소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

게놈 채굴 기술은 최근 몇 년 동안 빠르게 발전했으며, 재조합 효소를 복제하고 발현하기 위한 중간 및 높은 처리량 전략도 발전했습니다. 또한, 생물정보자원과 (^CAZy)1,2와 같은 관련 보관소가 크게 확장되었습니다. 그러나 산업적 목적을 위한 미생물 효소 다양성의 개발에는 상당한 문제가 내재되어 있으며 효소 활성의 경험적 결정은 이제 심각한 병목 현상이 되었습니다. 예를 들어, 현재의 방법을 사용하면 CAZy 데이터베이스 내에서 단백질의 4% 이하의 활성을 안전하게 예측할 수 있는 것으로 추정됩니다. 효소 활성을 모니터링하기 위해 사용할 수 있는 방법은 많지만 모두 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 질량 분석법과 결합된 크로마토그래피를 기반으로 하는 잘 정립된 기술은 글리코실 가수분해효소(GH) 활성의 올리고머 단편을 평가하는 데 사용할 수 있습니다^3,4. 그러나 이러한 접근 방식은 노동 집약적이며 일반적으로 처리량이 적습니다. 디니트로살리실산⁵ 및 Nelson-Somogyi⁶ 분석법과 같은 환원당 측정에 기반한 방법은 GH 활성을 평가하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 이러한 분석은 처리량이 제한되어 있으며 부반응이 발생하기 쉽습니다. AZCL(azurine cross-linked)과 같은 개별 발색 다당류 기질은 효소 활성을 측정하는 데 널리 사용되지만, 모든 기질을 개별적으로 구매하고 분석 플레이트 내에서 기질 분말을 수동으로 분배하는 것은 번거롭고 비용이 많이 들 수 있습니다⁷.

당사는 클로로트리아진 염료를 기반으로 하는 차세대 발색 폴리머 하이드로겔(CPH) 기질을 개발했으며, 이 기질은 96웰 필터 플레이트와 함께 사용할 때 고처리량 분석 시스템을 형성합니다. 리그노셀룰로오스 바이오매스에 존재하는 것과 같은 복잡한 고분자 혼합물 내의 기질 가용성에 대한 정보를 제공하는 추가 불용성 발색 바이오매스(ICB) 기질이 개발되었습니다. 각 기판은 4가지 색상 중 하나로 생산할 수 있으며 서로 다른 색상의 기판을 단일 웰에 결합할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이 방법론이 다양한 다당류 및 단백질에 적용될 수 있으며 GH, 용해성 다당류 모노옥시게나제(LPMO) 및 프로테아제를 스크리닝할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 96웰 플레이트의 사용을 위한 구체적인 프로토콜이 제공되며, 대표적인 결과는 효소 스크리닝을 위한 도구로서 CPH 및 ICB 기질 키트의 높은 효율성을 보여줍니다.

기질에 관계없이 설명된 분석 키트의 중요한 장점 중 하나는 활성화 단계 후 15분 이내에 키트를 사용할 준비가 된다는 것입니다. 이것은 일부 다른 방법의 경우와 같이 원료 기질 재료로부터 분석법의 시간 소모적인 조립의 필요성을 제거합니다⁷. CPH 및 ICB 기질은 우수한 보관(실온에서 최소 1년), pH 및 온도 안정성⁸을 가지며 특수 장비나 교육이 필요하지 않습니다. CPH 또는 ICB 분석은 효소와의 반응이 수행되는 96웰 필터 플레이트를 기반으로 합니다. 효소가 주어진 기질에서 활성인 경우, 용해성 염색된 올리고머가 생성되어 착색된 상층액을 생성한 다음 진공 매니폴드 또는 원심분리기 ⁸을 사용하여 일반 투명 웰 96웰 플레이트로 여과할 수 있습니다.

