척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에 Ciona intestinalis의

요약

우리는 Ciona intestinalis의, 미세 주입하고 전기 기술을 사용하여 척추 동물에 척색 자매 그룹에 과도 형질 전환 유전자 최저를 제시한다. 이러한 방법은 척색 머리 감각 상피, 인간의 질병 관련 유전자의 많은 orthologs을 포함한 척추 동물의 기본적인 특성, 기능이 단순한 무척추 동물에서 기능 유전체학을 용이하게한다.

초록

Simple model organisms는 발달 및 세포 분화 과정에 대한 생체 내 연구에 유용합니다. 현재 기존 무척추동물 모델 시스템의 인간과의 진화적 거리와 척추동물의 게놈 복잡성은 인간의 정상 및 병리학적 조건을 모델링하는 데 중요한 과제입니다. 척추동물 Ciona intestinalis는 척추동물과의 공통 조상에서 출현한 무척추동물 척추동물이며 무척추동물과 척추동물 사이의 경계면에서 특징을 나타낼 수 있습니다. 훨씬 더 단순한 세포 및 게놈 구성을 가진 일반적인 신체 계획은 척추동물 상태의 현상을 설명하는 유전자 조절 네트워크(GRN) 연결과 기능적 유전체학 판독값을 밝혀야 합니다. 분열이 적고 세포가 큰 고정된 배아 계통인 Ciona의 조밀한 게놈은 다재다능한 군집 도구와 결합되어 이 유기체에서 효율적인 유전자 기능 분석을 촉진합니다. 여기에서 우리는 척추동물과 가장 가까운 자매 그룹에 속하는 이 유망한 모델 유기체에 대한 몇 가지 중요한 방법을 제시합니다. 우리는 유전자 기능 및 게놈 조절 요소를 연구하기 위한 수단을 함께 제공하는 미세주입 매개 유전자 녹다운과 함께 전기천공법에 의한 일시적인 형질전환(transgenesis)을 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 유전자 조절 또는 유전자 기능 실험의 인실리코(in silico) 설계에 커뮤니티 데이터베이스가 어떻게 활용되는지에 대한 정보를 제공하기 위해 프로토콜을 확장합니다. 예시 연구는 Ciona와 인간 사이에 보존된 선택된 신경 요인의 상호 작용과 정량화에 대한 새로운 정보를 얻을 수 있는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 Ciona 접합자에서 DNA 전기천공에 따라 배아 세포에서 차등 세포 내 국소화의 예를 보여줍니다. 마지막으로, 새로운 유전자 편집 방법을 사용하여 조직 특이적 유전자 간섭에 적용할 수 있는 이러한 프로토콜의 잠재력에 대해 논의합니다. Ciona의 생체 내 접근법은 줄기 세포 연구, 약물 발견 및 후속 임상 적용과 관련된 맥락막 발달 프로그램에서 보존된 메커니즘을 밝히는 과정에서 고전적 모델 유기체의 주요 단점을 극복합니다.

서론

최근 게놈 서열 및 전사 유전자 레파토리 모형 유기체의 숫자에 접근하게되었다. 그러나, 유전자 기능 링크를 결정하고, 이러한 연결은 배아 시간 및 공간에 걸쳐 전사 활성을 실행하는 DNA에 하드 와이어되는 방법, 특히 척추 동물에서 주요 도전 남아있다. 특히 척추 동물에서 규제의 상호 작용의 복잡성과 게놈 ^1,2의 복잡성, 생체 내에서 DNA 수준에서 특히 효율적인 기능 분석을, 천천히. 사실, 더 GRN은 현재 개발 유기체의 마지막, 말기 차별화 된 상태로 수정에서 분석되지 않습니다.

멍게의 C. intestinalis는 전체 GRN이 가능하다 분석하는 모델 생물을 나타냅니다. 그것은 작은 유전자 중복과 무척추 동물의 전형 중복되지 않은 게놈을 보유하고 있습니다. 척추 동물은 반대로 근래 게놈 중복의 두 라운드를받은전자는 더 큰 유전자 가족과 기능 다양 화뿐만 아니라 paralogs 사이의 중복을 생성합니다. C. 컴팩트 시스 규정하는 서열 (GRNs의 제어 유닛) intestinalis, 그리고 몇 가지 세포와의 불변의 배아 계보는 C. 연상 간스. 또한, 척색 동물에서 척추 동물에 무척추 동물의 자매 그룹으로 독특한 계통 발생 위치는 형성 척색 몸 계획 ^3-6의 세포 해상도, 발달 관찰 할 수 있습니다.

모델 생물에서 기능 유전체학의 미래의 성공을 보장 중요한 문제는 양적 생체 섭동에 대한 배아 많은 수의 생성이다. Ciona 달걀 ^7의 마이크로 인젝션 법, 신속 Ciona 수백 생체 일렉트로 많은 일시적 형질 전환 동물을 얻을 수있는 가능성의 개발 ^{8,9 돌파구되었습니다} 접합자 Ciona 기능 유전체학. 여기, 우리가 처음 특히 산모의 성적 증명서의, 모르 폴리 노 (MO) - 매개 유전자 최저에 대한 선택의 방법을 유지 개별 유전자를 타겟팅 더 힘든 미세 주입 기술을 제시한다. MO 올리고는 일반적으로 개시 ATG 또는 RNA의 스플 라이스 사이트를 대상으로 단백질 번역을 방해. 우리는 이렇게 함께, 생체 내에서 조직 별 이득이 또는 함수 접근법 손실의의 증강 효율적인 분석의 길을 열고, Ciona의 수정란에 전기가 양적 방식으로 분석 할 배아의 많은 수를 허용하는 방법을 보여줍니다 동시 조작 및 분석에 대한 가능성. 우리는 더 Ciona 커뮤니티 도구가 규제 지역 및 발현 벡터 전체 오픈 리딩 프레임 (ORF를)의 효율적인 복제의 실리 예측에 활용하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 차동 세포 내 현지화가의 찬란 태그 보여또는 전기에 의해 과발현에 따라 단백질을 표시.

