방법 논문

자질 체외 ATP 아제 활동

DOI:

10.3791/54305

⸱

2016년 8월 23일

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

이 논문에서

요약

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체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

초록

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아데노신 삼인산 가수 분해 효소, 또는 -ATPase를는 세포 기능의 다양한 배열에 중요한 역할을한다. 이러한 동적 단백질은 단백질 인신 매매 및 저하, 용질 수송, 및 세포의 움직임과 같은 기계적인 작업을위한 에너지를 생성 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 기능적 특성화 -ATPase를 정제의 시험 관내 활성을 측정하기위한 기본적인 분석이다. 단백질은 무기 포스페이트 방출을 초래 반응의 ATP 가수 분해 및 유리 된 인산의 양은 다음 비색 정량 분석​​법을 사용한다. 이것은 고도로 적응 프로토콜 운동 또는 엔드 포인트 분석에서 ATP 아제 활성을 측정하기 위해 조정될 수있다. 대표적인 프로토콜이 활동과 EPSE의 요구 사항에 따라 여기에 제공되면, AAA + ATP 아제는 박테리아 비브리오 콜레라를 입력 II 분비에 관여. 활성을 측정하기 위해 필요로 정제 된 단백질의 양을 분석의 길이와 SA의 타이밍 및 횟수mpling 간격, 버퍼 소금 조성, 온도, 공동 요인, 각성제 (있는 경우) 등이 여기에 설명하는 것과 다를 수 있습니다, 따라서 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 특성 -ATPase를위한 기본 틀을 제공하고 신속하게 수행하고 쉽게 필요한 조절 될 수있다.

서론

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ATPase는 모든 생명계의 많은 과정에서 필수적인 효소입니다. ATPase는 ATP 가수분해 에너지를 사용하여 단백질 이동, 풀림 및 조립과 같은 다양한 반응에 동력을 공급하는 분자 모터 역할을 합니다. 복제 및 전사; 세포 대사; 근육 움직임; 세포 운동성; 및 이온 펌핑1-3. 일부 ATPase는 막을 가로질러 용질을 운반하는 데 관여하는 막관통 단백질이고, 다른 ATPase는 세포질이며 원형질막(plasma membrane) 또는 소기관(organelle)과 같은 생물학적 막과 관련될 수 있습니다.

AAA+ ATPases (다양한 세포 활동과 관련된 ATPases)는 일부 서열 및 구조적 보존을 공유하는 큰 ATPase 그룹을 구성합니다. 이러한 단백질은 Walker-A 및 -B box와 같은 보존된 뉴클레오티드 결합 모티프를 포함하고 활성 상태에서 올리고머(일반적으로 헥사머)를 형성합니다1. 뉴클레오티드 결합에 대한 이러한 단백질의 큰 구조적 변화는 AAA+ 계열의 다양한 구성원 사이에서 특성화되었습니다. EpsE는 AAA+ ATPase이며 NTPase4-6의 박테리아 Type II/IV 분비 아과에 속합니다. EpsE는 콜레라의 원인 병원체인 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에서 제2형 분비(Type II Secretion, T2S)를 촉진합니다. T2S 시스템은 V. cholerae가 인간의 소장에 서식할 때 다량의 수성 설사를 유발하는 독성 인자인 콜레라 독소와 같은 다양한 단백질의 분비를 담당합니다7.

체외 ATPase 활성을 정량화하는 기술은 다양하지만 일반적으로 비색, 형광 또는 방사성 기질을 사용하여 인산염 방출을 측정합니다8-11. 우리는 유리된 무기 인산염(Pi)을 측정하는 상업적으로 이용 가능한 공작석 녹색 함유 기질을 기반으로 한 비색 분석을 사용하여 정제된 단백질의 체외 ATPase 활성을 결정하는 기본 방법을 설명합니다. 낮은 pH에서 공작석 녹색 몰리브덴 산염은 Pi와 복합체를 형성하며 복합체 형성 수준은 650nm에서 측정 할 수 있습니다. 이 간단하고 민감한 분석법은 새로운 ATPase를 기능적으로 특성화하고, 잠재적인 활성제 또는 억제제의 역할을 평가하고, 도메인 및/또는 특정 잔류물의 중요성을 결정하거나, 효소 활성에 대한 특정 처리의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 정제 된 단백질과 ATP 가수 분해 반응을 수행

