방법 논문

높은 콘텐츠 체외 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

DOI:

10.3791/54298

⸱

2016년 7월 16일

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

이 논문에서

요약

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당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

초록

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인슐린 생산 β세포의 손실은 당뇨병의 주요 특징입니다. 다양한 잠재적 대체 요법이 연구되고 있지만, 내인성 인슐린 생산 췌장도 β세포의 확장은 여전히 매력적인 전략으로 남아 있습니다. β세포는 자발적 재생 활동이 제한되어 있습니다. 따라서 중요한 연구 노력은 β세포 성장을 억제하는 분자 경로에 대한 정확한 이해를 개발하고 이러한 억제를 극복할 수 있는 약물을 식별하는 것입니다. 본 명세서에서는 β세포 복제를 촉진하는 소분자를 식별하기 위한 자동화된 고함량 이미지 기반 일차 세포 스크리닝 방법을 제시합니다. 이전 방법론의 몇 가지 한계가 극복되었습니다. 첫째, 불멸화된 세포주가 아닌 1차 섬 세포를 사용하면 생체 내 성장 억제 물질의 보유를 극대화할 수 있습니다. 둘째, β세포주가 아닌 혼합 구성의 섬 세포 배양을 사용하면 계통 제한 및 일반 성장 자극제를 모두 식별할 수 있습니다. 셋째, 이 기술은 384개의 우물 형식을 사용하여 제한 자원인 1차 섬의 사용을 실용화합니다. 넷째, 불규칙한 섬 양식 품질과 관련된 해로운 실험 변동성은 분리, 분산, 도금 및 배양 매개변수의 최적화를 통해 극복됩니다. 다섯째, 섬 내분비 세포의 낮은 기저 복제율을 정확하고 일관되게 측정하는 데 따르는 어려움은 최적화된 면역염색 매개변수, 자동화된 데이터 수집 및 데이터 분석을 통해 극복됩니다. 자동화는 처리량을 향상시키는 동시에 실험자 편향을 제한합니다. 이 분석의 주목할 만한 한계는 섬 구조를 방해하는 분산된 섬 배양물의 사용, 인간 섬이 아닌 설치류의 사용, 일차 세포의 사용과 관련된 처리량 및 비용의 내재적 한계입니다. 중요한 것은 이 전략이 인간 섬 복제 연구에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 분석법은 β 세포에 대한 물질의 유사분열 효과와 β세포 성장을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 매우 적합합니다.

서론

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당뇨병은 포도당 항상성 교란의 공통 종점 공유 질환의 컬렉션을 포함한다. 당뇨병 아형의 병원성 메카니즘은 구별이기는하지만 감소 β 세포 질량, 즉 인슐린 생산 능력 1,2- 손실의 결과를 공유한다. 현재 당뇨병 치료 전략은 외인성 인슐린, 인슐린 생산, 인슐린 감수성 증강 약물 자극 만성 투여에 의존하고, 거의, 췌장 또는 전부를 3,4- 췌장 이식. 유감스럽게도, 이러한 전략의 성공은 짧은 수명 및 / 또는 충분히 내인성 인슐린 생산 기능을 요점을 되풀이하는 데 실패합니다. β 세포의 재생을 촉진하는 방법을 개발의 유용성에도 불구하고, 이러한 접근 방식은 존재하지 않는다. 따라서, 당뇨병의 주요 연구의 목표는 새로운 β 세포를 생성하거나 내인성 β 세포 5 질량 확장 방법을 개발하는 것이다 . 이러한 배아 줄기 세포와 같은 재생 에너지 원 β - 세포 재생이 진행되고 있지만, 안전과 효율 우려가 성숙 β 세포의 확장, 우선 순위 6,7를 포함하여 다른 전략을 추구합니다. 중요한 생체 내에서 새로운 β 세포의 주된 소스는 기존의 β 세포보다는 특수 전구 세포 8,9이다. β 세포가 제한된 복제 능력 β 세포 질량의 작은 증가를 갖는 것처럼 보이지만 (~ 30 %)이 많은 당뇨 환자의 혈당 항상성을 복원하기에 충분할 수있다. 또한, β 세포 질량의 동일계 약물 자극 잠재적 인 저렴하고 확장 치료 전략이다. 여기서 β 세포의 성장을 자극하는 작은 분자를 확인하고 특성화하기위한 고급 컨텐츠 스크리닝 방법이 제공된다.