기질은 가시 스펙트럼(VIS) 범위에서 흡수하는 클로로트리아진 염료로 염색되며, 서로 다른 색상의 서로 다른 CPH 기질이 단일 웰에 혼합되고 효소가 둘 이상의 기질에 작용하는 경우 선형 회귀를 사용하여 개별 색상(빨간색, 파란색, 노란색 및 녹색)을 분해할 수 있습니다. 상등액이 포함된 결과 플레이트는 VIS 범위에서 흡광도를 측정할 수 있는 표준 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 측정할 수 있습니다. 하나의 웰에서 서로 다른 색상의 서로 다른 기질을 혼합하면 분석 시스템의 처리량이 증가하여 96웰 플레이트에서 총 384개의 실험이 가능합니다(웰당 서로 다른 색상의 4개의 다른 기질).

CPH 기질은 효소의 특정 활성을 평가하기 위한 유용한 도구를 제공하는 반면, ICB 기질은 효소가 바이오매스 내에서 일반적으로 만나는 복잡한 기질 혼합물의 맥락에서 구성 요소를 소화하는 효소의 능력을 평가하는 데 사용됩니다. ICB 기질은 개별 효소 특이성에 대한 정보를 제공하지는 않지만, 그럼에도 불구하고 효소, 칵테일 또는 육수의 상업적 성능을 평가하는 데 유용한 도구입니다.

96 웰 플레이트 형식의 CPH 기판 1. 원체 분석

1. 상기 분석 키트 판의 활성화
   1. 교반없이 실온에서 10 분간 배양 한 다음, 각 웰에 (키트로 얻음) 200 ㎕를 활성화 용액을 첨가하여 분석 키트 플레이트 (자재 목록) (블루 CPH-자일란 함유)을 96 - 웰 필터 활성화.
   2. 현존 활성 용액을 제거 (내부 스페이서 블록 표준, 포집 판 투명한 96 웰 플레이트)을 진공 매니 폴드를 사용하여 진공을 적용한다. 대신 진공 다기관이 단계에서 10 분 동안 2700 × g으로 원심 분리에 사용하는 것도 가능하다.
   3. 100 ㎕의 멸균 수를 추가하여 CPH 기판을 세척하고 안정을 제거하기 위해 진공 (또는 원심력)을 적용한다. 이 단계를 두 번 더 반복 판은 이제 사용할 준비가 된 것입니다.
2. 효소 반응
   참고 : 항상 버퍼 포함혼자 음성 대조군과 같은 긍정적 인 컨트롤 가능한 이전에 특징 효소 경우. 복제의 통계적 해당 번호를 사용합니다. CPH 기판은 10.0의 pH 3.0, 180 μL를 초과하지 않아야 각 웰 퍼 단부 효소 용액 전량 사이에 안정하다. 식물 추출물 또는 배양액 대신 정제 된 효소 용액을 사용할 수있다.
   1. 150 ㎕의 100 mM 아세트산 나트륨 완충제, pH가 4.5 분석 키트 플레이트의 각 웰 (1 U / ㎖의 최종 농도) 5 μL 엔도 -cellulase 용액을 첨가.
   2. 동안 진탕 반응 판의 잠재적 누출을 수집 분석 키트 플레이트 아래의 제품 판 (미세 적정 플레이트 판독기와 호환 분명 웰 플레이트)을 넣어.
   3. 150 rpm에서 수평 진탕 기에서 30 분 동안 25 ° C에서 분석 키트 플레이트를 인큐베이션.
      참고 : 배양하는 동안 분석 키트 판의 반응을 혼합 일관성과 생식을 달성하기위한 중요하다ducible 결과. CPH 기판을 90 ℃로까지 안정하다. CPH 기판과 알 효소 농도를 함유하는 배양 브로스를 테스트 할 때 배양 시간은 24 시간까지 증가한다. 적합한 배양 시간은 효소 (들)의 활성에 의존 유의하지만, 24 시간 내에 탐지 활동이 없으면 일반적으로는, 효소는 테스트 기판을 저하하지 않을 가능성이있다. 활성 효소는 색깔 뜨는로 볼 수 있습니다 수용성 발색 올리고당,로 CPH 기판의 불용성 발색 다당류를 분해한다.
   4. 내부 스페이서 블록 진공 매니 폴드 내부의 청소 제품 판을 놓습니다.
   5. 상단의 분석 키트 판을 놓고 진공 (-60 kPa의 최대 음압)을 적용합니다. 또한 10 분 동안 2700 × g으로 원심 분리에 사용하는 것도 가능하다.
      참고 : 반응 생성물과 색 올리고당을 함유 한 여과 액은 추가 분석 ^(8)의 제품 판에 지금
3. 탐지 및 정량화
   1. 제품 판의 각각의 웰 내의 액체의 체적은 약 육안으로 동일 함을 확인한다.
   2. 플레이트 판독기를 사용하여 블루 CPH-크 실란에 대한 595 nm에서 수집 판의 흡광도를 참조하십시오.
   3. 데이터 분석을 수행하는 경우, 효소를 첨가 한 웰의 값으로부터 상기 버퍼 전용 대조군 값을 뺀다. 복제 웰 ^{(8)로부터의} 평균값과 (SEM) 수단의 표준 오차를 계산한다.

