이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.
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방법 논문
직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영
이 논문에서
요약
초록
다이렉트 이미징 혈전 색전증 경색의 근본 원인을 시각화한다. 이미지 혈전을 수있는 것은 직접 간접 측정에 의존보다 뇌졸중의 훨씬 더 조사를 허용하고, 강력하고 강력한 혈관 연구 도구가 될 것입니다. 우리는 분자 이미징 혈전 마커 혈전 라벨 광학 이미징 방법을 사용 - 공유 응고 성숙 과정에서 활성화 응고 인자의 XIIIa에 피브린 - 가교 효소 작용에 의해 혈전 섬유소 가닥에 연결된 Cy5.5 근적외선 형광 (NIRF) 프로브. 섬유소 : 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT) 기반의 접근 방식은 혈전의 주요 구성 요소를 대상으로 작용 혈전을 추구하는 금 나노 입자 (AuNPs)를 사용합니다. 본 논문은 생체 microCT 결합 및 색전 뇌졸중의 마우스 모델에서 thromboemboli의 생체 NIRF 이미징에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 생체 내에서 보여 </ EM>는 microCT 및 섬유소 타겟 글리콜 키토산 AuNPs은 (FIB는-GC-AuNPs)는 현장 혈전 및 색전 뇌 혈전에 모두 시각화에 사용할 수 있습니다. 또한 직렬 조직 플라스 미노 겐 활성제 매개 혈전 용해의 치료 효과를 모니터링하는 생체 microCT 기반 직접 혈전 영상의 사용을 설명한다. 마지막 이미징 세션 후, 우리는 생체 NIRF의 범위와 뇌의 잔류 thromboemboli의 분포를 영상화하여 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 양적 이미지가 microCT 및 NIRF 영상 데이터의 분석에 대해 설명합니다. 직접 혈전 영상의 결합 기술은 혈전 시각화의 두 개의 독립적 인 방법을 비교 할 수 있습니다 :에 혈전 관련 형광 신호의 영역 생체 NIRF 이미징 대 생체 내에서 한 고밀도의 microCT 혈전의 볼륨.
서론
육명에 하나는 자신의 일생에 어떤 시점에서 뇌졸중이있을 것이다. 허혈성 뇌졸중은 지금까지 가장 일반적인 뇌졸중의 종류에 따라, 그리고 모든 스트로크의 경우 약 80 %를 차지한다. thromboemboli이 허혈성 뇌졸중의 대부분의 원인이되기 때문에, 바로 촬상 혈전에 대한 관심이 높아지고있다.
그것은 약 2 백만 뇌 세포는 슬로건 "시간이 두뇌입니다"로 이어지는 중간 대뇌 동맥 폐쇄 1의 모든 분 동안 죽을 것으로 추정했다. 전산화 단층 촬영 (CT) 연구는 신속하게 수행하고 널리 사용할 수 있습니다 될 수있다; 이러한 이유로, CT는 초기 진단 및 초급 성 허혈성 뇌졸중의 치료를위한 선택의 영상 남아있다. 혈전 용해에 대한 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)을 관리 및 / 또는 혈관 내 혈전 검색 2 차적으로 분류 : CT는 중요한 초기 의사 결정을 알리는 데 특히 유용합니다. 현재 CT 기반 혈전 이미징, 그러나, 직렬 cerebra을 추적 할 수 없습니다생체 내에서 리터의 thromboemboli, 그것은 간접적 인 방법을 사용하기 때문에이 혈전을 설명합니다 : 요오드화 대비하여 혈액 풀의 혼탁 한 후, 혈전은 혈관의 결함을 충전으로 증명된다. 이와 같이 혈전 촬상 반복 곤....
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프로토콜
이 프로토콜에서 설명 모든 동물 절차를 검토하고 동국대 학교 일산 병원 동물 관리 및 사용위원회의 승인과 관리 및 동물의 사용에 대한 NIH 가이드에 설명 된 원칙과 절차에 따라 진행되고있다.
형광 마커로 표기 외생 형성된 응고 1. 준비 (그림 1)
- 30 % 산소 (1.5 L / min로 100 % 산소)를 혼합 3 % 이소 플루 란을 이용하여 유도 챔버에 마우스를 마취. 근육을 관찰하고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
- 발생하기 쉬운 위치에 멸균 드레이프의 동물을 배치, 30 %의 산소와 혼합 흡입 마스크와 2 % 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유지. 무균 기술과 무균 가운 / 마스크 / 장갑 / 악기를 사용하여 다음 절차를 수행합니다. 청소 및 이전에 70 % 알코올로 실험 영역을 살균하여 무균 상태를 유지차의 절차 후.