시험 관내 실험 방법의 다양한 유전자 생성물 및 / 또는 분자 그쪽을 식별하기 위해 사용될 수있다t 차 β 세포 복제를 추진하고 있습니다. β 세포 ​​복제 유도를 측정하기위한 초기의 노력은, 특정 처리 조건 (10)에 응답하여 알데히드 - 티오 닌 또는 인슐린 염색 모집단 내에서 [3 H] 티미 딘 혼입 BrdU의 혼입 또는 유사 분열 체를 측정하는 태아 설치류 pancreata 배양 또는 그대로 고립 섬 배양 물을 사용하여 11. 이 체외 접근법과 유사 검색어는 그 몇 가지 제한이 있습니다. 눈에 띄는 결함 성숙한 β 세포와 달리, 높은 기저 β 세포 복제 속도를 표시하고 명료하게 12 규제 증가하고, 태아 세포 (1)의 사용을 포함한다; (2) β 세포 복제 이벤트의 실험자에 의존 판결의 주관적 성격 (3) β 세포 복제 이벤트의 실험자에 의존하는 계산의 노동과 시간 집약적 인 특성은 실험 처리량을 지연시킨다; 핵 혼입 / 얼룩 / 외관 (4)를 사용하더라도 복제 식별TS 및 β 세포를 식별하기 위해 비 중복 세포질 염색-β 세포에 근접한 비 β 세포 복제 사건 misattribution 리드.

보다 최근 성숙한 차 β 세포가 β 세포 복제 13-16의 과발현 유전자의 영향뿐만 아니라 유전자 생성물 또는 화합물을 치료를 평가하기 위해 사용되었다. 그러나, 이들 연구는 또한 복제 이벤트, β 세포의 식별 및 / 또는 처리량을 제한하는 노동 집약적 인 단계, 예를 들어, 세포 또는 본래 췌장의 개별 슬라이드 웰 도금 세포질 staining- 또는 비특이적 방법 주관적 계수에 의존 파라핀 매립 및 처리 17. 특히, 본 명세서에서 비슷한 이미지 기반 인간의 β 세포 복제 심사 방법론은, 18 게시 된; FEA 그러나 이러한 분석의 성공적인 사용은 입증되지 않은 일차 스크리닝 인간의 아일렛의 사용은 광범위하지 않을sible.

복제 - 증진 물질을 식별하기위한 다른 전략은 β 세포주의 성장 유도를 평가하는 것이다. 초기 노력은 형질 전환 된 β 세포 라인을 같은 MIN6 세포 또는 INS 13분의 832 세포 14,19-21을 사용했다. 그러나, 이러한 세포 라인은 무제한 성장을 보여 주 잘 차별화 된 β 세포 (22)에 약간의 유사성. 따라서, 성장 유도 용량은 최소 불분명 관련성 및 요점을 되풀이하는 것이 때로는 곤란하다. 세포주 기반 스크리닝 개선 전략은 테트라 사이클린 (독시사이클린)의 부재하에 성장 체포 의존적 SV40 T 항원의 발현 23,24있는 세포 "가역적으로 변환"이용한다. 그러나, 이러한 세포가 독시 싸이클린 제거시 "일반적인"β 세포와 같은 상태로 되돌아 여부를 명확하지 않다. 불행하게도,이 세포의 사용은 즉시 유틸리티가 표시되지 않는 일반화 된 성장 촉진 화합물을 수득했다24. 전반적으로, 최소한의 자발적인 복제 작업을 표시하는 세포 유형의 성장 조절을 연구 세포 라인의 사용은 제한된 적용 가능성을 가질 수도있다.