프로토콜

Ciona 계란과 접합체의 미세 주입 및 Electroporation에 1. 준비

1. 배아의 배양을 위해 HEPES (ASWH) 10 L 인공 해수를 준비합니다. 420 mM의 NaCl을, 9 밀리미터의 KCl을 녹이고, 10 mM의 염화칼슘 ₂ · 2H ₂ O, 24.5 밀리미터의 MgCl ₂ · 6H ₂ O, 25.5 mM의 황산 ₄ · 7H ₂ O, 및 2.15 mM의 _{증류수에서의 NaHCO3} (DDH ₂ O) 밤새 교반에 의해. 5 mM의 HEPES 산도 8.0을 추가하고 확인 / 8.0으로 pH를 조정합니다. 4 °의 C에서 ASWH를 저장합니다. 18 ° C로 예열하고 사용하기 전에 필터 종이를 필터링 할 수 있습니다.
2. 20 % 나트륨 티오 글리콜 레이트, ASWH의 1 % 프로 나제 ​​: 20 배 불 활성화 dechorionation 솔루션을 준비합니다. -20 ℃에서 500 μl의 분취 량을 저장하고 사용하기 전에 10 ㎖ ASWH의 최종 부피로 희석한다.
3. 계란 / 배아에 대해 15 ~ 20 문화 요리를 준비합니다. 1-2mm 얇은 층을 코팅, 3.5, 5, 9, 15cm 배양 접시에 ASWH에서 용융 1 % 아가로 오스를 따르십시오.아가로 오스는 응고 및 ASWH와 플레이트를 커버 할 수 있습니다. 1~2주 최대 4 ° C에서 그들을 재고. 사용하기 전에 ASWH를 교체합니다.
4. 특수 사출 요리를 준비합니다.
   1. 아가 5cm의 페트리 접시에 녹인 1 %의 5-7 mm 두께의 층을 붓고, 및 아가로 오스 고형화에 압흔을 생성하도록 (예를 들면, 플라스틱 커버 슬립에 접착 지퍼 잠금 폐쇄 됨), 아가 로스에 금형을 배치 그 계란을 보유 할 수 있습니다. 5 주입 요리에 4를 준비하고 ASWH으로 다룹니다. 4 ° C에서 저장하고 사용하기 전에 신선한 ASWH로 교체합니다. 주사 만 신선한 판 (최대 일일 세)를 사용합니다.
5. 6H ₂ O, 3 mM의 K _4의 Fe (CN)가 _6] · 3H ₂ O, 3 mM의 K _3의 Fe (CN)가 _6] 인산 완충 ₂ · 1 ㎜의 MgCl : β - 갈 락토시다 제 (LacZ를) 염색 버퍼를 준비 식염수와 트윈 (PBS) (PBT) (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 ₂ HPO _4, 2 mM의 _KH2PO4, 0.05 % 트윈). 저장 전n은 4 ℃에서 어둠. LacZ를 기판을 제조 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴의 ß-D-갈 락토 -20 ° C에서 40 ㎎ / ㎖의 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 저장 주식 분취 량의 (X-GAL, 10 U / ㎖)까지 용도.
6. 고집에서 배아를 방지하기 위해 수돗물 하룻밤에 파스퇴르 피펫을 만끽 해보세요.
7. 주사 바늘을 준비합니다.
   1. (415의 필라멘트 램프 시험에서), 75 속도 75 시간 (200)를 가져, 같은 열 (425)과 같은 조건에서 마이크로 피펫 풀러를 설정합니다.
   2. 일반적으로 팁에 마감 8-10 긴, ​​미세 바늘을 생산하는 5 필라멘트 함유 유리 모세관에 4를 당깁니다. 팁을 깨는 피하기 위해, 상승 된 지원에 접착 테이프를 두 배로 부착 된 먼지가없는 바늘 상자에 바늘을 저장하고 바늘 작성에 편리하다.
      참고 : (6 절에 설명 된대로) 녹색 중요한 염료와 몇 알을 주입하여 얻어진 바늘을 테스트하고 미세 조정 및 repetit 수 있습니다 팁 모양을 얻기 위해 조건을 당겨 바늘을 조정6.6에 기재된 바와 같이 주입 필자.
8. 주입 솔루션을 준비합니다. 2 mM의 MO의 1 μL, 10 μg의 2 μL로 구성된 예를 들어 주사 용액, 4 μl를, 준비 / μL 녹색 중요한 염료 1 μL의 DDH ₂ O. 0.05-0.5 μg의 / μL 출장의 mRNA 또는 실험 질문에 따라 플라스미드 DNA의 20 NG / μL의 최종 농도를 추가합니다. 잘 섞다. 이 솔루션은 mRNA에 포함되어있는 경우 얼음에 보관하십시오.

배우자 2. 컬렉션

1. 18 ° C에서 해부 Ciona 성인은 배아 방을 냉각. 작은 가위를 사용하고 좀처럼 듣기 어려운 측면의 사이펀 반대 끝에서 시작 (짧은) 사이펀하는 아래의 난관과 정자 덕트 런.
2. 난관을 노출하고 섬세하게 가위의 끝 부분을 사용하여 난관에 절개를합니다. 부드럽게 예를 제거 폐쇄 가위로 난관을 눌러 ASWH를 포함하는 6 웰 플레이트에 직접 유출되는 계란을 드롭GS. 파스퇴르 피펫 ASWH와 사전 세정과 나머지 계란을 전송합니다.
3. 다른 우물에서 다른 동물에서 계란을 입금. 해부 범위에서 계란 품질을 준수하십시오.
   참고 : 잘 개발 된 계란 색이 약간 노란색에 라운드 핑크입니다. 이들은 비 - 셀룰러 난황 코트 난자 주위에 잘 정의 된 난황 주위 공간을 형성 융모막에 의해 둘러싸여있다. 융모막은 바깥에서의 내부와 별 모양의 여포 세포에서 테스트 세포와 연결되어 있습니다. 낮은 품질의 계란은 종종 난황 주위 공간 또는 뿌리 세포 부족하다. 그들은 적은 라운드,보다 세분화 또는 색상이 다른 나타납니다. 미성숙 난자는 작은 은색 흰색 색상을 가지고있다.
4. 가위와 정자 덕트를 잘라 별도의 파스퇴르 피펫을 사용하여 1.5 ml의 튜브에 집중 정자를 수집합니다. 다른 동물에서 (적어도 2 개) 같은 튜브에 정자 수영장. 몇 일 동안 4 ° C에서 보관 정자.