- 심장 천자 6 후 약 300 ~ 1,000 μL 동맥 혈액을 수집합니다. 형광 응고를 표시하기 위해, 30 μL의 C15 프로브 (5) (20 μmol / L 농도), 활성화 인자 XIII (FXIIIa) 응고 효소의 섬유소 가교 활동에 민감한 Cy5.5 형광 프로브 70 μL 전체 혈액 믹스 (그림 1A
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결과
원위부 내 경동맥의 ACA의 분기 지역 (그림 6 - 기준 microCT 이미지, FIB-GC가-AuNP 색 전성 뇌졸중 후 1 시간에서 (10 ㎎ / ㎖, 300 μL), 명확하게 MCA에서 뇌 혈전을 시각화 투여 후 생체 내에서 얻어진 ). 후속 microCT 이미징은 식염수 처리와 COW 혈전에 변화가 없었다. 그러나, tPA의 치료는 COW 혈전의 점진적 용해 (그림 6에 파란색 화살촉)를 보여 주었다. 이 발견은 microCT 혈전 영상이 혈전의 치료 모니터링을 허용 할 수 있음을 보여줍니다. 24 시간에서 잔류 thromboemboli에 대한 생체 CT 밀도와 생체 NIRF 사이의 우수한 대응이 있습니다. 때문에 내인성 혈전 자국 멋지게 인해 NIRF 신호 분야와 공동으로 로컬 라이즈 된 섬유소 타겟팅 AuNPs에 의해 해당 한 고밀도의 microCT.......
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토론
피브린은 생체 microCT 기반 이미징 금 나노 입자 (FIB-GC-AuNP)을 타겟팅하고 FXIIIa는 전 광학 이미징 프로브를 대상으로 우리는 색 전성 뇌졸중의 실험 모델에서 직접 혈전 촬상 두 상보 분자 이미징 기술의 사용을 보여 형광 이미징 생체 내.
FIB-GC-AuNPs의 정맥 내 투여 후 혈전 농도 그라데이션 - 후 (입자 표면에서) 피브린 타겟팅 펩타이드의 작용에 의해 혈전에 포획가되는 입자에 의한 고밀도의 구조로 CT에 표시되었는지 다공성 구조, 즉, 혈전에 따라 확산. 이 프로세스는 한 방향으로 만 발생하는 것으로 나타나고, 급속 응고에 농축되고 혈액에서 나노 입자의 상대적으로 낮은 농도로 인해, 검출 가능하도록 충분히 그 CT 밀도 변경. 24 시간에서 최종 생체 microCT 이미징잘 형광 대뇌 동맥에 배치되기 전에 FXIIIa의 섬유소 가교 활동을 인식하는 광학 탐침으로 .......
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공개 사항
DE.K., JY.K, CH.A 및 KK는 섬유소 타겟 금 나노 입자의 특허 보유자이다 (10-1474063-0000, 특허청). 나머지 저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 한국 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (HI12C1847, HI12C0066)에 의해 지원되었다, 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램 (2010-0019862) 및 글로벌 연구실 (GRL) 프로그램의 (NRF-2015K1A1A2028228) 한국 정부에 의해 자금 국립 연구 재단.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, 전주, 한국 | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF 이미징 시스템 | Roper-scientific, 투손, AZ | coolsnap-Ez | |
| 레이저 도플러 유량계 | Perimed, 스톡홀름, 스웨덴 | PeriFlux System 5000 | |
| 수술용 현미경 | Leica Microsystems, 한국 | 서울 EZ4HD | |
| 흡입 마취기 | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR | control NanoFocusRay, 전주, 한국 | NFR Polaris-G90 | microCT control |
| software Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | 이미징 분석 |
| 장치/기기 | |||
| 주입 펌프 | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| 포켓 코스터리 | 대종, 서울, 한국 | DJE-39 | |
| 뇌 매트릭스 | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, 안산, 한국 | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, 천안, 한국 | ||
| 테이프 | 스카치, 서울, 한국 | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, 밴쿠버, 캐나다 | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro Scissor | Fine Science Tools, 밴쿠버, 캐나다 | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, 밴쿠버, 캐나다 | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | 유한, 서울, 한국 | ||
| 수의사연고 | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% 포비돈-요오드(베타딘) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| 금 나노 입자 | 합성 | ||
| C15 광학 에이전트 | 합성 | ||
| 조직 플라스미노겐 활성제 | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal | Saline Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 밀리리터 |
참고문헌
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
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