방법 논문

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

DOI:

10.3791/54257

⸱

2016년 7월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Virginia Commonwealth University, 2McGuire Veterans Affairs Medical Center, Research BC-101

이 논문에서

요약

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마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

초록

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작은 비암호화 RNA(miRNA)는 대사 증후군을 포함한 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다. 이들은 진단 및 예후를 위한 바이오마커로 활용되거나 각각 약물 개발의 표적 역할을 할 수 있습니다. 최근에는 miRNA가 지단백질, 특히 고밀도 지단백질(HDL)에서 운반되어 흡수를 위해 수용 세포에 전달되는 것으로 나타났습니다. 이는 miRNA가 유전자 발현 조절을 통해 세포 간 통신 및 장기 간 누화를 위한 메신저를 통해 세포 및 장기 기능에 중요하고 중추적인 역할을 할 가능성을 제기합니다. 정제된 HDL에서 miRNA를 분리하는 현재 방법은 작은 샘플을 대규모로 사용할 때 실용적이지 않습니다. 이는 주로 지단백질 분리에 사용되는 시간 소모적이고 힘든 방법 때문입니다. 당사는 혈장 샘플에서 miRNA 분석에 적합한 정제된 HDL을 신속하게 분리하기 위한 단순화된 접근법을 개발했습니다. 이 방법은 건강과 질병에 있는 miRNAs의 역할에 대한 조사를 촉진해야 하고, 특히 HDL에 기인하는 역 콜레스테롤 수송 외부의 다양한 생물학적 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공해야 합니다. 또한 HDL에 존재하는 miRNA 종은 다양한 질병의 진단을 위한 임상 바이오마커에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.

서론

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MicroRNAs는 고도로 보존되어 있고 특정 표적 메신저 RNA를 분해하거나 억제함으로써 다양한 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 간주되는 내인성 비암호화 작은 RNA 종입니다1. miRNA는 세포 내에서 활동하기 때문에 조직 유래 바이오마커로 연구되어 왔으며, 이는 이러한 miRNA의 조직 특이적 기능을 발견하는 데 기여했습니다. 그러나 miRNA는 단백질과 결합하거나 엑소좀/마이크로 소포(exosome/micro vesicle)와 연관되어 세포 외(extracellular RNase)에서도 발견되며, 이는 세포외 RNase에 의한 분해를 효과적으로 방지할 수 있습니다2. 보다 최근의 연구에서는 HDL의 보호 효과가 콜레스테롤 유출을 촉진하는 능력과 밀접하게 관련되어 있지 않고 오히려 비콜레스테롤 화물, 특히 순환하는 miRNA 운반체와 밀접하게 관련되어 있을 수 있음을 보여주었습니다 3, 4. 이러한 miRNA는 지질 대사를 조절할 수 있을 뿐만 아니라 HDL-miRNA 복합체의 항염증, 항산화 및 항혈전 효과와도 관련이 있습니다 5, 6.

HDL 입자에 운반되는 miRNA의 역할을 더 자세히 탐구하기 위해서는 임상 루틴에서 사용하기 위해 분리된 고도로 정제된 HDL에서 miRNA를 추출하기 위한 간단하고 쉬운 프로토콜을 수립해야 합니다. HDL을 분리하기 위한 수많은 방법이 설명되었습니다. 이러한 방법은 시간이 많이 걸리거나 많은 양의 혈장이 필요하여 시료 채취, 분리된 지단백질을 탈염하기 위한 광범위한 투석이 필요할 수 있으며, 각각 miRNA의 공급원으로서 엑소좀을 완전히 제거하지 못합니다3. 여기에서는 소량의 혈액 샘플을 대규모로 사용하여 고도로 정제된 HDL에서 miRNA를 분리할 수 있는 간단하고 신속한 방법을 설명합니다. 우리는 이 방법이 순환 miRNA의 역할, 특히 다양한 세포와 기관 간의 통신을 촉진하는 HDL의 역할에 대한 연구를 촉진하는 데 좋은 참고 자료가 될 수 있다고 믿습니다.