삼.수분

1. 2 단계에서 설명 된 바와 같이 18 ° C에서 정자와 난자를 수집합니다.
2. 정자를 활성화합니다.
   1. 1.5 ML 튜브에 1 ㎖의 ASWH을 준비하고 1 M 트리스 산도 9.5의 50 μL와 혼합. 그런 다음 농축 정자의 20 μl를 추가하고 부드럽게 튜브를 반전하여 섞는다.
   2. 작은 페트리 접시의 커버 또는 유리 슬라이드에 배치 정액 한 방울의 정액 활성화를 확인하고 해부 범위에서 관찰한다. 정자 미친 듯이 수영을해야합니다.
3. (100과 1,000 개의 알을 포함) 계란의 각 웰에 활성화 된 정자 액의 100 ~ 200 μl를 추가, 위아래로 피펫 팅하여 잘 혼합, 그래서 계란 매체에 떠있다. 배아를 이동하지 않고 10 분 동안 기다립니다.

계란과 배아의 4 Dechorionation

1. ASWH 10 ml의 20 배 dechorionation 용액 500 μL 나누어지는을 희석. (2) 200 ㎕를 적가 추가하여 dechorionation 솔루션을 활성화합니다.10 ml의 1 배 dechorionation 용액에 5 M 수산화 나트륨. 우유 침전물을 형성 할 것이다. 부드럽게 튜브를 반전하여 섞는다.
2. 계란 또는 접합자를 수집 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리 튜브로 (10 분 후 단계 3.3에서 대기). 하나의 튜브 (1,000-5,000 주변 계란 / 튜브)에 2 ~ 3 동물에서 계란을 풀. 20 초 동안 고속 (1,200 XG)에서 회전함으로써 손을 원심으로 침전물 튜브의 아래쪽 배아 펠렛을 형성한다. 천천히 원심 분리기를 중지하고 파스퇴르 피펫으로 ASWH를 제거합니다.
3. 각 튜브의 펠렛 계란 / 접합체를 활성화 dechorionation 솔루션의 4 ML을 추가합니다. 부드럽게 그들을 피펫 팅에 의해 작은 고무 배를 얹어 수돗물 처리 파스퇴르 피펫을 사용하여 아래 계란 / 접합자를 일시 중단합니다. 이 솔루션은 1 ~ 3 분 후에 황색을 설정해야합니다.
4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 dechorionating 계란 / 접합자 현탁액의 작은 나누어지는을 제거하여 dechorionation를 따르십시오. 슬라이드에 방울을 증착하고 해부들에서 관찰코프. 위, 아래 계란 / 접합체를 피펫 팅 유지하고 모든 20 ~ 30 초를 확인합니다.
   참고 : 먼저 모낭 세포를 분리 한 후 융모막 노란색과 불투명 한 변, 그리고 마침내는 접합자에서 분리합니다. 핑크 계란 / 접합체는 유리 튜브의 바닥에 가라 앉을 것이다 dechorionated. dechorionation은 최대 밖에 걸리지 않습니다. 5 분.
5. 계란의 50 % / 접합자가 dechorionated되면 ASWH로 튜브를 입력합니다.
   참고 : 약 10 ~ 15 초는 dechorionated 계란 / 배아를 침전에 충분한 매우 낮은 속도에 대응 (8 XG) 매우 부드럽게 원심 분리기. 튜브의 하단에 계란 / 접합자의 펠렛을 교란하지로 천천히 원심 분리기를 중지합니다.
6. 불완전 dechorionated 계란 / 접합자와 부유 물질을 포함 유리관에서 거의 모든 액체를 제거하고 ASWH로 교체합니다. 천천히 씻어 부드럽게 단계 4.2에서와 같이 다시 원심 분리 아래로 피펫합니다. 접합자는 중력에 의해 아래로 정착하기위한 대안으로, 기다립니다. 더 융모막 파편이 난 없을 때까지 한 번 더 씻어EFT.
7. 전송 계란 / 접합자 갓 파스퇴르 피펫을 사용하여 배양 접시를 세척합니다. 저밀도의 접합자 (안 계란)을 유지 (10cm 접시 당 200 배아의 주위에) 함께 자신의 부착을 방지 할 수 있습니다. 문화 (13)와 20 °의 C의 온도에서 원하는 단계의 배아. 대안 적으로, 상기 접합체 (5 단계) electroporate 또는 미 수정 달걀 (단계 6)을 주입.

5. Electroporation에

1. 계란을 기름지게 및 섹션 3과 18 ° C에서의 접합자를 dechorionate 및 4. 전기 샘플 당 50 ~ 400 알을 제공합니다.
2. (50 μL DDH ₂ O에서. 최대 100 μg의 플라스미드 DNA)를 1.5 ml의 튜브에 50 μl의 플라스미드 DNA를 준비하고 200 ㎕의 0.95 M 만니톨을 추가합니다. 텍싱에 의해 잘 섞는다.
3. 파견 중력은 실리콘 처리를 1.5 ml의 튜브에 dechorionated 접합자를 침전. 튜브에 100 ㎕의 표시로 ASWH을 제거합니다.
4. 다음과 같이 각 접합자 관에 대해, 연속, 진행 : 추가파스퇴르 피펫을 사용하여 DNA / 만니톨 솔루션입니다. 부드럽게 접합자와 혼합하고 즉시 4mm의 전기 큐벳에 DNA / 만니톨 / 접합자 서스펜션 및 전송을 차지합니다.
5. 일렉트로 홀더에 즉시 큐벳을 놓고 50 V. 16 밀리의 단일 펄스를 제공
6. 같은 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳의 접합자를 제거하고 신선한 여과 ASWH을 포함하는 배양 접시에 그들을 밖으로 확산. 그들이 18 ° C에서 약 1 시간 게시물 수정 (HPF)를 절단 시작하기 전에 접합자를 피펫.
7. ASWH의 비커에 샘플 사이의 피펫을 씻어.
8. 문화 10cm 접시 당 약 200 배아의 충분히 낮은 밀도에서 15 ~ 20 °의 C에서 접합자 함께 자신의 부착을 방지 할 수 있습니다.