96 웰 형식의 ICB 기판 2. 원체 분석

1. 효소 반응
   1. 150 ㎕의 100 mM 아세트산 나트륨 완충제, pH가 4.5 및 5를 첨가 μL 31 U / ㎖의 엔도 -xylanase (웰에서 최종 효소 농도 1 U / ㎖) 레드 ICB-밀짚을 포함하는 분석 키트 플레이트의 각 웰에 용액 .
      참고 : 분석 키트 판 (96 웰 필터 (PL)문헌에 기술 된 바와 같이 ICB 기판을 포함 ATES)는 (재료의 목록 참조)에서 제조 한 것입니다. ICB 기판은 pH가 3.0 내지 10.0의 pH 범위를 갖는 완충제에서 안정하다. 항상, 음성 대조군으로 단독 버퍼 양성 대조군으로 상업 효소와 복제본의 통계적으로 적절한 번호를 사용할 수 있습니다.
      1. CPH 기판 플레이트와 같은 ICB 기판을 활성화하지만, 진공 여과 또는 원심 분리 한 다음 100 ㎕를 물로 3 회 세척하여 고정 장치를 제거하지 마십시오.
   2. 진탕 도중 기판 플레이트에서 잠재적 누출을 수집하기 위해 기판 ​​플레이트 아래에 제품 판을 넣는다.
   3. 2 시간 동안 150 rpm으로 흔들면서 25 ℃에서 반응물을 인큐베이션.
      참고 : 활성 효소는 색깔 뜨는로 볼 수 있습니다 수용성 올리고 사카 라이드,로 ICB 기판에 불용성 발색 다당류를 분해한다. ICB 기판은 90 ° C까지 안정하다. 배양 t이러한 배양 브로스 비 정제 된 효소를 사용하는 경우, IME는 24 시간까지 증가한다.
   4. 내부 스페이서 블록 진공 매니 폴드 내부의 제품 판을 놓습니다.
   5. 상단의 분석 키트 판을 놓고 진공 (-60 kPa의 최대 음압)을 적용하거나 제품 판의 우물에 분석 키트 판에서 제품을 여액에 원심 분리기를 사용합니다.
      참고 : 반응 생성물과 색 올리고당을 함유 한 여과 액은 추가 분석 ⁸ 수집 판에 지금있다.
2. 탐지 및 정량화
   1. 수집 플레이트의 각 웰 내의 액체의 체적은 약 육안으로 동일 함을 확인한다.
   2. 플레이트 판독기를 사용하여 붉은 ICB-밀 짚에 대한 517 nm에서 수집 판의 흡광도를 참조하십시오.
   3. 데이터 분석을 수행 할 때 - 버퍼를 빼기 - 부정적인 제어 값을 우물의 값 어디에서 효소첨가 하였다. 복제 웰 ^{(8)로부터의} 평균값과 (SEM) 수단의 표준 오차를 계산한다.
      주 : 알 효소 스크리닝의 경우에, 우리는 효소의 활성의 동적 범위에 대한 상세한 데이터를 획득하기 위해 일련의 희석을 제안한다.

높은 처리량이 분석의 다중 용량은 96- 웰 필터 플레이트를 배치 발색 불용성 중합체 (또는 단백질) 겔 (CPH) 기판들에 기초한다. 효소뿐만 아니라 음성 대조군은 분석 키트 플레이트 (도 1a)에 첨가하고, 효소는 착색 된 상등액 (도 1b)를 제조 해당 기판을 저하. 반응이 종료 된 후, 상청액을 투명한 제품 웰 플레이트로 이송하고, 흡광도를 96 웰 플레이트 (도 1C)에 적합한 분광 광도계를 사용하여 직접적으로 측정 될 수있다.