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프로토콜

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혈액 샘플 1. 컬렉션

  1. 전주 포사에서 눈에 띄는 정맥의 표준 정맥 천자에 의해 (다른 항응고제에 비해 몇 가지 장점이 있습니다) 항응고제 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 10 ML의 플라스틱 튜브에 말초 정맥 혈액 샘플을 금식 수집합니다.
  2. 적혈구 및 RNA 소량의 자유 혈장을 얻었다 탁상 원심 분리기로 4 ℃에서 20 분 동안 1,600 XG에서 혈액 샘플을 원심 분리기.
  3. 순차적으로 각각 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 WBC 및 혈소판 15 분 후 추가를 제거하는 10 분 동안 스윙 버킷 로터에서 3,000g (4 °에 C)에서 상층 액을 원심 분리.
  4. 제조 지시에 따라 RT에서 농도계를 이용하여 플라즈마의 밀도를 측정한다.
    주 : 농도 조정 (d = 1.023 g / ㎖) 0.9 % 식염수 용액 엑소 좀을 제거하지만, 종래 밀도 구배 초 원심 분리 후 필요하다.

    5. 플라즈마 2. 엑소 좀 제거

    1. HDL 유사한 밀도가 순환 엑소 좀을 제거하고 miRNA의 (3)의 양적 중요한 소스를 나타냅니다.
      1. 4 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 1 ml의 플라즈마에 252 ㎕의 엑소 좀 침전 솔루션을 추가하여이 작업을 수행합니다. 엑소 좀을 펠릿, 4 ℃에서 1,500g에서 30 분 동안 혼합물을 원심 분리.
      2. HDL, 밀도 구배 초 원심 분리하여 더 처리 카보네이트 두꺼운 초 원심 분리 튜브에 얻어진 상등액 전송 한 용액을 분리 (아래 참조).

    3. 밀도 구배 초 원심 분리 (그림 1).

    1. HDL은 고정 각 로터 448,811 X G에서 동작하는 8 ° C 각각과 바닥 초 원심 분리기를 사용하는 3 단계 프로세스를 사용하여 분리해서한다.
    2. 세 가지 다른 밀도 솔루션 순차적으로 각각의 분리를위한 신선한를 준비합니다.
      1. 용액 A를 준비 (VLDL의 분리 D = 1.006 g / ㎖) 11.4 g의 NaCl (염화나트륨 : 0.195 몰)을 용해하여 멸균 증류수 1,000 ㎖에 0.1 g의 EDTA2Na 1 ml의 1N NaOH를합니다. 그런 다음 멸균 증류수의 추가 3 ㎖를 추가합니다.
      2. 100 ㎖ 용액 A (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 2.44 몰)을 25.2 g의 NaBr은을 추가하여 용액 B를 준비 (LDL의 격리, D = 1.182 g / ㎖).
      3. 용액 A의 100 ㎖ (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 7.7 몰) 78.8 g의 NaBr은을 혼합하여 (D = 1.470 g / ㎖ HDL의 분리) 솔루션 C를 준비합니다. 농도계를 사용하여 실온에서 적절한 밀도를 확인합니다. 더 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 솔루션을 보관하십시오.

    VLDL 4. 분리

    1. 플라즈마 1 ㎖ (평균 밀도 = 1.023 g / ㎖) 6.5 ㎖의 폴리 카보네이트 두꺼운 벽으로 둘러싸인 초원 심 분리기 튜브에 지방 레드 7B와 뉴 클레아 무료 200 μl를 섞는다.
    2. 조심스럽게 혼합 위에 A 액 5 ㎖ 계층. 필요한 경우, 용액 A의 t의 상단에 추가로 지방 레드 7B를 추가O 각 튜브의 무게 균형. - 2 시간 (5 가속도)에 대한 원심 분리기 (감속 - 7).
      주 : 원심 동안 지단백질가 평형 농도 영역에서 대역으로 축적된다.
    3. 실행의 끝에서 2 층을 관찰합니다. 4 ° C에서 상단 층 및 저장소를 나타내는 VLDL 분획의 1.5 ml의를 제거합니다.
    4. 마지막으로, LDL을 포함하는 튜브의 바닥으로부터 피펫 전사 4 용액을 이용하여, HDL, LDL을 분리하기위한 새로운 폴리 카보네이트 튜브 알부민 및 지방산 분획.

    LDL 5. 분리

    1. 각각 LDL과 HDL 비율 (4 절)를 포함하는 튜브에 용액 B 100 ㎕를 뉴 클레아 무료 지방 레드 7B 2 ㎖를 섞는다.
    2. 그런 다음 3 시간 (가속 9, 감속 7)을 위해 밖으로 원심 분리기. 그 후, 상단 층을 나타내는 LDL 분획의 1.5 ml의 제거 및 -80 ° C에서 4 °의 C 또는 저장하시오. 마지막으로, HDL을 함유하는 튜브의 바닥에서 4 ml의 전송새로운 폴리 카보네이트 튜브 부분.

