순수) NTPS을 녹인다.
    2. 주문 32 P UTP (3000 CI / mmol)을 실험하기 전에. α- 32 P는 14.29 일의 짧은 반감기를 가지고있다.
      참고 : 알파 - 표지 된 UTP를 사용하여 길이가 다른 밴드의 강도를 비교 피한다.
  5. RNA 사다리 준비
    1. 후속 조립실온에서 보내고 반응 0.5 μg의 RNA 템플릿 믹스 (자재 목록), 80 mM의 HEPES 완충액 pH7.5, 12 밀리미터의 MgCl 2, 10mM의 염화나트륨, 10 mM의 DTT, 2 mM의 ATP / CTP / GTP, 0.5 mM의 UTP 2 μL 32 P UTP, 0.5 μL T7 RNAP (자료 목록), α- 20 μL에 물을 DEPC를 처리.
    2. 반응은 1 시간 동안 37 ° C에서 할 수있게합니다. 즉시 사용 또는 -80 ° C에 저장합니다.

RNA 시퀀싱 젤 2. 준비

  1. 젤 준비
    1. 시퀀싱 겔 장치 배의 70 % 에탄올과 정제수 (자재 목록)에서 접시를 닦고 빗살 두 스페이서 셀을 조립한다.
      주 : 하나의 판은 단계 4.2에서 겔의 제거를 용이하게 siliconizing 시약 (자재 목록)으로 코팅 될 수있다.
    2. 22 ml의 물에 33.6 g 우레아를 용해시키고, 5 배 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 완충액 (54g 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 16.4 ㎖; 27.5 g 붕산을 1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 10 ㎖ (자기 교반기를 사용 EDTA), 1 L의 물에서의 pH 7.4).
    3. (19 : 1) 40 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 용액 16 ml를 추가 우레아 용액 및 0.45 μm의 필터로 필터링.
    4. 514 ㎕의 10 %를 추가 (W / V) 상기 필터링 된 용액에 51.4 μL의 N, N, N ', N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)이어서 물에 새로 제조 한 황산 암모늄.
    5. 부드럽게 과도한 폭기를 방지 바닥 주입구로부터 수평 위치 사전 충전 시퀀싱 셀에 바로 원활하게 주입 겔 용액을 반전. 주입하는 동안 거품을 만드는 않도록주의하십시오.
    6. 젤이 완전히 전사 분석에서 사용하기 전에 설정 될 때까지 1.5 시간을 허용합니다. 시퀀싱 셀의 위에 수분 습윤 티슈 래핑 때 겔 2, 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다.