효소의 상이한 농도에서 자일라나에 CPH-아라비 복용량 응답의 예 (0.00-0.75 U / ml)을 감소 효소 농도를 시각적으로 관찰 할 수있는 위치도 1d에 도시되어있다. 보다 상세한 분광 정량적형 치수 효소 농도 (도 1E) 대 흡광도을 플롯 할 수있다. 신호 강도는 효소 활성에 대응한다. 분석의 재현성 오차 막대으로 나타낸다 (평균의 표준 오차, SEM 세 복제본). 이 분석의 재현성에 대한 자세한 실험은 다른 곳에서 8 게시됩니다.

CPH-아라비. A)를 CPH 기판 (로 분석 키트 판하는 방식의도 1 크 실라 아제 처리 예 CPH-아라비 단지 효소 1 및 2 버퍼를 첨가하기 전에 96- 웰 필터 플레이트의 웰에로드) - 단지 제어 (효소 1 엔도 -xylanase 활동을했다); C) 진공 보조 filtrat시, 효소 1로 CPH-아라비의 B) 저하는 색깔의 상층 액을 생산제품 판에서의 상등액의 이온은 흡광도를 분광 광도계로 측정하고, D) 제품 판을 100 밀리미터의 엔도 -β-1,4- 크 실라 아제의 상이한 농도의 4 가지 색상 CPH-아라비 치료 후 반응 생성물을 포함 아세트산 나트륨 완충액, pH가 4.5을 실온에서 60 분간;. E) 측정법을 사용하는 D로부터의 반응 생성물의 정량 이 도면의 확대를 보려면 여기를 클릭하세요.

효소 검사에서이 분석을 사용하기위한 다른 옵션이 있습니다. 하나의 옵션은 예를 스크리닝하는 다른 다당류, 알 활성 (정제) 엔도 -enzymes 소수를 포함하는 96 웰 플레이트를 사용하는 것이다. 이 경우 결과 degrad있는 다당류 보여줄 것이다대상 효소에 의해 수 있습니다. 이 원리를 표시하기 위해, 엔도 -cellulase는 25 ° C에서 다른 CPH 기판에 대해 시험 하였다. (1.0 U / ㎖, 5 U / ㎖ 0.5 U / ㎖) 세 가지 효소 농도를 30 분 동안 배양 하였다. 그 결과, 제품 판 (도 2A)에서 명확하게 볼 수있다. 공급 업체에서 제공 -cellulase이 엔도의 제품 시트는 크 실로 글루칸 (타마 린드)에 대한 측면 활동, 보리 β 글루칸, 글루코만난, 버치 우드 자일란과 갈 락토 만난 낮은 쪽 활동을 지정합니다. 이과 일치, 셀룰라아제에 추가 활동이 CPH-β 글루칸 (보리)에 발견 된, CPH-크 실로 글루칸 (타마 린드) CPH-갈 락토 만난 (그림 2B)에 대한, CPH-크 실란 (비치 우드)과 낮은 활동. 글루코만난은 테스트되지 않았습니다. 이전보다 동일한 조건에서 양성 대조군으로 사용했을 때와 동일한 CPH 기판 상용 가능한 효소 (0.5 U / ㎖ 1.0 U / ㎖ 0.1 U / ㎖, 세 가지 효소의 농도)로 소화했다실험. 모든 기판은 양성 대조군의 효소에 의해 분해하고, 신호 강도가 높은 효소 농도 (도 2c)에 대응하여 증가 하였다.