    HDL 6. 분리

    1. 이 용액 C의 용액, 100 μL 클레아없는 지방 레드 7B 및 각각 HDL 분획을 함유하는 튜브에 98 % β 메르 캅토 에탄올의 15 μl를 섞는다.
    2. 3 시간 (가속 9, 감속 7)에 대한 원심 분리기. 그 후, 상부 층을 나타내는 HDL 분획이 용액을 제거하고 -80 ℃에서 4 ℃에서 보관하거나 저장하거나.

    7. 탈염 및 지단백질 분획의 농도

    1. 이후의 아가로 오스 겔 전기 영동 및 PCR과의 간섭을 방지하기 위해, 제조업체의 지침에 의해 설명 된 바와 같이 (LDL / HDL에 대한 VLDL 및 10K 튜브에 대한 3K 관) 적절한 분자량의 컷오프와 원심 필터 장치를 사용하여 밀도 구배 초 원심 분리 동안 추가 과도한 소금을 제거합니다.
      1. 간단히, 차가운 PBS (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCL, 8 밀리미터의 Na2HPO4, 2 mM의 KH2PO4, pH를 7.4) 2.5 ml에 추가 한 후 centrifuGE 전체 VLDL 분획 수집-동안 밀도 구배 초 원심 분리 4 ° C에서의 스윙 버킷 회 전자를 사용하여 60 분 동안.
      2. 30 분마다 10 ml의 빙냉 PBS로 두 번 LDL 분획을 탈염. 다음으로, HDL 분획을 탈염 두 번 13 ml의 얼음 차가운 PBS를 사용합니다. 높은 PBS 부피는 아가 로스 겔 전기 영동으로 이동도를 개선하는 것이 필요하다. 원심 분리 후, 지질 단백질 함유 용질을 제거하고 4 ° C에서 보관 또는 -80 ° C에 저장됩니다.

    8. 아가 로스 젤 전기 영동

    1. 다음과 같이 제조업체의 지침의 약간의 수정과 함께 키트를 사용 지단백 아가로 오스 겔 전기 영동을 Perfrom.
      참고 :이 단계는 집중 지질 단백질 샘플의 품질과 순도를 평가하기 위해 단지이다.
      1. 요약하면, 밀도 구배 초 원심 분리하여 탈염 지단백질 분획 6 μl를 구해서 미리 주조 지단백질 젤 상에 로딩. 인간의 lipop를 사용하여크기 기준으로 VLDL, LDL과 HDL에 대한 rotein 표준. 담당자 준비 버퍼를 사용하여 60 분 동안 100 V에서 RT에서 전기 영동을 수행하십시오.
      2. 10 분 동안 겔을 건조하고 지방 레드 7B와 함께 RT에서 10 분 동안 염색. 5 분 동안 다시 메탄올 - 물 75:25 (v / v)의 건조 혼합물에 겔 Destain.

    9. RNA 추출 및 정제

    1. 혈청 / 플라즈마 miRNA의 분리 및 정제 키트를 사용하여 정제 된 인간의 HDL에서의 miRNA의 분리를 Perfrom.
      1. 간단히하는 vortexer를 혼합 한 후 핵 단백질 복합체 및 RNases의 불 활성화의 완전한 분리를 보장하기 위해 RT에서 5 분 동안 배양, 정제 HDL 200 μL에 RNA 용해 시약 1 ㎖를 추가합니다.
      2. (1.6 × 10 8 복사 / μL CEL-은 miR-39) 혼합물에 다음 합성 Caenorhabditis 엘레 간스 마이크로 RNA의 3.5 μl를 스파이크. 그런 다음, 제조자의 지시에 따라 RNA의 추출을 실시한다.
    2. purificati를 수행제조업체의 지침에 따라 용출 스핀 열 추출-miRNA의의에. spectrophorometer와 정제 HDL에서의 miRNA의 농도를 측정한다.
      참고 : 스핀 컬럼에서의 miRNA의 용출 된 RNase없는 물 16 μl를 고용했다.

    10. 역전사 (RT-PCR)

    1. HDL에서의 miRNA 100 NG를 분리하여 miRNA의 합성 (CEL-은 miR-39)과 역전사 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 20 ㎕의 반응 부피로 역전사 타서.
    2. 템플릿의 miRNA (NTC)없이 역전사 효소 믹스 (NRT)없이 적절한 제어를 수행합니다.