6. 미세 주입

1. 주입을위한 Dechorionated 계란을 준비합니다.
   1. 섹션 4에 설명 된대로 2-4 동물, 별도로 계란을 Dechorionate 미 수정 및 dechorionated 전자 유지별도의 작은 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에서 GGS. 파편을 제거하기 위해 요리에 계란을 여러 번 씻으십시오.
   2. 테스트는 각 개인으로부터 (50 주위)에 dechorionated 계란의 작은 배치를 비옥. 각 배치에 대해 별도의 5cm 접시를 사용하여 2 μL를 활성화 정자 (단계 3.2)를 적용합니다. 요리 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 옆으로 요리를 이동하여 접시에 달걀을 확산. 이동하지 않고 약 10 분 동안 정자와 계란을 함께 보관하십시오.
   3. 다음과 같이 정자의 최대 제거 : 신선한 ASWH 회 새로운 배양 접시에 수정란을 전송하거나 씻어. (약 3 시간 후 수정을 위해 18 ° C에서) 32 세포 단계까지 교란 클 리빙 배아를 남겨주세요. 마이크로 인젝션에 대한 개발 최적의 배치 (수정의 가장 비율이 가장 일반 절단 패턴)에서 계란을 선택합니다.
2. 주사 바늘을 설정합니다.
   1. FL 중력 수 있도록 수직으로 4 주사 바늘을 백필필라멘트를 따라 흐름. 니들 팁 아래에 위치하는 바늘의 후단 녹색 중요한 색소를 함유하는 0.5 μL 입금 주사액 (단계 180). 맨 아래에있는 바늘 끝을 채우기 위해 액체 기다립니다.
   2. 수평으로 바늘의 위치를 ​​변경하고 좋은 긴 금속 또는 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 미네랄 오일로 백필. 천천히 바늘을 작성하는 동안 모든 공기 방울을 배출하기 광유와 주사액을 오버레이.
3. 설치 18 ° C에서 미세 조작기는 방을 냉각.
   1. 미네랄 오일로 채워진 10 mL 유리 주사기 바늘 홀더의 플라스틱 배관을 연결한다. 튜브와 석유 바늘 홀더 백필 및 기포 배출.
   2. 바늘 홀더에 바늘을 삽입하고 미세 조작기에 홀더를 배치합니다.
   3. 표면에 45 °의 각도에서 직선을 따라 바늘 홀더의 이동을 조정한다.
4. dechoriona의 방향계란을 해부 현미경으로 하나 하나 분사 될 수 있도록 분사 접시의 아가 압입 따라 테드 알.
5. 필요한 경우에 대해 부드럽게 아가 또는 아가로 오스 상에 배치 된 유리 커버 슬립의 조각에 대해 바늘을 눌러, 바늘 끝 브레이크. 약간 바늘 끝이 열려 (녹색 바늘 내용이 추방 것)인지 확인하기 위해 주사기의 손잡이를 압력.
6. 먼저 계란에 니들을 도입 약간 주입 하였다 계란 막 침입하여 한 흡입하여 미 수정 계란을 주입한다. 셀 직경의 1/3 최대 계란의 중앙에 녹색 주사액을 주입한다. (이 140 ㎛, 계란 지름 약 30 (PL)에 해당한다).
7. 새로운 배양 접시에 주입 된 미 수정 난자를 전송하고 수정 될 때까지 15 ~ 18 ℃에서 그들을 품어.
8. 테스트 fertilizations (단계 6.1.2)에서와 같이 갓 활성화 정자 주입 된 계란을 기름지게. Eliminat새로운 배양 접시에 접합자를 전송하여 정자의 개 최대. 배아를 확산하고 (32 세포 단계까지) 절단 단계 동안을 교란하지 않습니다.
9. 배양 13, 20 ° C 사이의 온도에서 이루어지는 원하는 스테이지 배아.
10. 판의 가운데로 소용돌이와 실리콘 처리 1.5 ml의 튜브로 전송하여 배아를 수집합니다. 수정 및 얼룩, 또는 마운트 (단계 7, 8).
11. 제어 주입 된 배아를 획득 표현형을 비교합니다.
    참고 : 동일한 표현형을 획득하기 위해 동일한 증명서를 대상으로 제 2의 비 중첩 MO 주입한다. 수정의 mRNA가 관심의 단백질을 코딩하지만이 MO들에 의해 인식되지 않습니다으로 특정 MO 표현형 (들)을 구출. 더 표현형을 제공하지 않는 제어 MO를 주입한다.

7. LacZ를 염색

1. 실리콘이 1.5 ml의 튜브에서 원하는 단계에서 배아를 수집하고 15 일 ml의 ASWH에서 0.2 % 글루 타르 알데히드에 오류를 수정30 분 최대.
2. 워시 배 1 ml의 1 배 PBT 10 분.
3. 500 μL LacZ를 염색 버퍼에 한 번 씻어. X-걸 기판 보충 1 ml의 염색 버퍼를 장착합니다 (10 μL / 40 mg을 ml의 사용 / ㎖ X-갈 주). 염색을 더 잘 관찰 12 웰 플레이트에 배아를 전송합니다.
4. 어둠 속에서 품어. 0.5 시간에서 배양을 변화 밤새 4 ° C에서, LacZ를 표현 드라이버의 강도에 따라 실온에서 또는 37 ° C에서.
5. 얼룩 버퍼를 제거하기 위해 1 ㎖의 1X PBT에서 4 회에 배아를 씻으십시오.
6. 포스트 픽스 2 % 파라 포름 알데히드 용액에 1 (PFA) 1X PBT 또는 염색 배아 해석 및 시각화 1 ㎖의 1X PBT에서 0.2 % 글루 타르 알데히드로 상온에서 10 분 동안.