도 2 8 개의 CPH 기판은 상이한 농도에서 30 분. A) 엔도 -cellulase로 분해 다른 CPH 기판 제품 판에 대해 25 ℃에서 교반하면서 배양 하였다. B) 활성 및 다양한 측면 활성의 정량 엔도 -cellulase. . E-LAMSE과 CPH-pachyman, CPH-카드 란, CPH-, 에러 바는 세 개의 복제본 C) 해당 CPH 기판 (엔도 셀룰라아제 및 2-HE-셀룰로오스에 다른 상업 효소의 ​​활동의 평균의 표준 오차를 나타냅니다 β 글루칸 (보리), E-XYAN4과 CPH-크 실란, E-XEGP 및 CPH-크 실로 글루칸, E-BLAAM과 CPH-아밀로스, E-BMACJ과 CPH-갈 락토 만난; Megazyme 모든 효소). 오류 막대는 두 개의 복제본의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그들은 부분적으로 바이오 매스의 주성분이다 식물 세포벽 다당류의 자연적인 정렬을 유지하기 때문에 불용성 발색 매스 (ICB) 기질 발색 기질 레퍼토리 유용한 부가된다. CPH 및 ICB 기판은 액체 배지에서 배양 할 때 Phanerochaete의 chrysosporium의 분비 효소를 분석하는 예제에 사용됩니다. 상기 분석 키트 판의 판 셋업 19 CPH 기판 5 ICB 기판 (각 기판도 3b 4 웰)와 함께,도 3a에 도시되어있다. P. chrysosporium는 cultivat했다사흘 에드 후 배양 상등액을 분석 하였다. 따라서, 125 ㎕의 200 mM의 버퍼를 각 웰에 25 ㎕의 배양 상청액에 첨가 옮겼다. 세 가지 다른 pH 조건 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.0 인산 나트륨 완충액 pH 6.0의 pH 8.0 (도 3C)를 이용하여 테스트되었다. 플레이트를 2 시간 동안 25 ℃ (150 RPM)를 진탕 배양 하였다.

반응 생성물은 제품 판 (도 3D)로 전송하고 분석 하였다. P. chrysosporium 다양한 글루칸, 전분 및 크 실란 (그림 3E)의 분해 효소를 생산했다. 낮은 신호는 헤미셀룰로오스의 아라 (사탕무)와 펙트 갈 락탄뿐만 아니라 RGI (대두) 검출 될 수있다. 생성 된 효소는 중성 또는 약간 기본 조건 (PH 8.0)보다 산성 조건 (pH를 4.0)에보다 적극적이었다. ICB 기판으로 낮은 활동 (그림 3 층)다당류는 자연스러운 상황에있는 경우,이 효소의 효율 순수한 다당류와 같이 동일하지 않은 것을 증명하고는 원료 또는 예비인가 된 경우 ICB 기질이 효소의 효율보다 현실적인 관점을 설명하는 이유는 처리 된 식물 재료.

19 CPH 5 ICB 기판. A) 각각의 기판 (4) 웰과 플레이트 설치하는 방식을 포함하는 다중 기판 플레이트를 사용 Phanerochaete의 chrysosporium의 3 일된 배양액에서 배양 상등액도 3 상영 (회색 배경 = CPH 기판 오렌지 배경 = ICB 기판). B) 기판. C를 함유하는 분석 플레이트의 그림) 방식 (즉, 실험에 사용되는 버퍼 상태를 도시200 mM의 아세트산 나트륨의 pH 4.0 인산 나트륨의 pH 6.0 인산 나트륨 pH를 8.0). D) 25 ° C. E) 흡광도에서 2 시간 후에 제품 판의 사진은 517 nm에서 검출 된 각 개별 CPH 기판 및 F에 대한 작도 각각의 효소) ICB 기판 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

발색 기질은 하나의 효소를 사용하거나 효소 칵테일 한 웰에 다른 컬러 CPH 기판의 혼합물을 사용하여 처리 한 후, 반응 상층 액을 분석함으로써 시너지 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다.

도 4에 도시 된 다음의 예에서, 적색 CPH 셀룰로오스 노란색 CPH-자일란 기질은 대략 EQU 함께 혼합 하였다96 웰 필터 판 웰의 알 비.도 4a없이 효소 (대조군), 셀룰로오스 CEL (2 U / ㎖), 크 실라 아제의 xyl (1 U / ㎖)와 실온에서 1 시간 처리 한 후, 착색 반응 생성물을 나타낸다 두 효소의 혼합물을 100 mM 아세트산 나트륨 완충제의 pH를 4.5 (3 각 접근 복제). 분석을 위해, 반응 생성물을 700 nm의 (도 4B)으로 350 nm 내지 흡광도 스펙트럼을 스캐닝하여 분광 광도계로 정량 하였다. 종종 단독 육안 다른 염료에 따른 흡수 스펙트럼은 각각의 열화의 정도를보다 정확하게 표시 수득 단순 회귀 분석 (8)을 사용하여 해결 될 수 있지만 기록 효소가 하나 또는 여러 개의 기판에 작용되는지 여부의 표시를 제공 할 수 있습니다 혼합물로부터 기판.