여기에 제시된 β 세포 복제 심사 플랫폼은 가능한 한, 혈통 제한 성장 촉진 활동의 식별을 가능하게 혼합 세포 형 조성물의 섬 - 세포 배양, 멀티에게 생체 내 성장 조절에 유지하는 성숙한 기본 쥐의 β 세포를 활용 - 음 처리량 및 자동 분석을 최대화하기 위해 포맷하면 바이어스를 제거하고 처리량을 용이. 이 플랫폼의 성공적인 사용은 β 세포 복제 25, 26을 촉진 몇 가지 화합물을 식별 할 수있게되었습니다. 또한, 분석은 β 세포 복제 분자 조절 기전에 대한 통찰력을 제공하는 구조 - 활성 관계 연구 및 화학 상위 성 실험을 위해 사용되었다. 제시된 플랫폼이 성공적으로 fo를 적응했다β 세포 ​​복제 연구 렌티 바이러스의 RNAi 기반 조사 (25) 경로. 분석의 한계 (일차 전지의 사용) 확장 성을 제한 포함, 오히려 항체 기반 이미징 및 주요 섬의 사용, 사용과 관련된 (분석 인간 섬의 연구에 적용 할 수 있지만) 인간의 섬 세포, 비용보다 설치류의 사용 이미지 획득 및 분석 기능을 가진 자동 현미경의 가용성에 따라 자동화 된 이미지 획득 및 의존성을 용이하게 분산 된 섬 (파쇄 섬 구조)의. 유전자 제품이나 현장에서의 β 세포 재생을 자극하는 화합물을 식별하기위한 손쉬운 생체 검사 방법이 이상적 일 것이다하지만, 이러한 플랫폼은 아직 27 사용할 수 없습니다. 따라서, 설명 된 플랫폼은 β 세포 복제의 대부분의 측면을 조사 연구에 관심이 적합하다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 의학 스탠포드 대학의 기관 동물 보호 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행 하였다. 섬 세포 복제 평가를위한 384 웰 플레이트 228 우물을 생성하기에 충분하다 - (9 주 이전 8) 남성 스프 라그 돌리 쥐, 300g - 기술 된 프로토콜은 여섯 250 섬의 격리를 위해 조정됩니다.

1. 재료 준비

  1. 15cm 조직 배양 접시 (28)에서 3 일간 합류 유지 804G 래트 방광 종양 세포의 조절 매체 (RPMI1640 20 mL)을 수집하여 아일렛 분리를 개시하기 전에 피복 매체를 준비한다. 살균 필터 저장소 (-20 ° C) 나중에 사용하기 위해 조정 배지.
  2. 수술 도구를 소독 (한 12cm 톱니 조직 포셉, 하나 11.5 cm 미세 가위, 하나 14.5 cm 수술 가위, 두 개의 16 cm 곡선 집게, 한 12cm 곡선 지혈, 하나의 12cm 메스 핸들) 및 초기화하기 전에 한 30 메쉬 조직 체섬 격리를 iating.
  3. 60 %를 용해하여 췌장 소화 솔루션을 준비 : 정제 클래스 I의 40 % 혼합물 : 클래스 II 콜라게나 (300,000의 총 콜라게나 제 활성 - 40 단위) 칼슘, 마그네슘 보충 1X 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS) 60 ㎖에. 로드 얼음에 1 "22 G 바늘과 장소 10 ml의 주사기 (육)으로 췌장 소화 버퍼 10 ㎖.
    주 : 소화 용액 10 ml를 래트 당 주입된다. 이에 따라 확장 할 수 있습니다.
  4. 케타민 1.3 ㎖ (100 ㎎ / ㎖), 자일 라진, 0.2 ㎖ (100 ㎎ / ㎖) 및 3 ㎖의 PBS를 혼합하여 환기 후드 마취 칵테일 4.5 ml의 준비. 섬 격리를 개시 1 시간 이내에 마취 칵테일을 준비합니다.
  5. 500ml의 HBSS에 신생 송아지 혈청을 25 ㎖를 첨가하여 세척 완충액을 준비한다. 나중에 사용하기 위해 얼음에 세척 버퍼를 놓습니다.
  6. 낮은 혈당 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), (5)의 500 ml의 인 섬 매체의 1 병을 준비합니다0 ㎖의 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린의 5000 단위 / ml의 스트렙토 마이신 및 5000 ㎍ / ㎖의.
  7. 2 % FBS, 2 mM의 글루타민, 5 mM의 포도당 페니실린의 5000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 5,000 ㎍ / mL를 기능 / 생존력 용액 (500 ㎖)에서 췌장 기능 매체를 준비한다. 나중에 사용하기 위해 섬의 기능 매체 (4 °에 C)를 저장합니다.
  8. 1X 인산 완충 식염수의 37.38 ㎖ (PBS)에 2.5 ml의 당나귀 혈청 및 0.12 ml의 트리톤 X-100을 추가하여 버퍼를 차단 40 ml의를 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 저장 차단 버퍼 (4 °의 C).
  9. 프로토콜을 시작하기 전에 필요한 항체를 얻습니다.
    참고 : PDX-1 (TRITC)와 기-67 (FITC) 공동 염색은 기본 β 세포 복제 검사에 사용됩니다. 핵 (DAPI), PDX (Cy5에) 및 기-67 (FITC) 염색과 함께, 혈통 특정 복제 분석을 위해 추가 셀 식별 마커 (TRITC 인슐린, 글루카곤, 멘틴 또는 소마토스타틴 (somatostatin))에 대한 면역 형광 염색을 수행합니다. 대체 담당자lication 마커, 예, PCNA도 사용될 수있다.
  10. 4 번씩 수행 각 처리 조건에 228 웰 치료 계획을 준비한다. (: 666 희석 DMSO 1) 웰 포지티브 (5 Iodotubercidin [1 μM] 또는 디피 리다 몰 [15 μM]) 및 차량 컨트롤을 포함합니다.