  1. 정제 된 단백질과 부화에 필요한 모든 시약의 주식을 준비합니다.
    1. 100 mM의 HEPES pH가 8.5, 65 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤 (또는 다른 분석 완충액 적절한)을 함유하는 배 HEPES / 염화나트륨 / 글리세롤 (HNG) 버퍼를 준비한다.
    2. 물 (ATP 아제 금속에 의존하는 경우, 또는 다른 금속) 100 밀리미터의 MgCl 2를 준비합니다.
    3. 고순도 ATP를 사용 (추가하여 pH를 조정하지 않음) 200 mM 트리스 자료에서 신선한 100 mM의 ATP를 준비합니다. 나누어지는이 ATP가 시간이 지남에 따라 분해되므로, 몇 주 이상 더 이상 -20 ° C에서 ATP 재고를 저장하고, 동결 및 ATP 재고를 해동을 삼가합니다.
    4. 1에서 프리믹스의 MgCl 2, ATP : 1의 비율로 바로 ATP의 가수 분해 반응을 설정하기 전에.
  2. 조제 및 반응에 걸쳐 일정한 간격으로 샘플을 수집하는 1.5 ㎖의 튜브 라벨. 시간 0 시간 15, 30에서 샘플을 수집하기 위해 튜브를 준비,45 및 60 분.
    참고 : 다른 방법으로, 유일한 시간 0 엔드 포인트에서 샘플을 수집합니다.
    1. ATP에 가수 분해 반응은 1:50에서 수집 한 샘플을 희석하기 위해 각 튜브에 245 μL의 1X HNG 버퍼를 추가한다.
  3. 신속하게 반응을 정지 샘플을 동결을 위해 드라이 아이스와 에탄올의 목욕을 준비합니다. 고무 얼음 양동이 또는 다른 안전 (비 플라스틱) 용기에 드라이 아이스의 여러 조각을 추가하고 조심스럽게 드라이 아이스를 커버하기에 충분한 70 ~ 100 에탄올을 부어.
  4. 적절한 (일반적으로 5 ~ 10 μM)로, 1 배 HNG 버퍼에 정제 된 단백질을 희석하고 얼음에 보관하십시오.
  5. ATP에 가수 분해 반응을 설정합니다.
    1. 각 샘플에 대해 별도의 0.5 ml의 튜브에서, (순서대로) 다음과 같은 시약을 추가, 6 μl의 5 배 HNG 또는 다른 버퍼, 3 μL 100 밀리미터의 MgCl 2 -ATP 혼합물 (최종 30 μL의 볼륨까지) H 2 O, 및 0.25-5 μm의 단백질.
    2. 어떤 단백질을 첨가하지 않은 버퍼 전용 대조군 조건을 포함한다.
  6. 시간 0에서 반응 5 μL를 제거 HNG 245 μL의 버퍼를 포함하는 제조 1.5 ㎖의 튜브에 1:50로 희석하고, 즉시 드라이 아이스 / 에탄올 욕에서 샘플을 동결.
  7. 37 ° C에서 반응은 ATP 가수 분해는 1 시간 동안 발생할 수 있도록 인큐베이션. 각각의 구간 (15, 30, 45, 60 분), 반응을 5 ㎕의 분취 액을 제거하고, 단계 160에서와 같이 HNG 버퍼를 함유하는 표지 된 샘플 튜브에 추가.
  8. ATP에 가수 분해 반응의 끝에서, 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 희석 샘플을 이동. 모든 샘플이 완전히 고정되어 있는지 확인하려면 계속하기 전에 적어도 10 분을 기다립니다.

검출 시약과 무료 파이를 포함하는 2 품어 샘플

  1. 각 시점에서의 ATP 가수 분해 반응의 분취 량을 함유하는 희석 된 샘플 녹여 실온에서 (단계 1.6 및 1.7에서 수득).
  2. 샘플 및 포스페이트 표준을 함유하는 96 웰 플레이트를 설치했다.
    1. 0.5 ml의 TU에서800 μM 표준 104.5 μL에 HNG 완충액 5.5 μl를 첨가하여 800 μM 40 μM 내지 (PI 검출 시약으로 제공됨) 포스페이트 표준 희석 될. 잘 혼합하고, 96 웰 플레이트의 웰에 A1을이 40 μM 파이 표준의 100 μl를 추가합니다.
    2. 1 우물 B1-H1에 50 μL의 HNG 버퍼를 추가 파이 표준의 1 직렬 희석.
    3. 잘 A1에서 40 μM 파이의 50 μl를 제거하고 잘 B1에 50 μl를 분석 버퍼에 추가, 혼합, 잘 B1에서 50 μl를 제거하고 잘 G1을 통해 잘 C1에 계속 희석을 추가합니다. 각 웰은 동일한 볼륨이 보장하는 혼합하여 잘 G1 50 μl를 폐기하십시오. 잘 H1 40 0​​ μM에 파이 표준을 만들 수있는 유일한 버퍼를 포함해야합니다.
      참고 : 추가 요소 (예 : 억제제 등) 샘플에 추가 된 경우, 그 조건 하에서 인산 릴리스 또는 흡광도의 변화를 제어하는​​ 요소를 포함하는 표준 곡선을 작성합니다.
    4. 각 SAMP의 50 μl를 추가접시에 중복으로 제작. 서로 다른 시점 수평, 열에서 같은 시점 ​​수직 (샘플 2 시간 0 = B2, B3 샘플 1 시간 0 = A2, A3가)에서 샘플을 추가합니다. 이는 최대 8 샘플 및 플레이트 당 5 시간 지점 수 있습니다.
  3. 시료와 표준을 포함​​하는 웰 (시약 필요 (㎖) = 시료와 표준의 0.1 × 번호) 각 100 μl를 추가하기에 충분한 말라카이트 그린 / 몰리브덴 파이 검출 시약을 제거하기 위해 멸균 피펫을 사용하여 쉽게 피펫 팅에 대한 접시에 추가 멀티 채널 피펫을 사용. 파이 오염이 발생하기 쉽다 같이 접시에 직접 검출 시약을 부어 마십시오.
  4. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 처음 포인트 전회 점에서 바람직 위해 도입 거품 않고 조심스럽게 피펫으로 시간과 일관된 번호 아래 각 웰에 파이 검출 시약 100 μL를 추가 혼합한다.
  5. 실온에서 25 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 또는 MA에 따라nufacturer의 방향.