찬란 레이블 된 Wmbryos 8. 장착

1. 1 ml의 ASWH에서 2 % PFA에서 20 분 동안 원하는 발달 단계의 배아를 수정합니다.
2. 배아는 1 ml의 1 배 PBT에 2 배 씻으십시오. 어떤 조명 박람회를 피하십시오어두운 조건에서 배아를 유지하여 URE.
3. 하나의 슬라이드에 50 배아까지 전송합니다. 종이 타월로 먼저 피펫 조심스럽게 PBT 최대를 제거합니다.
4. 20 ~ 25 μl를 장착 매체를 추가합니다.
5. 샘플이 덮여 때까지 거품을 피할 뾰족한 물체 (바늘, 핀셋, 피펫 팁)로 낮은 천천히 (첫 번째 측면에서) 각도에 위치하고하여 커버 슬립을 추가합니다. 투명 매니큐어의 점을 사용하여 모서리에 커버 슬립을 수정합니다.
6. 건조 후 매니큐어와 전체 coverslip에 인감. -20 ° C에서 어둠 속에서 보관하십시오.

결과

유전자 조절 네트워크 연구를위한 미세 주입

멍게의 배아는 Ciona intestinalis의 세포 계보 수준에서 유전자의 기능 또는 유전자 조절 연구 및 셀룰러 해상도로 적합하다. 의 mRNA 모스 또는 레이블은 미 수정 난자에 또는 수정 다음 각각의 할구에 미세 주입 할 수있다. 마이크로 인젝션 기술을 사용하여 유전자 녹다운 MO 매개 6. MO들 특별히 선택된 유전자의 mRNA를 표적 단백질에 자신의 번역을 방지 단계에서 설명한다. MO 전체 배아 GRN ^(10)에 살짝 공개, 손실의 기능 하류 유전자의 광범위한 배열의 발현을 변경 발달 유전자의 (LOF)을 매개. Ciona에서 이러한 분석은 후생 동물 ^(11)의 첫 번째 전체 배아 규제 청사진을 제공했다. 1 표시를하는 방법 microinjecti의 예를 그림에는 Ciona 배아의 낭배 단계에서 보존 CI -Myelin 전사 인자 (CI -MYT)의 발현의 상류 조절을 연구하기 위해 사용되었다. 현장 하이브리드 (ISH), (그림 1a '에 도식화 그림 1a) 내생 적 표현에 의해 모니터링 특히 뇌, 6 행 신경 판 전구체에서 관찰된다 (행 빨간색 III / IV)와 척수 ( 녹색 행 I,). 또한, CI -MYT 상류 규제 표현 또는 C1 -MYT 발현 개시 (도 1b-g)에 앞서 신경 전구체에 인접하는 몇 가지 요소를 대상 MO 주입하여 분석 하였다. 예 Forkhead 상자 Aa의 조기 배아 요인 MO 녹다운이 (FoxA-a) (각각도 1B 또는 1C) 전사 인자 및 섬유 아세포 성장 인자 9/16/20 (FGF9은 / / 20 (16)) 전체 CI -MYT 없어 표현. 다른 전사 인자부분적으로 만 (그림 1D, F 및 G에 파란색 화살표 머리) 뇌 전구체의 부분 집합에 MO-매개 하향 조절의 결과로 CI -MYT 발현에 영향을 미칩니다. 반대로, CI의 -MYT 식 ectopically 마디가 일반적으로 이러한 측면 신경 코드 전구체에 CI의 -MYT 식을 억압 것을 제안, 마디 (그림 1E, 빨간색 화살표 머리)의 하향 조절에 활성화됩니다.

효율적인 유전자 기능과 증강 연구를위한 전기

Ciona의 접합체에 플라스미드 DNA의 전기가 일시적 형질 전환 및 생체 내에서 표현형의 변화 이후의 관찰을위한 효율적인 방법이다. mRNA를 미세 주입과는 달리, 전기 유전자 코딩 영역 (ORF를, 오픈 리딩 프레임) 제어로 표현되는, 조직 특이 적 과발현 수 있습니다조직 특정 드라이버. 다음은 일반적으로 (예 : 척색 전구체 ^8의 발현에 대한 brachyury 증강 등) 잘 알려진 유전자의 시스 규정하는 영역을 구성한다. 리포터 유전자 (LacZ를 또는 녹색 형광 단백질, GFP)이 생체 내에서의 활동을 공개 곳 반대로, 전기는 새로운 규제 지역의 효율적인 분석을위한 수단이다. 식별 및 새로운 규제 영역의 후속 전기 매개 분석 (CI -MYT에 대한)에 대한 워크 플로는 그림 2에 표시됩니다.

현장 발현 및 발생 학적 데이터 (열매) ^(23)에 대한 멍게 네트워크 등 멍게 특정 게놈 브라우저 ^{12, 13,에} 쉽게 접근 할 Ciona 커뮤니티 데이터의 광대 한 ^{레퍼토리는} 조절 영역 (그림 2A)의에 실리 식별을 위해 검사합니다. 후속 중합 효소 연쇄 반응 (P발현 벡터로이 지역의 CR)을 기반으로 복제가 생체 내에서 전기 매개 테스트 할 수 있습니다. (그림 2B). 그림 2A의 게놈 브라우저 스크린 샷 (오렌지, 처음 세 개의 엑손, 2 개의 인트론은 볼 수 있습니다) CI -MYT에 대한 KH 성적 증명서 모델의 상류 지역을 보여줍니다. 다른 게놈 브라우저 트랙 기능 게놈 데이터는 크로 마틴 면역 침강 (칩) (여기 ZicL, 소뇌 (L)의 CI - 아연 손가락에 대해 표시) 데이터 ^(14), 두 개의 관련 Ciona 종 ^15,24 또는 뉴 클레오 사이의 순서 보존으로,이 지역에 대한 예측 주석 점유율 ^{16, 17} (위에서 그림 2A에서 아래로). 일반적으로, 엑손 단백질 코딩 영역은 매우 (그림 2A에 정렬 트랙) 보존된다. 추가 높은 보존 피크는 상류 비 코딩 지역에서 첫 번째 인트론에 나타납니다. 이 중 두 뉴 클레오 무료로 예측전사 인자에 접근을 제안 시퀀스 기반의 알고리즘 ^{(16, 17)} (그림 2A 빨간색 프레임)에 ccording. 실제로, 결합 CI -ZicL 전사 인자에 대한 칩 - 온 - 칩 신호 ⁽¹⁴⁾ (그림 2A 녹색 막대)이 두 보존 지역에서 농축된다. 또한, 잠재적 인 전사 인자 결합 부위를 검색 인터페이스 ^(25)를 사용하여, 우리는 CI -ZicL 칩 클러스터 (밑줄 ZIC 코어, 그림 2A 오렌지 화살표와 시퀀스)로 표시 게놈 서열에 위치한 ZIC 사이트를 확인했다. CI를 -MYT의 자유 규제 영역은 예상 ZicL (그림 1D)를 대상으로 MO-주입 매개 최저 실험에서 관찰 된 CI -MYT 식의 하향 조절에 부합되는 뉴 클레오 보존에 CI -ZicL 전사 인자의 결합합니다.