췌장의 2 관류

  1. 희석 마취 칵테일 용액 (0.30 ㎖ / 100g 체중)의 IP 주사에 의해 래트를 마취. 쥐가 완전히 마취 및 유해 자극에 응답하지되면, 자궁 경부 전위를 수행합니다.
  2. 종이 타월의 스택에 앙와위 (두개골 - 꼬리 방향)에서 안락사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부 영역을 스프레이.
  3. U 자 절개 (음부에서베이스)로 복강을 열고 복강을 노출하는 가슴을 통해 주동이의 방향으로 피부를 철회.
  4. 조심 곡선 포셉 두 쌍을 사용 십이지장 잡아 공통 B의 십이지장 항목을 찾아ILE 덕트 (오디 괄약근) 및 곡선 지혈과 유두에서 십이지장 개방 클램프.
  5. 담관 유두 클램프 및 곡선 집게를 사용하여 간 부근 담관 잡아 사용 만곡 지혈 리프트. 분리 및 담관을 노출 곡선 집게와 무딘 절개를 사용합니다.
  6. 헤드 근위 및 원위 다리에 쥐 위치를 조정합니다.
  7. 췌장 소화 용액으로 낭성 일반적인 간 덕트의 교차점에 일반적인 담즙의 덕트 (CBD)하거나 말단을 Cannulate 10 ML의 주사기를 -loaded 천천히 췌장 소화 용액 10 ㎖를 주입. 주입하는 동안, 메스 핸들과 CBD를 지원합니다. 덕트 및 췌장 팽창하지 않을 경우 바늘 위치를 조정합니다.
  8. 하행 결장, 창자, 위장과 비장에서 분리하기 위해 곡선 포셉 및 고급 가위를 사용하여 팽창 췌장을 제거합니다. 5 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 얼음 팽창 된 췌장을 배치 췌장 소화 솔루션입니다.
    참고 : 최대 섬 수율은 각 50 ㎖ 소화 관에서 30 분 장소 만 1 또는 2 pancreata 내의 모든 pancreata를 수집합니다.

췌장 3 해리

  1. 일단 모든 pancreata는 수집 된 15 분 동안 37 ° C를 물 목욕으로 소화 튜브를 배치하고 있습니다. 부드럽게 튜브 매 3 분 소용돌이 친다.
  2. 15 분 후, 적극적으로 튜브를 (수직) 10 회 흔들어 차가운 세척 버퍼 10 ㎖를 추가합니다. 적극적으로 튜브를 추가로 5 번 흔들어 얼음에 배치합니다.
  3. 튜브 5 번 반전 차가운 세척 버퍼와 믹스 50ml로 소화 튜브를 입력합니다.
  4. 1 분 동안 4 ° C에서 97 XG에 튜브를 원심 분리기 상층 액을 붓는다. 펠렛 조직을 제거하지 않도록주의하십시오.
  5. 25 ml의 세척 버퍼를 추가하고 부드럽게 텍싱하여 조직을 다시 일시 중지합니다. 반복 두 번 더 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다.
  6. 보안 목표 명세서를 통해 30 메쉬 조직 체를 배치250 ml의 비이커를 erile하고 체에 조직 현탁액을 붓는다. 세척 버퍼의 추가 20 ㎖로 소화 튜브를 씻어 메시에 붓는다. 소화되지 않은 췌장과 지방 조직은이 단계에서 제거된다.
  7. 두 신선한 50 ㎖ 튜브에 여과 재료를 붓고 4 ° C에서 1 분 97 XG에서 회전하여 조직 펠렛. 가만히 따르다 뜨는 및 반전 튜브 초과 버퍼를 배출합니다.

