Method Article

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

DOI:

10.3791/54257

⸱

July 27th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Virginia Commonwealth University, 2McGuire Veterans Affairs Medical Center, Research BC-101

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

Abstract

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작은 비암호화 RNA(miRNA)는 대사 증후군을 포함한 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다. 이들은 진단 및 예후를 위한 바이오마커로 활용되거나 각각 약물 개발의 표적 역할을 할 수 있습니다. 최근에는 miRNA가 지단백질, 특히 고밀도 지단백질(HDL)에서 운반되어 흡수를 위해 수용 세포에 전달되는 것으로 나타났습니다. 이는 miRNA가 유전자 발현 조절을 통해 세포 간 통신 및 장기 간 누화를 위한 메신저를 통해 세포 및 장기 기능에 중요하고 중추적인 역할을 할 가능성을 제기합니다. 정제된 HDL에서 miRNA를 분리하는 현재 방법은 작은 샘플을 대규모로 사용할 때 실용적이지 않습니다. 이는 주로 지단백질 분리에 사용되는 시간 소모적이고 힘든 방법 때문입니다. 당사는 혈장 샘플에서 miRNA 분석에 적합한 정제된 HDL을 신속하게 분리하기 위한 단순화된 접근법을 개발했습니다. 이 방법은 건강과 질병에 있는 miRNAs의 역할에 대한 조사를 촉진해야 하고, 특히 HDL에 기인하는 역 콜레스테롤 수송 외부의 다양한 생물학적 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공해야 합니다. 또한 HDL에 존재하는 miRNA 종은 다양한 질병의 진단을 위한 임상 바이오마커에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.

Introduction

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MicroRNAs는 고도로 보존되어 있고 특정 표적 메신저 RNA를 분해하거나 억제함으로써 다양한 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 간주되는 내인성 비암호화 작은 RNA 종입니다1. miRNA는 세포 내에서 활동하기 때문에 조직 유래 바이오마커로 연구되어 왔으며, 이는 이러한 miRNA의 조직 특이적 기능을 발견하는 데 기여했습니다. 그러나 miRNA는 단백질과 결합하거나 엑소좀/마이크로 소포(exosome/micro vesicle)와 연관되어 세포 외(extracellular RNase)에서도 발견되며, 이는 세포외 RNase에 의한 분해를 효과적으로 방지할 수 있습니다2. 보다 최근의 연구에서는 HDL의 보호 효과가 콜레스테롤 유출을 촉진하는 능력과 밀접하게 관련되어 있지 않고 오히려 비콜레스테롤 화물, 특히 순환하는 miRNA 운반체와 밀접하게 관련되어 있을 수 있음을 보여주었습니다 3, 4. 이러한 miRNA는 지질 대사를 조절할 수 있을 뿐만 아니라 HDL-miRNA 복합체의 항염증, 항산화 및 항혈전 효과와도 관련이 있습니다 5, 6.

HDL 입자에 운반되는 miRNA의 역할을 더 자세히 탐구하기 위해서는 임상 루틴에서 사용하기 위해....

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Protocol

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혈액 샘플 1. 컬렉션

  1. 전주 포사에서 눈에 띄는 정맥의 표준 정맥 천자에 의해 (다른 항응고제에 비해 몇 가지 장점이 있습니다) 항응고제 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 10 ML의 플라스틱 튜브에 말초 정맥 혈액 샘플을 금식 수집합니다.
  2. 적혈구 및 RNA 소량의 자유 혈장을 얻었다 탁상 원심 분리기로 4 ℃에서 20 분 동안 1,600 XG에서 혈액 샘플을 원심 분리기.
  3. 순차적으로 각각 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 WBC 및 혈소판 15 분 후 추가를 제거하는 10 분 동안 스윙 버킷 로터에서 3,000g (4 °에 C)에서 상층 액을 원심 분리.
  4. 제조 지시에 따라 RT에서 농도계를 이용하여 플라즈마의 밀도를 측정한다.
    주 : 농도 조정 (d = 1.023 g / ㎖) 0.9 % 식염수 용액 엑소 좀을 제거하지만, 종래 밀도 구배 초 원심 분리 후 필요하다.