후 저지CI -MYT의 표현 인 실리코 가능성 시스 규정하는 지역 광산, 이들은 PCR Ciona 게놈 DNA로부터 증폭 ¹⁹ 플라스미드 LacZ를 리포터로 복제 재조합에 의해 삽입됩니다. 구조는 수정 된 Ciona 계란 (그림 2B)로 전기 천공 및 LacZ를 염색하여 자신의 활동 (그림 3)에 대한 분석된다.

그림 3은 실리 방식에서 이러한하여이 CI -MYT mRNA 발현 도메인을 (그림 1a 비교) 요점을 되풀이 두 개의 시스 규정하는 순서를 식별 가능하다는 것을 보여줍니다. 일반적으로, 일시적으로 형질 전환 배아는 DNA를 통합 한 경우에만 그 세포의 플라스미드 DNA 쇼 모자이크 식 전기 천공. 모자이크 LacZ를 발현 따라서 pmyt-R3에 의해 구동되고, 또한 CI 표현 모든 전구체에서 발견 될 수있다 그림 3a, B, 보라색과 빨간색 화살표 머리)에서 III / IV. 반면, pmyt-R5는 후방 (행 I) 신경 판 전구체 및 이후 neurula 단계 (도 3c, 빨간색 화살표 머리)에서 시작에 적극적이다. 두 영역은 따라서 CI-MYT의 유전자 조절의 두 개의 분리 된 공간 및 시간 측면을 인코딩. 흥미롭게도, 모두 조절 영역도 (각각 그림 3a, B, 분홍색, 흰색, 노란색 화살표 머리) 특히 전방 및 측면 신경 판과 근육에서 ISH에서 볼 수없는 추가 전구체를 얼룩. 이러한 폭 넓은 표현은 (측면 신경 운명을 억압 같은 결절에 대한 같은 그림 1E 참조) 격리 된 규제 조각에 포함되지 않은 요소를 억압 가리 축적 검출 낮은 발현 수준을 나에게있다LacZ를 효소 신호.

인핸서 연구 외에 Ciona에서 일렉트로은 또한 과발현 Ciona 코딩 유전자의 기능 분석을 용이하게한다. Ciona 전체 길이의 ORF의 대규모 컬렉션은 지역 사회에 사용할 수 있으며, 또한 질병 관련 유전자 ^(18)를 포함하여 인간의 orthologs에 대한 주석 하였다. 개별 유전자 또는이 재결합 복제 호환 전체 ORF cDNA 라이브러리 (그림 2B)에서 유전자 그룹은 쉽게 배아에서 표현 될 수있는 적절한 드라이버를 포함하는 대상 벡터로 전송됩니다. 결과 표현 클론이 또한 시스 규정하는 기자와 공동 전기 천공 될 수있다하여 증강 활성화에서의 추정 역할을 테스트하기 위해 구성한다.도 2b는 전사에 대한 전체 ORF 클론의 분리를 설명하는 CI -ZicL 및 C1 내지 GATAa과 recombinatio 요인n은 이러한 초기 팬 - 외배엽 식 ^(15)에 대한 가타 규제 지역 (pfog 드라이버)의 친구로 번역 태그 ⁽¹⁹⁾ (예를 들어 녹색 형광 Venus- 또는 바이러스 헤 마글 루티 닌 (HA) -tag) 및 조직 특정 드라이버를 포함 할 수있다 적용 대상 벡터에 본 연구에 사용. 외배엽과 신경 외배엽 조직에서 CI -ZicL 과발현의 효과는 pmyt-R3> LacZ를하고 pmyt-R5> LacZ를 기자의 공동 전기 (그림 3b ', B'및 C ', C', 각각)에 의해 분석 하였다. 우리 전기의 분석 및 'B'와 C를 CI -ZicL이 pmyt-R3를 통해 CI -MYT 발현을 활성화 할 수 있으며, 두 기자의 구조로 pmyt-R5 인핸서 영역은 외배엽 지역에서 자궁외 LacZ를 표현 (그림 3b 녹색 화살표 머리를 보여 주었다 제안# 39;, C ''). 도 3d에 도시 한 바와 같이, Ciona 계란의 수백 플라스미드 DNA의 전기는 농도 의존적, 팬 - 외배엽 CI -ZicL 식에 자궁외 pmyt-R3> LacZ를 표현에 대해 설명 발현 변화의 통계적으로 관련 정량화 수 있습니다.

생체 세포 내 현지화 전기

(도 2b에 도식화) 적응 식 구조를 사용 외배엽 할구의 전기에 나타내면도 4는 태그 전사 인자의 세포 내 위치 파악을 나타낸다. 금성 태그 (도 4b) 또는 HA-태그 (도 4c)와 외배엽 조직에서 그들을 과발현과 (예 : CI -GATAa 등) C-말기 태그 전사 인자 (pfog으로) 우리는 전사 인자에 대한 예상대로 금성 식 세포질을 포함하여, 유비쿼터스 반면 생체 내에서 'CI -GATAa 대부분, 핵에 지역화 된 것을 관찰 할 수있다. 유사 실험은 아마도 다른 태그와의 공동 현지화를 공개, 개인 또는 전사 인자의 조합으로, 시간이 지남에 따라 세포 내 지역화의 역학을 연구하기 위해 수행 될 수있다.