실질적 혼합물로서 CPH 기판을 사용하여 SCR있게 분석의 처리량에 추가하나의 실험 (잘 하나)에서 최대 4 개의 기판에 대해 eening. 도시 된 예에서 사용되는 네 가지 기질은 다음과 같습니다 푸른 CPH-β 글루칸 (보리), 노란색 CPH-크 실란 (비치 우드), 녹색 CPH-아밀로오스와 붉은 CPH-펙트 갈 락탄 (루팡). 기판 플레이트의 구성은도 4c 및도 4d의 분석 플레이트의 사진에 나타낸다. 반응물을 25 ℃에서 150 rpm으로 30 분 동안 100 mM의 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.5에서 수행 하였다. 제품 판에서 예상대로 증가 효소 농도 최초의 단일 효소가 해당 CPH 기판 (그림 4E)와 색깔의 상층 액을 시험했다가 수신 (그림 4 층, 행 1A - 12D). 행 E가 포함 된 CPH-크 실란과 파란색 CPH-β 글루칸, 엔도 -xylanase와 엔도 글루 카나 아제 해당 효소의 서로 다른 비율로 저하 된 두 개의 서로 다른 CPH 기판 노란색. 반응 종료 후, 결과는 visib제작 제품 판에 : 반응 생성물의 색이 짙은 녹색, 청색,보다 엔도 글루 카나 아제가 존재할 때 (도 4F, 4E-6E)이었다 (엔도 -xylanase 농도가 증가하면 밝은 연두색으로 바뀌 그림 4 층, 10-12E). 동일한 두 개의 기판 빨간 CPH-펙트 갈 락탄과 노란색 CPH-크 실란은 엔도 -galactanase와 엔도 -xylanase으로 저하 된 행 F에서 볼 수있다. 네 개의 다른 컬러 CPH 기판 본 (도 4F는 1G-12F) 및 단일 효소 적절한 CPH 기판을 분해 및 추가 첨가하여, 착색 반응 생성물의 조합을 수신 한 효소였다.

도 4 가지 효소로 처리 한 두 개의 다른 CPH 기판의 조합, 적색 CPH 셀룰로오스 노란색 CPH-자일란. 에이)이 엔도 -cellulase (CEL와 기판) 또는 엔도 -xylanase (xyl) 또는 둘 모두 효소. B) 반응 상등액의 흡광도 스펙트럼의 치료 후 반응 상층 액. 각기 다른 효소로 처리 네 가지 CPH 기판 조합 CPH 기판을 포함하는 기판 플레이트의 C) 방식 :. 블루 CPH-β 글루칸 (보리), 옐로우 CPH-자일란 (비치 우드), 녹 CPH-아밀로스 및 빨강 CPH- 펙트 갈 락탄 (피나) 다른 CPH 기판을 함유하는 분석 플레이트의 D) 사진 추가 효소의 비를 나타내는 제품 판의 E) 방식 (공칭 농도 (NC).. GLU = 1 U / ㎖의 엔도 글루 카나 아제, = 1 U / ㎖의 엔도 -xylanase, 에이미 = 5 U / ㎖의 엔도 아밀라제와 여자 = 0.5 U / ㎖의 엔도 -galactanase)을 xyl. 제품 판의 F) 사진을 30 분 배양 한 후 25 ° C에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1. 사용할 수 원체 고분자 하이드로 겔 (CPH)와 불용성 원체 바이오 매스 (ICB) 기판의 목록입니다.

96 웰 플레이트 CPH 기판 분석과 96 웰 ICB 기판 분석 (WO2015036000, 덴마크 PA 2015 70311)를 포함하는 출원이 특허 출원이 있습니다.