여기서는 밀 배아 기반 체외 번역 시스템에서 합성된 YFP 태그 Gag와 전기 형성 기술로 준비된 GUV를 사용하여 HIV-1 Gag와 지질막 간의 상호 작용을 시각적으로 분석하는 시험관 외 막 결합 분석을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
HIV-1의 구조 단백질 Pr55 개그 (또는 개그)는 바이러스 조립 과정에서 세포의 세포막에 결합한다. 개그 결합 막은 바이러스 입자 생산에 심각한 손상 개그 막 결합 결과 결함 사람 바이러스 입자 형성을위한 필수 단계이다. 개그 지질 막 상호 작용 기전 상세을 얻기 위해, 시험 관내 방법은 NMR, 단백질 배출량 측정, 표면 플라즈몬 공명, 리포솜 부유 원심 분리 또는 형광 지질 비드에 기초하여 지금까지 개발 된 바인딩. 그러나, 이러한 시험 관내 방법은 각각의 한계를 갖는다. 이러한 한계들을 극복하고 이전에 설정된 방법에 보완적인 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 HIV-1 개그 지질 세포막 사이의 상호 작용은 "셀 같은"환경에서 개최되는 시험 관내 (in vitro) 분석을 개발했다. 이 분석에서, 개그 지질막 결합 시각적 YFP-tagge를 사용하여 분석D 개그 밀 합성 관내 번역 시스템 및 전기 주조 기술에 의해 제조 GUVs에서 세균 계. 여기에서 우리는 배경을 설명하고 프로토콜 분석에 필요한 myristoylated 전체 길이 개그 단백질과 GUV 막을 얻고 현미경으로 결합 개그-GUV를 검색 할 수 있습니다.
서론
인간 면역 결핍 바이러스 타입 1 (HIV-1) 대부분의 세포 유형에에서 조립 및 플라즈마 막 (PM)에서 싹 포락선 바이러스입니다. HIV-1 바이러스 입자의 어셈블리가 Pr55 개그 (개그)라고하는 55 kDa의 바이러스 코어 단백질에 의해 구동된다. 개그는 네 개의 주요 구조 영역, 즉 매트릭스, 캡시드, 뉴 클레오 캡시드 및 P6뿐만 아니라, 두 개의 스페이서 펩티드 SP1 및 SP2로 이루어지는 전구체 폴리 단백질로서 합성된다. 조립시, 매트릭스 (MA) 도메인 어셈블리 사이트 개그 타겟팅 할 책임이 캡시드는 (CA)가 도메인 개그-개그 상호 작용을 매개하는, 뉴 클레오 캡시드 (NC) 영역은 바이러스 게놈 RNA를 모집하고 P6 모집 호스트 요인이 처치 세포막에서 바이러스 입자 분열. 개그는 또한 N 말단에 14 개의 탄소 지방산 또는 미리 스틴 산 잔기의 첨가에 의해 공동 번역 후 변형을 겪는다.
개그의 결합 멤브레인 m 이후, 바이러스 조립에 필수적인 요구 사항입니다결합 막 중의 결함 utants 바이러스 입자를 생산하지 못한다. 지질 이중층 높은 기본 영역으로 불리는 석사 도메인 내에서 기본 잔류 물의 클러스터 (과 소수성 상호 작용을 매개 N- 말단 미리 스테이트 부분 : 우리와 다른 사람은 MA 도메....
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프로토콜
주 1 : 밀 배아 해물 기반 시험 관내 전사 번역 시스템을 사용 개그 단백질의 발현
HIV-1 개그 1. 준비
- (-20 ºC에서 다른 시약을 밀 배아 해물는 -80 ºC에서 저장된다) 냉동고에서 상업 밀 배아 CECF 키트의 모든 시약을 제거합니다. 얼음을 해동하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 성분을 혼합한다.
| 믹스-1 (사료 혼합) | |
| 수유 솔루션 | 900 μL |
| 아미노산 | 80 μL |
| 메티오닌 | 20 μL |
| 합계 | 1000 μL |
| 믹스-2 (해물 믹스) .... |
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결과
상기 프로토콜을 사용하여, 우리는 POPC + + Chol을 POPS 이루어지는 GUVs 제조 (: 4.66 : 2.33 : 3 몰비). 이 조성물은 대략 오후의 PS 및 콜레스테롤 농도를 반영하기 위해 선택되었다. 뇌-PI (4,5)는 P 2는 POPC + POPS + Chol을 혼합물에 포함 된 경우 강력하고 개그의 결합을 효율적으로 만 관찰되었다 (POPC + POPS + Chol을 + 뇌-PI (4,5) P 2 몰비 4 : 2 : 3 : 1이 예에서) (도 4, A 및 C)와 패널 B 및 D를 비교한다. POPC + 이루어지는 GUVs 결합 개그-Chol을 YFP는 + + 뇌 PI (4,5) P (2)이 막 표면에 대한 형광 강도의 증가로 명백하다 나옵니다. 이러한 증가는 또한 GUV 경계 (도 4C 및 D에
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토론
상술 한 바와 같이 GUV 결합 분석은 다른 단백질 지질 상호 작용을 분석 자신의 한계를 가지고 시나리오에서 좋은 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 지질 이중층의 맥락에서 기본 길이 아실 체인 myristoylated 전체 길이 개그 산성 지질 사이의 상호 작용을 검토하고 개그 지질의 고밀도 자당 그라디언트 또는 다른 후 바인딩 처리를 통해 긴 부상 원심 분리없이 그렇게 할 수 있습니다 단지. 또 다른 장점은 개그의 동작을 용이하게 이러한 표면 플라즈몬 공명 기반 분석과 같은 다른 실시간 기술에서 달성되지 않는다 (세포질 성분의 존재하에, 예) 복잡한 혼합물에서 검사 될 수 있다는 것이다. 따라서, 하나는 여기에 설명 된 분석의 분야에서 사용되는 다른 분석법보다 고유 컨텍스트 개그 산성 지질 상호 작용의 실시간 평가를 가능하게 할 수 있다고 주장한다.
그러나,이 방법 등과 관련된 제한이있다잘. 주어진 제조에 GUVs 서로 유사 조성 원래 혼합물에, 전기 주.......
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공개 사항
우리는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 도움이 토론 모하메드 살림, 징 우 및 Krishnan Raghunathan에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 촬영하는 동안 도움을 프리 야 Begani 감사합니다. 이 작품은 (AO에) R01 AI071727 및 (SLV에) R01 GM110052은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 디지털 멀티미터 | Meterman | 30XR | 저항과 볼트를 측정할 수 있는 일반 멀티미터가 목적에 부합합니다. |
| 함수 발생기 | Instek | GFG-8216A | 10Hz 및 1V에서 사인파를 생성할 수 있는 일반 함수 발생기로 충분합니다. |
| ITO 코팅 유리 슬라이드 | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| 인큐베이터 | Hoefer | 온도를 정확하게 유지할 수 있는 인큐베이터라면 충분할 것입니다 | |
| 진공 챔버 | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| 주사기 | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, 주사기 번호 702 |
| PDMS | 실가드 엘라스토머 베이스 키트, Dow-Corning | 실가드, 184 | |
| RTS 100 밀 배아 CECF 키트 | BiotechRabbit, 베를린, 독일 | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, 칼즈배드, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti 극성 지방질, 알라바스터, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti 극성 지질 | 840034C | |
| 콜레스테롤 | Avanti 극성 지질 | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti 극성 지질 | 840046X |
참고문헌
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
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