그림 1 :. (WT) 및 모르 폴리 노 (MO)에서 Ciona 계란에 미세 주입에 의해 CI의 -MYT 규제 평가 CI -MYT mRNA의 발현은 배아를 주입. 신경 판에서 CI -MYT의 (a)는 WT 발현 패턴입니다. (A ') 신경 판 (NP)에 스테인드 전구체의 도식 표현. 행 I / II : 후부 신경 운명; 행 III / IV : 전방 신경 운명; 행 V / VI : 촉수 운명. ( .. g> B - g) 이마이 등에서 적응 초기 Ciona GRN (사진에 참여 표시된 유전자를 쓰러 뜨린위한 다양한 수법의의 미세 주입시 CI -MYT 식, 2006) ¹¹ CI -MYT, CI 전사 인자 -myelin; WT, 야생형; 푸른 화살촉 : CI의 -MYT 신호의 손실; 빨간색 화살촉 : 자궁외 CI -MYT 신호. = 100 μm의 모든 이미지를 참조 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 실리 증강 영역의 검색 및 재결합에 Ciona 배아에서 전기에 의한 일시적인 형질 전환을위한 복제에 대한 워크 플로 (A)가 시스 ⁽²³⁾ ASCI에서 스냅 샷.MYT - 다이애나 게놈 브라우저는 CI의 상류 조절 서열을 식별합니다. 레드 프레임, 두 개의 잠재적 인 시스 규정하는 지역을 표시 pmyt-R3 (scaffold_196 : 76883..77079) 및 pmyt-R5 (scaffold_196 : 75856..76041) 전기 분석을 위해 선정되었다. 트랙의 이름 : ZicL 프로브 : 칩 - 온 - 칩 데이터 ^(14); KH2012 성적 증명서 : Ciona는 성적 증명서 모델을 intestinalis; 정렬 점수 CS / CI LastZ : Ciona의 savignyi (CS) / Ciona intestinalis의 (CI) ^15,24 사이의 순서 보존; . 시걸 2006 뉴 클레오 점유율 버전 1 예측이 : 시걸 등 계산 알고리즘 훈련 병아리를 2006 년 ¹⁶ Khoueiry과 CI에 적용되는 등 2010 년 ¹⁷ 녹색 막대 :.. CI -ZicL 칩 ^(14)을 피크; 주황색 화살표 : ZIC 사이트 예측; GCTG : 코어 ZIC 결합 부위. 싸이언에서 과발현 구조를 생성하기위한 (B) 방식. 이후 생체 판독 CI에 대한 (예 : pmyt-R3> LacZ를 또는 pmyt-R5> LacZ를 같은) 기자 구조와 공동 일렉트로 조직 특정 드라이버 (pfog) 및 단백질 태그를 포함한 대상 벡터에 재조합 전체 길이 ORF cDNA 라이브러리 - MYT, CI -myelin 전사 인자; CI -ZicL, 소뇌 L 전사 인자의 CI - 아연 손가락;. pfog, GATA의 CI -Friend의 규제 영역 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

. 그림 3 : 중간 gastrul에서 CI -MYT LacZ를 스테인드 배아의 CI -ZicL 유도 시공간 시스 -regulation을 보여주는 전기 천공 Ciona 배아A (MG) / 늦은 낭배 (LG) 또는 이른 neurula (EN) 단계는 그 어느 pmyt-R3> LacZ를 또는 pmyt-R5> LacZ를 및 제어 구조 (pfog> mCherry) 또는 pfog와 공동 전기 천공 된 도시> ZicL. pfog 드라이버 ^(19)는 외배엽 및 neuroectoderm에 이소성 (팬 - 동물) ZicL 식을 매개 이들 세포에서 자궁외 LacZ를 얼룩을 발생합니다. MG / LG 단계의 배아 (작은 화살촉, 왼쪽 패널) 또는 대응 색깔의 개략적 인 지역에서의 (a) pmyt-R3 LacZ를 활동 (파란색 동그라미, 오른쪽 패널); 식물보기 (VG). 행 I / II : 후부 신경 운명; 행 III / IV : 전방 신경 운명; 행 V / VI : 촉수 운명. A의 같은 조직에서 욕실 단계에서의 (b) pmyt-R3 활동. CI -ZicL 공동 전기시의 (b ') 자궁외 pmyt-R3 활동은 녹색 화살촉으로 표시됩니다. (나 '') B에서와 동일 배아 '중심의 동물 극까지 (AN). ( (C ') CI -ZicL 공동 전기시 자궁외 pmyt-R5 활동에서 다) pmyt-R5 LacZ를 활동은 녹색 화살촉으로 표시됩니다. (다 '') C에서와 동일 배아 '하지만 중심의 동물 극까지 (AN). CI -ZicL 대표적인 실험의 (d)에 정량 낮은 농도에서 pmyt-R3 활성화를 통해-. 하나의 생물 반복이 표시됩니다 CI -MYT, CI -myelin 전사 인자;. CI -ZicL, 소뇌의 L 전사 인자의 CI - 아연 손가락, CI -FOG, GATA의 CI -Friend을; WT, 야생형; MG, 중간 낭배; LG, 후반 낭배; EN, 초기 neurula; AN, 동물보기; VG, 식물보기; NLS LacZ를, LacZ를위한 핵 지역화 신호. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 :. 비너스 - 태그 또는 Hemagglutinin- (HA)의 전기 현지화에 따라 단백질의 차동 세포 내 현지화는 pfog 드라이버 ^(19)를 사용하여 외배엽 세포에서 과발현 단백질을 -tagged. (A - C) DIC 이미지. 형광 이미지를 대응 (A ', B'). TRITC와 면역 조직 학적 표지에 형광 이미지를 대응 (C '). 스케일 바 = 100 μm의 모든 이미지를 의미한다. DIC, 미분 간섭 대비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

RNA 또는 DNA와 DNA의 전기의 미세 주입 : 유전자 변형 Ciona 배아를 생성하는 두 가지 방법이 있습니다. Ciona 배아의 유전자 교란에 대한 이러한 기술은 먼저 1990 년대 ^7,8에서 사용되는 다음에서에 연속적으로 개선, 지금은 전 세계적으로 Ciona (및 기타 멍게의 장군) ^(20)에 사용되었다.