    5. 플라즈마 2. 엑소 좀 제거

    1. HDL 유사한 밀도가 순환 엑소 좀을 제거하고 miRNA의 (3)의 양적 중요한 소스를 나타냅니다.
      1. 4 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 1 ml의 플라즈마에 252 ㎕의....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

엑소 좀 제거 후 고밀도 지단백의 분리
고순도 HDL에서의 miRNA를 얻으려면이 miRNA의 오염 (7)의 소스를 대표하는 엑소 좀을 제거 할 필요가있다. 이것은 상업적으로 이용 가능한 키트 밀도 구배 초 원심 분리에 앞서 수행 하였다. 실용적으로 상업 회사에 의해 개발 된 3 단의 ​​표준 밀도 구배 초 원심 프로토콜 (도 1)를 변형시켰다. 이 프로토콜은 54,000 rpm으로 3, 8, 9, 10까지의 원심 분리 힘으로 일반적으로 사용되는 프로토콜보다 상당히 빠르다 140,000 rpm의 속도로 고정 각 로터로 원심 분리를 필요로한다. A의 널리 사용할 T-1270 로터를 채용 70,000 rpm으로 최대 힘 원심 분리는 처음 원심 분리 힘 레지스트 못했다 polyallomer 튜브 행했다. 튜브의 붕괴를 방지하기 위해,폴리.......

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Discussion

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혈액에서 새로운 바이오 마커의 식별은 각종 질병의 임상 진단 및 예후에 도움이됩니다. 마이크로 RNA는 바이오 마커의 모든 자질을 가지고하는 것으로 알려져하고 다양한 연구 14-17에 표시되어있다. 이 연구에서 우리는 플라즈마 HDL에서의 miRNA를 분리하기 위해 신속하고 간단한 쉬운 방법을 증명하고있다. VLDL, LDL 및 HDL의 분리의 종래의 밀도 구배 초 원심 분리 방법은, 플라즈마의 정확한 샘플링 완충액 정밀 제조, 밀도 및 하부 지단백질 분획 8 정량적 전송 측정에 의존한다. HDL 8 -11을 분리 설명 된 여러 가지 방법이 있습니다. 이러한 방법은 종종 매우 힘든 중 하나 또는 탈염 고립 지질 단백질에 대한 플라즈마 및 광범위한 투석의 많은 양을 필요로 완전히의 miRNAs 3의 소스로 엑소 좀과 지질 단백질을 제거하지 마십시오. 이시를 설립 우리는 이러한 단점을 해결하기 위해mple 플라즈마 HDL에서의 miRNA의 분리의 빠른 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 보조금 R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 및 T32 DK 007150-38에 의해, 그리고 T32 DK 007150-38에 의해 전체 또는 부분적으로 지원되었습니다. 이것은 독창적인 작품이며 다른 곳에서 출판을 고려하고 있지 않습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
플라스틱 Vacutainer 라벤더 K2EDTA 튜브 Becton, Dickinson and Company366643
원심분리기Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R 
75004261 Densito 30PX 농도계Mettler ToledoMT51324450
ExoQuick 솔루션 Invitrogen4484451
폴리카보네이트 두꺼운 벽의 초원심분리기 튜브Thermo ScientificO3237
Sorvall WX100 초원심분리기 써모 사이언티픽46902
팻 레드 7B 시그마-알드리치201618
&베타;-메르캅토에탄올 Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치 10KMilliporeUFC901008
Amicon 초원심 필터 장치 3KMilliporeUFC800308
QuickGel Lipo 키트 헬레나 연구소 3344,3544T
VLDL, LDL 및 HDL LipoTrol에 대한 인간 지단백질 표준물; Helena Laboratories5069
Rep Prep 버퍼 헬레나 연구소 3100
RNeasy MinElute 스핀 컬럼 Qiagen
NanoDrop 1000 분석기Thermo Scientific
miScript II RT 키트 Qiagen218161
CFX96 Touch 실시간 PCR 검출 시스템BioRad
miRNeasy 혈청/혈장 키트QIAGEN217184
miScript Primer AssaysQIAGEN141078139
miScript SYBR Green PCR Kit QIAGEN218073
miRNeasy 혈청/혈장 스파이크인 제어QIAGEN219610
NaOH시그마-알드리치
480878 0.20 µ M 멸균 주사기 필터SIGMA-ALDRICHZ227536

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. <....

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HDL IsolationmiRNA AnalysisDensity Gradient UltracentrifugationExosome PrecipitationLipoprotein PurificationDesalting ProcedureAgarose Gel ElectrophoresisReal time PCRHDL FractionPlasma Samples

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