독도 4. 정제

  1. 펠렛 췌장 조직 감기 polysucrose / diatrizoate 나트륨 수용액 20 ㎖ (1.119 g / mL의 농도)를 추가한다. 균일 부드럽게 피펫 팅하여 5 배 아래 각 튜브의 내용물을 다시 일시.
  2. 조심스럽게 10 ㎖의 HBSS로 polysucrose / 나트륨 용액 diatrizoate 오버레이. 천천히 튜브 벽을 따라 HBSS를 첨가하여 날카로운 액체 계면을 유지한다.
  3. 천천히 가속없이 브레이크와 15 분 (4 ° C)에 대한 560 XG에 소화 pancreata을 원심 분리기.
  4. 공동신선한 50 ㎖ 튜브에서 10 ㎖ 피펫 장소 아일렛을 사용하여 인터페이스에서 섬 층 llect. 이 단계에서 독도를 풀하지 마십시오.
  5. 4 ° C에서 140 XG에 1 분 동안 각각 50 ㎖ 튜브와 스핀에 세척 버퍼의 40 ML을 추가합니다.
  6. 상층 액을 붓고 튜브를 여러 번 반전 세척 버퍼의 50 ㎖에서 풀링 된 섬을 다시 일시 중지합니다. 펠렛에 독도를 수집하기 위해 4 ° C에서 97 XG에서 1 분 튜브를 원심 분리기.
  7. 세척 버퍼를 붓고 세척을 반복합니다. 조직 문화 후드에 독도를 가져오고 뜨는을 대기음.
  8. 아일렛 배지 6 ㎖에 섬의 각 튜브를 다시 일시.
  9. 여섯 잘 조직 배양 접시의 우물에 각 50 ML 튜브에서 독도를 전송합니다. 잘의 중앙으로 독도를 수집하고 현미경으로 섬의 품질과 순도를 관찰하기 위해 6 잘 접시를 소용돌이 친다.
  10. 수동으로 1 ml를 피펫을 사용하여 독도를 수집하고 이웃에 집어 독도를 전송또한 섬 미디어 6 ml를 함유. 반복 섬의 소용돌이 90>까지 %의 순도를 따기가 달성된다.
  11. 아일렛 배지 20 ㎖를 포함하는 10cm 조직 배양 접시로 정제 아일렛 전송.
  12. 조직 문화 인큐베이터에 배치 섬 (37 ° C, 5 % CO 2) 하룻밤 (그림 1A).
  13. 섬 세포, 코트 당 잘 804G 에어컨 미디어의 40 μL와 384 웰 플레이트 도금의 준비를합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션.

5. 분산과 작은 섬 세포의 도금

  1. 다음 날, 부드럽게 세포 스크레이퍼와 10cm 접시에서 독도를 분리하고 50 ㎖ 튜브에 독도를 전송합니다.
  2. 실온에서 22 XG에서 1 분 동안 원심 분리에 의해 펠렛 아일렛. 뜨는을 대기음.
  3. 따뜻한 PBS의 20 ㎖로 독도를 씻고 위와 같이 가만히 따르다.
  4. 0.25 % 트립신의 섬 (쥐의 췌장 당 150 μl를 다시 일시 중지10 분 동안 37 ℃에서) 및 부화. 피펫 최대 섬 아래로 10 시간 배양의 5, 10 분 후 1 ml를 피펫을 사용하여.
  5. 10 분 후, 완전 소화를 보장하고 혈구를 이용한 섬세포를 계산하기 위해 현미경 트립신 아일렛의 20 μl의 샘플을 평가한다. 5 분 피펫 위아래로 10 회 이상 - 소화되지 않은 섬이 남아있는 경우, 추가로 3 배양을 계속합니다. 필요한만큼 반복합니다.
    참고 : 일반적인 수율은 ~ 125,000이다 - 쥐 당 15 만 섬 세포.
  6. 인큐베이터에서 804G 에어컨 미디어 코팅 된 384 웰 플레이트를 제거하고 12 웰 매니 폴드 흡입기를 사용하여 용지를 제거합니다.
  7. 아일렛 함수 매체 용액 당 45,000 세포의 밀도로 섬 세포를 중단하고 멀티 채널 피펫 (도 1b)를 웰 당 70 μL (3150 셀) 접시.
    참고 : 외부 우물에있는 β 세포가 N과 열 4 판을 사용 행 C의 주변으로 마이그레이션하는 경향이 있기 때문에(21)에 6 쥐에서 고립 된 섬 세포와 228 우물을 판입니다.
  8. 세포 부착을 허용하기 위해 48 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 놓는다.