3. 전사 반응

  1. 전사 신장 일시 중지 분석
    1. 전사 신장 착물 형성
      1. 1.5 ML 튜브에 RNAP 핵심 효소 (전사 버퍼에 1 μM 주) 1 μl를 추가합니다.
      2. RNAP와 RNAP의 완전 효소를 형성하기 위해 10 분 동안 얼음에 품어 (전사 버퍼에 3 μm의 주식을 σ 70) 정제 시그마 - 70 인자의 1 μl를 추가합니다.
      3. RNAP의 완전 효소에 전사 버퍼에 3 ㎕를 500 nM의 정제 템플릿 DNA합니다 (pIA226 PCR 제품에서 λ P의 R 프로모터)를 추가 오픈 복합체를 형성하기 위해 5 분 동안 37 ºC에서 품어.
      4. 처리 DEPC 400 mM의 트리스 -HCl, 1.6 M KCl을 100 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 DTT, 50 % 글리세롤, pH를 7.9 : 10 배 전사 완충액 5 μL (자재 목록을 사용하여 다른 1.5 ㎖의 튜브에 반응 성분의 혼합물을 제조 물), 250 μM 각 GTP 및 UTP, 1 mM의 ATP의 1 μL 2 μL 및 α- 32 P UTP (3000 CI / mmol)을 1 μL. 41 μL에 DEPC 처리 된 물을 추가합니다.
        아니TE : RNA 분해 효소 억제제 (자재 목록)을 RNA 분해 효소의 오염을 최소화 할 수있다.
      5. 개방 착체를 함유하는 튜브에 혼합 용액을 옮기고 전사 신장 복합체 NT +26에서 정지 형성을 15 분 동안 37 ºC 부화.
      6. 실내 온도 (~ 21 ° C)에 대한 반응을 이동하고 50 μg / ML의 최종 농도 2.5 ㎎ / ㎖ 리팜피신 1 μl를 추가합니다.
      7. 반응 혼합물에 누사 정제는 0.1mm 1 μl를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양한다.
      8. 50 μL의 최종 부피를하고, 타이머를 사용하여, 반응 시간을 측정하기 위해 반응 혼합물에 250 μM C​​TP 2 μL를 추가한다.
      9. 전송 5~30에서 RNA 겔 로딩 완충액 (95 % 포름 아미드, 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 0.05 % 크실렌 cyanol) 2 μL로 반응 액의 μL, 60, 120, 240, 480, 1200 초의 반응을 종결.
      10. 방사성 폐기물 계속에서 32 P의 UTP 팁 및 튜브를 폐기ainer.
  2. 전사 개시 분석
    1. 열기 단지의 형성
      1. 0.5 μM 70 σ 정제 희석.
      2. 단계를 반복 3.1.1.1 0.5 μM (대신 3 μM의) (70) σ 정제하고, DNA 템플릿 (pSG1154 PCR 제품에서 P xyl의 프로모터 영역)를 사용하여 3.1.1.3에.
    2. 전사 개시 저해 분석
      1. 억제제가 완전 효소의 형성을 방해 할 수 있는지 여부를 검토하는 단계 3.1.1.2 및 3.1.1.3 다음 (단계 3.1.1.1 이후) σ (70) 또한 이전에 RNAP 핵심 효소에 RNAP의 완전 효소의 형성을 방지하기위한 억제제를 추가합니다.
      2. 또한, 단계 3.1.1.2 후, 경쟁력 RNAP 바인딩 (70) σ 억제 할 수 있는지 여부를 검사 할 억제제를 추가합니다.
      3. 대신 (S)의 억제제, DMSO, 억제제의 용매의 동일한 양을 사용하여제어 반응에서 째깍.
    3. 반응 완료
      1. -20 ° C에서 1 ㎎ / ㎖ 및 주식의 재고 농도로 물에 헤파린을 녹인다.
        참고 : 헤파린 오픈 복합체를 형성하지 않은 RNAP을 격리한다 수있는 DNA의 경쟁이다. 개방 복합체가 형성되면, 헤파린 RNAP의 DNA 결합 부위를 선택하고 예비 형성된 개방 착체로부터 전사를 억제 할 수 없다. 따라서, 헤파린은 단일 라운드 분석이 필요합니다; 그것은 다중 라운드 분석을 위해 필요하지 않습니다.
      2. 5 μL의 10 배 전사 완충액 (자재 목록), 1 ㎎ / ㎖ 헤파린 용액 1 ㎕를 10 mM의 각각의 ATP, GTP, 및 CTP 2.5 mM의 UTP 1 μL 및 α- (32)의 1 μL를 사용하여 반응 혼합물을 제조 P UTP (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. 45 μL에 DEPC 처리 된 물을 추가합니다.
      3. 전사 오픈 복소 펄스 스핀과의 반응 혼합물을 혼합하고 20 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
      4. 그래서 반응의 10 μl를 전송RNA 겔 로딩 완충액 (95 % 포름 아미드, 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 0.05 % 크실렌 cyanol) 5 μL로 lution 반응을 종결.

4. RNA 젤 실행 및 개발

  1. 변성 폴리 아크릴 아미드 젤을 실행
    1. 겔의 온도까지 약 1.5 시간 동안 1X TBE 버퍼에서 50 ºC에서 겔 50 W를 실행하고 버퍼는 50 ºC에서 안정적입니다.
    2. 30 초 90 ºC에서 열 샘플 및 겔에 얼음 전에로드로 이동합니다.
    3. (100 희석 1) 2 μL의 RNA 사다리를 포함하는 하나의 차선과 함께 겔의 상단에있는 우물에로드 샘플.
    4. 브로 모 페놀 블루 염료가 젤 아래 ~ 2 / 3에 도달 할 때까지 1X TBE 버퍼에 50 W 50 ºC에서 젤을 실행합니다.
  2. 젤 치료
    1. 열기 천천히 조심스럽게 시퀀싱 세포에서 상판을 분리합니다. 젤을 깨는 방지하기 위해 상당한주의를 기울입니다.
    2. 컷 chromatograpHY 용지 (자료 목록)은 브로 모 페놀 블루 염료 상단에서 젤 크기와 일치합니다. 방사성 표지 된 RNA 전 사체의 대략적인 위치를 확인하기 위해 가이거 카운터를 사용합니다.
    3. 겔 필터 종이에 부착까지 조심스럽게 단단히 필터 종이 젤 누릅니다 커버. 잘라와 비법 NTPS이 매우 뜨거울 수 있습니다 겔의 하단에 실행으로 방사성 폐기물에 겔의 바닥을 폐기하십시오.
    4. 진공 건조기의 건조 침대에 여과지의 비슷한 크기의 조각을 놓고 조심스럽게 겔 쪽이 위로 그것에 겔 코팅 용지를 배치합니다.
    5. 1.5 시간 동안 60 ° C에서 플라스틱 포장과 건조와 젤을 커버.
    6. 1 시간마다 다를 수있는 적절한 노출 시간으로, 플라스틱 랩 겔 코팅 된 여과지의 다른 측 랩, 촬상 경우의 photostimulable 형광체 접시에 놓고 밤새 반응 효율에 의존한다.
    7. 사용하여 형광 이미지 플레이트제조업체의 지시에 따라 이미 저 스캐너. 소프트웨어 설명서에 따라 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 상대 밴드 강도를 결정합니다.
    8. 작업 영역의 방사능 오염을 검사 조직 및 세정제로 의심되는 항목 및 영역을 닦고 폐기 용기에 조직을 배치하는 가이거 카운터를 사용한다.

