이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
시험 관내 전사 분석법이 개발되어 널리 전사에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수년 동안 사용된다. 이 프로세스는 다중 서브 유니트 DNA 의존성 RNA 폴리머 라제 (RNAP) 유전자 발현시 RNAP의 활성을 조절하는 작용을하는 전사 인자의 연속을 필요로한다. 방사성 표지 성적 시퀀싱 겔 전기 영동이란 파라미터를 미치는 영향 전사 진행하여 기계적 상세한 정보를 제공하기 위해 사용된다. 본 논문에서는 필수 연장 인자는 전사 누사 일시뿐만 아니라 RNAP 완전 효소 형성의 억제를 통해 전사 개시 타겟팅 항균제를 식별하는 방법을 조절하는 방법을 연구하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 아직 불분명 남아있는 전사 인자의 작용 메커니즘뿐만 아니라 새로운 항균 카발라을 탐구하는 추가 방법의 개발을위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다TS는 항생제 연구 개발의 활용도가 낮은 약물 표적 인 전사를 대상으로.
서론
RNA 전사는 특정 DNA를 주형으로 합성되는 과정이다. 진핵 세포에서 세 가지 RNAPs있다 : RNAP 내가 rRNA의 전구체 사본을 만듭니다가, RNAP II는 mRNA의 특정 작은 핵 RNA를 합성에 대한 책임이며, 5S rRNA의와의 tRNA의 합성은 RNAP III에 의해 수행된다. 박테리아에서, RNA의 모든 클래스의 전사에 대한 책임 하나만 RNAP있다. 개시, 신장 및 종료 : 전사의 세 단계가 있습니다. 전사는 셀의 가장 높은 조정 프로세스이다. 전사주기의 각 단계는 하나의 유전자 발현의 조절에 대한 검사를 나타낸다. 개시 내용 RNAP 오픈 프로모터 복합체를 형성 촉진제 2라고 특정 사이트에 효소를 유도 할 필요가있는 완전 효소 형성 시그마 인자와 연관이있다. 그 후, 전사 인자의 넓은 스위트 룸은 규제 오에 대한 책임이 있습니다신장 및 종료 단계에서 F RNAP 활동. 여기서 조사 전사 인자는 누사 고도로 보존 필수적인 단백질이다. 이것은 rRNA의 합성 3-5 중에 전사 일시 정지 및 종료뿐만 아니라 항 - 종단 조절에 관여한다.
시험 관내에서 전사 분석은 전사 6시 복잡한 규제 단계를 연구하는 강력한 ....
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프로토콜
주의 : 실험 방사성 동위 원소 32 P의 사용을 포함하는 모든 적절한 안전 조건이 충족 될 때까지 어떤 작업이 수행되지 않을 것이다. 일반적으로 사람은 안전 코스에 참석 전에 방사성 시약을 사용하여 실험에 감독 관행을 받게해야합니다. 반응을 수행 할 때 개인 보호 장비를 착용하십시오 (열 발광 선량계, 보호 안경, 장갑, 방사선 실 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관).
분석 자료 1. 준비
- 전사 분석을위한 단백질 필요를 얻습니다.
- 여기에 설명 된 실험, 과잉 생산 및 E.을 정화 대장균 RNAP은 실험실에서 상용 소스 (자료 목록)에서 11 설명, 또는 얻을 수있다.
참고 : 모두 비슷한 결과를 제공합니다. 원시 또는 친화 표지 RNAP을 정제하는 다른 방법은 12, 13을 이용할 수있다. 시그마 / 누 인자 D로 얻을 수있다이전 작품 14, 15에 escribed.
- 여기에 설명 된 실험, 과잉 생산 및 E.을 정화 대장균 RNAP은 실험실에서 상용 소스 (자료 목록)에서 11 설명, 또는 얻을 수있다.
- 디 에틸 피로 카보네이트의 제조 (DEPC) 처리 된 물
참고 : 또는의 RNA 분해 효소가없는 물을 상업적 출처 (자재 목록)에서 얻을 수있다.- 정제 물 1 L에 ....