6. 작은 섬 세포 문화 치료, 고정 및 염색

  1. 작은 섬 기능 매체의 2 배 농도 (처리 조건을 4 번씩 수행) 차량 및 화합물의 200 μl를 준비합니다. 멀티 웰에 피펫 팅을 용이하게 멸균 96- 웰 플레이트에서 화합물을 배열.
  2. 조심스럽게 12도 매니 폴드 흡입기와 섬 매체를 제거하고 12 웰 피펫을 사용하여 섬의 기능 매체 (35 μL / 웰)로 교체합니다. 제거하고 (도 1C)를 건조시키는 위험을 제한하기 위해 한 번에 하나의 행에서 미디어를 교체한다.
  3. 35 μL / 전송 웰의 2 배 화합물 솔루션에 의해 치료를 시작합니다. 48 시간 치료 기간 동안 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
  4. 처리 48 시간 후, 플레이트를 반전하여 처리 매체를 가만히 따르다.
  5. 부드럽게 1X PBS (1 분)을 잘 당 50 μL와 섬 세포를 씻는다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 PBS를 추가합니다.
  6. PBS를 경사 분리하고 1X PBS에 희석 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 웰 당 50 μL 첨가하여 세포를 고정한다. 4 ℃에서 15 분 동안 세포를 품어.
  7. 재정법을 제거 판을 반전 부드럽게 이상으로 잘 당 PBS의 60 μl를 추가하여 세포를 세 번 (5 분마다)를 씻으십시오.
  8. 포름 아미드 14.25 mL 및 0.75 ml의 0.15 M 구연산 나트륨 (산도 6)을 혼합하여 15 ml의 항원 검색 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 즉시 항원 검색 솔루션을합니다.
  9. 접시를 반전 우물에서 PBS를 제거하고 각 웰에 60 μl의 항원 검색 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 45 분 동안 70 ℃로 물을 욕조에 접시를 가열한다. 멀티 웰 플레이트의 휘어짐을 방지하기 위해이 배양 중에 플레이트의 상단에 가열 블록을 배치합니다.
    참고 : 물이 반까지 잘 판 스커트해야한다; 플레이트는 침수되지 않아야한다.
    10. 수조에서 플레이트를 제거하고 실온에서 20 분 동안 냉각 할 수 있습니다. 플레이트는 육안 검사에 의해 뒤틀린되지 않았는지 확인합니다.
  10. 1X PBS 3 회 잘 당 60 μL (5 분 각각)로 세포를 씻으십시오. 멀티 채널 피펫 PBS를 첨가하고, 플레이트를 PBS 반전 캔트.
  11. 블로킹 완충액 웰 당 40 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양하여 멀티 채널 피펫을 사용한다. 반전 판과 경사에 의해 차단 버퍼를 제거합니다.
  12. 염소 항 - 인간 PDX-1 (1 : 100) : 마우스 기-67 (200 1) 항 - 인간의 40 μl를 추가 각 웰에 버퍼를 차단에 희석 항체를 밤새 4 ° C에서 품어.
  13. 그 다음날, 상기와 같이 세 번 (5 분마다)을 방지 체 용액을 디 캔트 및 1X PBS로 세포를 세척 하였다. PBS를을 가만히 따르다.
  14. 버퍼를 차단에 : (200 일) 바이오틴 당나귀 항 - 마우스 IgG와 로다 민 - 복합 당나귀 방지 염소 IgG의 희석을 잘 당 40 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 품어실온에서 첨가 하였다.
  15. 1X PBS로 세 번 5 분 각각의 세포를 씻으십시오. 각 웰에 형광 접합 된 스트렙 타비 딘 (버퍼를 차단 400 1) 희석 40 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
  16. 1X PBS로 세 번 5 분 각각의 세포를 씻으십시오. DAPI의 웰 (블로킹 완충액 300 ㎚) 40 μl를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
  17. 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 PBS 1X 40 μl의 세포를 둡니다. 판은 분석 준비가 완료된다.