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결과

전사 효율이 서로 다른 시점에서 주파수 대역에 방사선의 수준을 측정함으로써 결정될 수있다. 일시 중지 분석은 일시 정지, 종료의 시각화를 사용 누사 인자의 기능을 테스트하고 실행 - 오프 제품 (그림 1A)를합니다. (누사 NTD; 아미노산 잔기 1-137) 누사의 N- 말단 도메인의 존재에있어서, RNA 제품의 외관이 크게 누사 부족한 대조 실험에 비해 늦어졌다. 아미노산의 시리즈의 알라닌으로 누사 단편 또는 변경의 아미노산 잔기 104-137 (나선 3)의 삭제 (잔기 K36, K37, R104, Q108은 K111은 Q112은 Q116 및 R119)의 전체 결과 누사 일시 중지 활동의 손실. 헬릭스 3 잔류 R104과 K111은 누사 NTD 일시 정지 활동과 R104A 및 누사 NTD가 존재했다 제어 (그림 1B)와 유사한 일시 정지 반감기 값을 제공 K111A 구조에 필수적인 것으로 나타났다. 그것은이...

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토론

모든 생물에서 전사가 단단히 통제 프로세스이다. 전사 분석법이 전사 인자, 작은 분자의 전사 억제제의 효과를 테스트하기위한 플랫폼을 제공하기 위해 개발 된 시험 관내. 이 방법 논문에서는 일반 세균 전사에 대한 분석은 설명했다. 그들은 타임 라인을 따라 모든 전사 제품의 시각화를 허용하는 성적 증명서의 순서 겔 전기 영동과 결합 전사 분석은 기계적인 연구에 매우 중요하다. 결과적으로,이 방법은 반응 조건에서의 작은 변화의 영향을 식별 및 행동의 그럴듯한 메카니즘을 공개 할 수있다. 또한, 작용 메커니즘 알 전사 인자의 기능과 관련하여 특정 전사 분석법을 설계 가능해진다.

이 논문에서 우리는 RNAP의 holoen의 억제제의 작용 기전을 확인하는 방법을 설명효소 형성. 여기에 설명 된 방법은 시간에 각각의 RNA 전 사체의 변화를 표시 할 수 있으며, 적절한 수정과 적절한 전사의 각 단계에 대한 항균제의 테스트를 사용할 수 있습니다. 단일 라운드 분석은 경쟁 /...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 University of Newcastle(CM)의 Faculty Early Career Grant를 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에 필요한 단백질 얻
E. coli RNAPEpicentreS90250
DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 준비 시그마-알드리치 D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free WaterThermoFisherAM9937
DNA 템플릿 준비
마법사  플러스 SV Minipreps DNA 정제 시스템PromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
PCR 프라이머
Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템 PromegaA9281
NanoDrop 3300 형광분광계Thermo ScientificND-3300
NTP 준비
ATPSigma-Aldrich A6559
UTP시그마-알드리치 U1006
GTP시그마-알드리치 G3776
CTP시그마-알드리치 C9274
고순도 rNTPGE 헬스케어27-2025-01
&알파;-32P UTP 퍼킨엘머   BLU007C001MC방사성 화합물
RNA 래더 제제 
Novagen Perfect RNA 마커 템플릿 믹스 0.1– 1kb밀리포어69003
HEPES시그마-알드리치 H7006
염화나트륨시그마-알드리치 S7653
염화마그네슘시그마-알드리치 M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
겔 준비
Sequi-Gen GT 핵산 시퀀싱 셀 바이오 라드   165-3804
시그마코트   시그마-알드리치 SL2
요소   시그마-알드리치 U6504
트리스(하이드록시메틸)아미노메탄   시그마-알드리치 
붕산 시그마-알드리치 B7901
에틸렌디아민테트라아세트산 시그마-알드리치 ED
40% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 시그마-알드리치 A9926
과황산암모늄 시그마-알드리치 A3678
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)Sigma-Aldrich T9281
전사 분석
염화칼Sigma-Aldrich P9541
글리세롤   시그마-알드리치 G5516
리팜피신   시그마-알드리치 R3501
포름아미드   시그마-알드리치 F9037
브로모페놀 블루 시그마-알드리치 B0126
크실렌 시아놀 시그마-알드리치 X4126
헤파린 시그마-알드리치 84020
RNasin Ribonuclease 억제제PromegaN2511
전사 완충액 
트리스 베이스시그마-알드리치 T1503
염화칼시그마-알드리치 P9541
염화마그네슘Sigma-Aldrich M2393
디티   시그마-알드리치 DTT-RO
글리세롤   시그마-알드리치 G5516
여과지
Whatman  3MM Chr 크로마토그래피 종이Fisher Scientific05-714-5
방사성 오염 제거제
Decon 90decondecon90
젤 처리
Typhoon Trio+ 이미저GE Healthcare Life Sciences63-0055-89
전사 분석기154563륨 륨

참고문헌

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  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
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