    11. 실시간 PCR (QRT-PCR)

    1. cDNA를 2 희석, 10 ㎕의 PCR 혼합물, 2 μL 유니버설 프라이머 2의 miRNA 프라이머 μL, 4 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 물 : 1 2 ㎕를 20 ㎕의 총 부피로 리얼 타임 PCR을 Perfrom.
    2. 를 Reacti을 실행15 초, 30 초 동안 55 ° C 및 30 ~ 70 ° C의 확장 단계에 94 ° C의 45주기 다음 15 분 동안 95 ° C에서 96 웰 플레이트에서의 삼중의 모든 반응을 Perfrom s.ec .
    3. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 합성 하우스 키핑 유전자에 정상화 후 2 -ΔΔ 코네티컷 방법을 사용하여 miRNA의의 Calcuate 상대적인 양.

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결과

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엑소 좀 제거 후 고밀도 지단백의 분리
고순도 HDL에서의 miRNA를 얻으려면이 miRNA의 오염 (7)의 소스를 대표하는 엑소 좀을 제거 할 필요가있다. 이것은 상업적으로 이용 가능한 키트 밀도 구배 초 원심 분리에 앞서 수행 하였다. 실용적으로 상업 회사에 의해 개발 된 3 단의 ​​표준 밀도 구배 초 원심 프로토콜 (도 1)를 변형시켰다. 이 프로토콜은 54,000 rpm으로 3, 8, 9, 10까지의 원심 분리 힘으로 일반적으로 사용되는 프로토콜보다 상당히 빠르다 140,000 rpm의 속도로 고정 각 로터로 원심 분리를 필요로한다. A의 널리 사용할 T-1270 로터를 채용 70,000 rpm으로 최대 힘 원심 분리는 처음 원심 분리 힘 레지스트 못했다 polyallomer 튜브 행했다. 튜브의 붕괴를 방지하기 위해,폴리...

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토론

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혈액에서 새로운 바이오 마커의 식별은 각종 질병의 임상 진단 및 예후에 도움이됩니다. 마이크로 RNA는 바이오 마커의 모든 자질을 가지고하는 것으로 알려져하고 다양한 연구 14-17에 표시되어있다. 이 연구에서 우리는 플라즈마 HDL에서의 miRNA를 분리하기 위해 신속하고 간단한 쉬운 방법을 증명하고있다. VLDL, LDL 및 HDL의 분리의 종래의 밀도 구배 초 원심 분리 방법은, 플라즈마의 정확한 샘플링 완충액 정밀 제조, 밀도 및 하부 지단백질 분획 8 정량적 전송 측정에 의존한다. HDL 8 -11을 분리 설명 된 여러 가지 방법이 있습니다. 이러한 방법은 종종 매우 힘든 중 하나 또는 탈염 고립 지질 단백질에 대한 플라즈마 및 광범위한 투석의 많은 양을 필요로 완전히의 miRNAs 3의 소스로 엑소 좀과 지질 단백질을 제거하지 마십시오. 이시를 설립 우리는 이러한 단점을 해결하기 위해mple 플라즈마 HDL에서의 miRNA의 분리의 빠른 ...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 보조금 R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 및 T32 DK 007150-38에 의해, 그리고 T32 DK 007150-38에 의해 전체 또는 부분적으로 지원되었습니다. 이것은 독창적인 작품이며 다른 곳에서 출판을 고려하고 있지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플라스틱 Vacutainer 라벤더 K2EDTA 튜브 Becton, Dickinson and Company366643
원심분리기Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R 
75004261 Densito 30PX 농도계Mettler ToledoMT51324450
ExoQuick 솔루션 Invitrogen4484451
폴리카보네이트 두꺼운 벽의 초원심분리기 튜브Thermo ScientificO3237
Sorvall WX100 초원심분리기 써모 사이언티픽46902
팻 레드 7B 시그마-알드리치201618
&베타;-메르캅토에탄올 Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치 10KMilliporeUFC901008
Amicon 초원심 필터 장치 3KMilliporeUFC800308
QuickGel Lipo 키트 헬레나 연구소 3344,3544T
VLDL, LDL 및 HDL LipoTrol에 대한 인간 지단백질 표준물; Helena Laboratories5069
Rep Prep 버퍼 헬레나 연구소 3100
RNeasy MinElute 스핀 컬럼 Qiagen
NanoDrop 1000 분석기Thermo Scientific
miScript II RT 키트 Qiagen218161
CFX96 Touch 실시간 PCR 검출 시스템BioRad
miRNeasy 혈청/혈장 키트QIAGEN217184
miScript Primer AssaysQIAGEN141078139
miScript SYBR Green PCR Kit QIAGEN218073
miRNeasy 혈청/혈장 스파이크인 제어QIAGEN219610
NaOH시그마-알드리치
480878 0.20 µ M 멸균 주사기 필터SIGMA-ALDRICHZ227536

참고문헌

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  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
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  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
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  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
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  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

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