7. β - 세포 복제 분석

주 : 분석 프로토콜 β 세포 복제를 측정하기 위해 사용 된 고 함량 검사 현미경 확립되어야한다. 가장 간단한 구성에서,이 프로토콜은 식별 마커 β 세포를 정의하는데 사용되는 2 색 분석은 (PDX-1 + β- 세포) 및 복제 마커 (기-67) 세포 분열 이벤트를 정의하는 데 사용된다.

  1. 결과 평균에 기반하여 객체 (β 세포)를 식별β 세포 ​​핵 (도 2a)의 예상되는 화소 영역 내 (폭 <1.6 길이)의 대략 원 안에 PDX-1 염색 (549 nm 인 필터)의 예를 형광 강도.
  2. 다음으로, PDX-1 + 영역 (그림 2B) 내에서 평균 형광 강도 (485 나노 필터)에 따라 복제 이벤트 (기-67 양성)를 식별하는 설정을 설정합니다.
    주 : 노출 시간에 걸쳐 이미지 픽셀 강도 비교를 허용하도록 수정되어야한다. 분석 프로토콜 파라미터는 시스템 호출 지속적 데이터 품질에 부정적인 영향을 미칠 수있는 비특이적 염색, 파편 및 세포 응집물을 배제되도록 조정된다.
  3. 정확도 한계 다양성을 최대화하기 웰당 500 β 세포의 최소 분석.
    참고 : 마우스 아일렛 배양 기저 β 세포 복제 인덱스가 0.5이 될 것으로 예상된다 - 3 %. 일반적으로,도 40의 이미지는 500 β 세포를 식별하기에 충분한 것보다 더 많은 것이다.
  4. 를 분석하기 전에전체 플레이트, 네거티브 선택 (DMSO - 처리) 및 양성 통제를 분석 (5- iodotubercidin [1 μM] 또는 디피 리다 몰 [15 μM]를) 분석 프로토콜의 유효성을 평가하기 위해 처리 한 웰. 분석이 정확하게 설정되는 경우, 양성 대조군 화합물은 β 세포 복제의 비율에서 적어도 두 배 증가를 유도한다.
  5. 분석 프로토콜이 확인되면 전체 판을 읽어보십시오.

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결과

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β-α 세포 또는 세포 복제를 평가하기 위해, 4 색 분석 프로토콜이 요구된다. 첫째, 객체는 DAPI 염색 (채널 1, 386 ㎚)로 식별됩니다. 다음으로, β 세포 (이벤트 1) 계산됩니다 : 개체 PDX-1 + (채널 2, 650 ㎚) 및 근교 핵 인슐린 (채널 3, 549 nm의) 협력을-표현한다. 그 후, 복제 β 세포 (이벤트 2) 계산됩니다 : (이벤트 1)이 공동 명시 기-67 (채널 4, 485 ㎚) (그림 3) 세포를 β. β 세포를 복제의 비율이 계산됩니다 (이벤트 2 / 이벤트 1) α 세포 복제를 정량화하기 (100)를 X, 총 개체가 DAPI 염색에 의해 식별됩니다 (채널 1) 다음 α 세포 (이벤트 1)에 의해 열거 PDX-1 염색 부재 (채널 2) 및 핵 주변 글루카곤 염색의 존재 (채널 3). 복제 α 세포 (이벤트 2) 기-67 (채널 4) (그림

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토론

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β 세포의 성장과 재생을 제어하는​​ 분자 경로를 연구하기위한 실험 방법은 당뇨병 연구를위한 중요한 도구입니다. 여기서, 쥐 작은 섬 기반 스크리닝 플랫폼을 제시 β 세포 복제의 작은 분자 자극을 식별하고 특성화합니다.