마이크로 플레이트 리더를 사용하여 3. 정량 결과

  1. 흡광도 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 650 nm에서 시료의 흡광도를 참조하십시오.
  2. 파이 표준 곡선을 확인합니다. 그래프 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 인산의 양에 대해 해결하기 위해 사용 된 식을 찾기 위해 농도 대 파이 표준 샘플에 대한 흡광도 값을 그래프.
  3. 포스페이트 표준을 교정하여 각 샘플에 대한 ATP 아제 활성을 계산한다. 인산 출시 = (OD 650 - Y 절편) / 경사.
    1. 각 샘플의 중복에서 전체 파이를 평균. 이 번호에서 버퍼 전용 컨트롤의 흡광도 판독 값을 뺍니다. 희석 인자 (예에서는 50)를 곱하면.
    2. μmol 단백질 당 발표 nmol의 파이를 결정합니다. 역학적 분석에서 각 시점에 대한 이들 값을 그래프로하여 적어도 R = 0.99 (도 1)의 선형 ​​발작을 수득한다; N 경우OT는 분석은 더 많거나 적은 단백질 또는 길거나 짧은 배양 시간이 조정될 수있다.
  4. nmol의 PI / 단백질 μmol / min으로 같은 결과를 원하는 경우, 또는 nmol의 PI / μg의 단백질 / 분 (3,도 2 등)를 나타낸다.

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결과

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T2S ATP 아제 EPSE의 생체 외 활동은 세포질 EpsL (EPSE-cytoEpsL)의 도메인과 산성 인지질 카디오 리핀 (12)의 추가와 함께 EPSE의 copurification에 의해 자극 될 수있다. 또한이 분석을 사용하여 단백질의 변이체 형태를 야생형 (WT)의 활성을 비교함으로써 ATP 가수 분해에 EPSE 특정 잔기의 역할을 결정하는 것도 가능하다. 여기서, EPSE 아연 결합 도메인에 두 개의 리신 잔기로 치환하는 효과가 K417AK419A EPSE-cytoEpsL 변이체를 정제 WT EPSE-cytoEpsL의 ATP 아제 활성을 비교함으로써 측정된다. 도 1에서, 포스페이트 방출은 1 시간 역학적 분석, 운동 ATP 아제 활성의 정확한 정량을위한 요구 사항에 걸쳐 선형 진행한다. 이중으로 세 번 분석하고 정량화 된도 1과 같은 정제 된 단백질 시료

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토론

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이 생화학 적 특성에 대한 정제 된 단백질의 생체 외 ATP 아제 활동 측정하는 일반적인 프로토콜입니다. 이 방법은 쉽게 최적화되어 있습니다; 예를 들어, 단백질, 완충 염 및 조성물, 온도, 및 상기 분석과 다양한 길이 (간격의 총 개수를 증가 포함) 간격의 양을 조절하는 활성을 정량을 향상시킬 수있다. 시판 말라카이트 그린 기반의 시약은 매우 민감, 무료 인산 소량 검출 할 수있다 (~ 100 μl의 50 pmol의). 따라서 분석의 민감도, 일회용 플라스틱 제품, 초순수, 완충제, 인산염 오염없는 시약을 사용하는 것이 중요하다. 단백질 정제 후, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토 그래피는 단백질의 순도를 향상시키고 불순물을 제거하기 위해 권고된다.

시험관 ATP 아제 활성이 약한 표시 단백질, 각성제 전자를 향상시키기 위해 반응에 첨가 될 수있다nzymatic 활동. ATP 아제 활성을 자극하는 많은 요소...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 RO1AI049294(M. S.에게)의 자금 지원에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HEPES 완충액FisherBP310-500
염화나트륨FisherBP358-212
염화마그네슘FisherBP214-500
아데노신 삼인산(ATP)FisherBP41325
96웰 플레이트(투명, 평면 바닥)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life SciencesBML-AK111선호 인산염 검출 시약. 주의: 자극성.
마이크로플레이트 리더BioTek Synergy 또는 유사한
Prism 5GraphPad 소프트웨어

참고문헌

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