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결과
전사 효율이 서로 다른 시점에서 주파수 대역에 방사선의 수준을 측정함으로써 결정될 수있다. 일시 중지 분석은 일시 정지, 종료의 시각화를 사용 누사 인자의 기능을 테스트하고 실행 - 오프 제품 (그림 1A)를합니다. (누사 NTD; 아미노산 잔기 1-137) 누사의 N- 말단 도메인의 존재에있어서, RNA 제품의 외관이 크게 누사 부족한 대조 실험에 비해 늦어졌다. 아미노산의 시리즈의 알라닌으로 누사 단편 또는 변경의 아미노산 잔기 104-137 (나선 3)의 삭제 (잔기 K36, K37, R104, Q108은 K111은 Q112은 Q116 및 R119)의 전체 결과 누사 일시 중지 활동의 손실. 헬릭스 3 잔류 R104과 K111은 누사 NTD 일시 정지 활동과 R104A 및 누사 NTD가 존재했다 제어 (그림 1B)와 유사한 일시 정지 반감기 값을 제공 K111A 구조에 필수적인 것으로 나타났다. 그것은이.......
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토론
모든 생물에서 전사가 단단히 통제 프로세스이다. 전사 분석법이 전사 인자, 작은 분자의 전사 억제제의 효과를 테스트하기위한 플랫폼을 제공하기 위해 개발 된 시험 관내. 이 방법 논문에서는 일반 세균 전사에 대한 분석은 설명했다. 그들은 타임 라인을 따라 모든 전사 제품의 시각화를 허용하는 성적 증명서의 순서 겔 전기 영동과 결합 전사 분석은 기계적인 연구에 매우 중요하다. 결과적으로,이 방법은 반응 조건에서의 작은 변화의 영향을 식별 및 행동의 그럴듯한 메카니즘을 공개 할 수있다. 또한, 작용 메커니즘 알 전사 인자의 기능과 관련하여 특정 전사 분석법을 설계 가능해진다.
이 논문에서 우리는 RNAP의 holoen의 억제제의 작용 기전을 확인하는 방법을 설명효소 형성. 여기에 설명 된 방법은 시간에 각각의 RNA 전 사체의 변화를 표시 할 수 있으며, 적절한 수정과 적절한 전사의 각 단계에 대한 항균제의 테스트를 사용할 수 있습니다. 단일 라운드 분석은 경쟁 /.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 University of Newcastle(CM)의 Faculty Early Career Grant를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에 필요한 단백질 얻 | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 준비 | 시그마-알드리치 | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA 템플릿 준비 | |||
| 마법사 플러스 SV Minipreps DNA 정제 시스템 | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR 프라이머 | |||
| Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템 | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 형광분광계 | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP 준비 | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | 시그마-알드리치 | U1006 | |
| GTP | 시그마-알드리치 | G3776 | |
| CTP | 시그마-알드리치 | C9274 | |
| 고순도 rNTP | GE 헬스케어 | 27-2025-01 | |
| &알파;-32P UTP | 퍼킨엘머 | BLU007C001MC | 방사성 화합물 |
| RNA 래더 제제 | |||
| Novagen Perfect RNA 마커 템플릿 믹스 0.1– 1kb | 밀리포어 | 69003 | |
| HEPES | 시그마-알드리치 | H7006 | |
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S7653 | |
| 염화마그네슘 | 시그마-알드리치 | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| 겔 준비 | |||
| Sequi-Gen GT 핵산 시퀀싱 셀 | 바이오 라드 | 165-3804 | |
| 시그마코트 | 시그마-알드리치 | SL2 | |
| 요소 | 시그마-알드리치 | U6504 | |
| 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 | 시그마-알드리치 | ||
| 붕산 | 시그마-알드리치 | B7901 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 | 시그마-알드리치 | ED | |
| 40% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 | 시그마-알드리치 | A9926 | |
| 과황산암모늄 | 시그마-알드리치 | A3678 | |
| N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
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| 리팜피신 | 시그마-알드리치 | R3501 | |
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| 브로모페놀 블루 | 시그마-알드리치 | B0126 | |
| 크실렌 시아놀 | 시그마-알드리치 | X4126 | |
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| RNasin Ribonuclease 억제제 | Promega | N2511 | |
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| 염화칼 | 시그마-알드리치 | P9541 | |
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| 디티 | 시그마-알드리치 | DTT-RO | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
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| Whatman 3MM Chr 크로마토그래피 종이 | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
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| Typhoon Trio+ 이미저 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
참고문헌
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
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재인쇄 및 허가