이 프로토콜의 대부분의 측면 쉽게 경험이 풍부한 연구자들에 의해 수행되는 동안, 몇 가지 단계가 특정 기술을 필요로한다. 첫째, 섬 격리하는 동안, 무결성을 방해하지 않고 담즙 덕트의 삽관 연습이 필요합니다. 유용한 전략은 최소한 완전히 췌장 소화 용액을 분배하기 전에 바늘의 적절한 포지셔닝을 보장하기 위해 담관 팽창한다. 둘째, 외분비 조직에서 효율적으로 섬 격리는 소화 기간 및 적절한 교반에 세심한주의를 필요로한다. 케어는 간헐적으로 소용돌이를 통해 다이제스트에 걸쳐에도 난방을 보장하기 위해주의해야한다. 셋째, 실험의 성공은 따라 달라집니다독도 및 수동 섬 따기 동안 외분비 파편 사이에 실력 차별시의; 이 기술은 연습이 향상됩니다. 넷째, 아일렛 분산 도금...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 NIH(JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute(CHRI) 및 SPARK(UL1 TR001085, JPA)의 NIDDK 보조금 DK098143 및 DK101530의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
250g 남성 Sprague Dawly 쥐찰스 강얼룩 # 400
12cm 치아 tisuue 집게파인 사이11021-12
11.5 cm 파인 사이도구14058-11
14.5 cm 수술 용 가위파인 사이14001-14
16cm 곡선 겸자파인 사이11003-16
12cm 곡선 hepostatFine Science Tools13011-12
12cm 메스 손잡이Fine Science Tools10003-12
Tissue sieve-30 meshBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA unitsVitaCyte005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)Gibco24020-117
케타민 HCl (200 mg/20 ml)JHP 제약NDC# 42023-113-10을 사용하여 마취 칵테일을 만드는 방법 
자일라진 (5 g/50 ml)LLOYDNADA# 139-236마취 칵테일을 만들기 위해 
Histopaque 1077SigmaH-1077to make histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119make histopaque 1100
신생아 송아지 세럼 500 mlHycloneSH30118.03
Hanks' Balanced Salt solutionHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose HycloneSH30021.01
기능성/실행 가능성 솔루션 미디어테크99-768-CV
RPMI1640 미디어 HycloneSH30096.01은 조절된 매체
804G 쥐 방광 암종 세포주요청가능한 매체
Fetal Bovine Serum, 자격이 있는Gibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) MP Biomedicals1670049
포름아미드 500mlFisher BioReagentsBP227-500
항원 마스크 해제 용액 250ml(pH 6.0)Vector LaboratoriesH-33000.15M 시트르산나트륨 용액
만들기 포도당, 무수EMD 화학 물질DX0145-11M 포도당 용액
만들기 Nomal Donkey Serum (Powder)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
마우스 항인간 Ki67 항체BD Biosciences556003
염소 항인간 PDX-1 항체R& D SystemsAF2419
폴리클론 기니피그 항인슐린 항체Dako2016-08
폴리클론 토끼 항글루카곤 항체Dako2014-06
폴리클론 토끼 항소마토스타틴 항체Dako2011-08
폴리클론 닭 항비멘틴 항체abcamab24525
비오틴-SP-접합, 동키 안티-마우스 IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated InvitrogenS32354
로다민-접합 당나귀 안티-염소 IgG Jackson ImmunoResearch705-025-147
로다민-활용 당나귀 항기니피그 IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
로다민-활용 당나귀 항-토끼 IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-활용 당나귀 항-기니피그 IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-활용 당나귀 항염소 IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-활용 당나귀 항토끼 IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-활용 당나귀 항닭 IgGJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
일회용 시약 저장소 25 mlSorenson BioScience39900
384 웰, 블랙/클리어, 조직 배양 처리 플레이트BD Falcon353962
96 웰, 블랙/클리어, 조직 배양 처리 플레이트Costar3603
다중 채널 피펫터Costar4880
12채널 진공 흡입기Drummond3-000-096
셀 스크래퍼팔콘353085
Isotemp 수조 모델 2223 Fisher Scientific
High-content 스크리닝 기기: ArrayScan VTIThermo Scientific
언스 도구 언스 도구 파인 사이언스 언스 도구 언스 도구 to 를 만들기 위해 시 제공됩니다. 조절

참고문헌

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