프로토콜의 중요한 단계

쉽게 성인 동물로부터 수집 Ciona의 배우자에 성공 형질 전환은 중요한 요소의 수에 따라 달라집니다. 배우자의 품질 (성인 2 ~ 4 주 동안 건강을 유지 올바른 염분에 위치) 수족관에서 바다 수질에 (물 온도와 산소로 변화, 북부 대서양에서 일반적으로 월 ~ 12 월)에 산란 시즌에 따라 달라집니다 , 그리고 마지막의 다양한 단계는 아래에 설명 된대로 성인에서 추출시 배우자의 올바른 취급에실험 계획안.

준비 단계 동안, 수돗물로 파스퇴르 피펫을 배양하는 아가로 오스에서 출시 유해 물질을 제거 고집하고 아가로 오스 - 코팅 배양 접시의 해수 사전 배양에서 배아를 방지 할 수 있습니다. 일반적으로, 식기는 세균 성장을 피하기 위해 4 ℃에서 보관 사용 전 이주, 최대 제조 될 수 있으며, 사용 전에 세정 갓. 옛날 어느 날, 작은 접시는 주사를 위해 최선을 보인다.

dechorionation의 효율성과 길이는 발전을 해칠 계란 / 배아의 장기 치료와 프로토콜의 중요한 단계입니다. 주의 깊은 준비 (아무 흔들림) 및 (최대 일주 4 ° C에서) 정확한 기억은 dechorionation 솔루션의 품질을 유지. 어느 긴 시간 / 일 동안 실온에서 유지 특히 경우, 제제 또는 시간 경과에 너무 격렬하게 혼합하면 용액 프로테아제 효율을 잃는다. 우리는 편리 신선한 dechorionation 솔루션을 사용하여이 중요한 단계를 최적화 한20 배 원액의 냉동 분취에서 준비했습니다.

피펫은 해로운 반면 깨지기 쉬운 dechorionated 계란 / 배아의 올바른 취급 필수 및 전단 또는 배아의 찔러입니다. 피펫, 배아는 정지에서 수평이 아닌 수직으로 유리 피펫을 누른 상태에서, (부드럽게 부드러운하지만 빠른 피펫 다음에 그들을 소용돌이 액체를 '불어'에 의해) 가능한 한 많이 유지합니다. 이러한 치료는 세척, 재 부유하고 알을 전송하기위한 모든 피펫 단계에 적용 / 배아 및 튜브, 큐벳 또는 접시, 중 전과 고정 후입니다. 고정 배아 대 라이브는 고정 제의 유적에서 어떤 독성을 방지하기 위해 고정시 특별한주의는 별도의 피펫 팅 장치에주의해야한다.

미세 주입으로 인해 작은 크기와 난황 막의 탄성에 Ciona 계란 / 배아에서 다소 까다 롭습니다 비판적으로의 최적화 팁 크기에 따라 달라집니다주사 바늘, (계란 반경을 따라 한 줄에 바늘 이동) 주입의 완벽한 각도와 (주입을위한 사전 열망에 흡입에 의해) 난황 막의 미세 조정, 수동 속보입니다. 기포가 완전히 흡입 / 분사 압력을 평활화 광유를 포함하는 주입 튜브로부터 제거되는 경우, 후자는 가능하다. 또한, 먼지 나 부스러기 계란의 작은 조각 바늘을 방해 할 것이며, 쉽게 깨끗한 작업 환경 사출 접시에 전송하기 전에 계란 세정 공정에 의해 회피된다. 포스트 분사는, 신선한 요리 위에 계란의 전송은 사출 과정에서 살아남은 데없는 죽은 배아에서 독성을 방지 할 수 있습니다.

문제 해결

절차에 잠재적 인 문제는 다음 방법에 의해 해결 될 수있다. 낮은 수정률이 부족 정자 활성화, 낮은 계란 청결 또는 큰 수정 볼륨에서 발생할 수있다. freshl 사용y를 풀 적은 정자를 희석. 활성화시 정자의 움직임을 확인합니다. 단계 4.2에 설명 된대로 이전에 수정에 ASWH와 계란을 씻으십시오. 물 볼륨을 줄이고 / 잘 시비 접시 당 계란의 양을 줄일 수 있습니다. 제조 단계 동안 잃어 배아보다 효율적 undechorionated 계란 / 배아 아래 원심 분리기 dechorionation 용액 한 방울을 첨가하여 피할 수있다. Dechorionation 시간이되지 침전물과 연장 dechorionation은 독성이 배아가 폭발하는 원인이됩니다 부분적으로 dechorionated 계란으로 최적화해야한다.

비동기 개발 해부 동안 방출 잔류 정자에서 발생할 수있다. 통제되지 않은 교차 ​​수정을 방지하기 위해 다른 동물로부터 분리 된 계란 배치를 유지합니다. 이상 개발은 여러 가지 원인이있을 수 있습니다. 시작과 계절의 끝에서 분리 된 다른 개체의 배아를 유지 한 후, 최적의 배치가 선택 될 수있다. 의 배아를 방해하지 마십시오수정을 따라 10 분은 ooplasmic 분리를 방해 방지 할 수 있습니다. 피펫이 부분 배아에서 자매 할구과 결과를 분리로 전송되는 동안 배아 분할이 시작되지 않았 음을 확인합니다. 다 수정을 방지하기 위해 dechorionated 계란 적은 정자를 사용합니다. 갓 준비하지만 세척 아가로 오스 요리를 사용합니다. 피펫 장치가 정착이 없는지 확인합니다. dechorionated되지 않고 중단 된 단계 개발을 감지하는 전기 천공되지 않은 제어 배아를 유지합니다. 오염 및 분해가 발생하는 경우 항생제로 배아를 보충합니다.

사출 장치가 '막힘'경우 주사 바늘 개구는 염색 콘텐츠의 추방에 의해 검증 될 수있다. 막힘 물질을 조심스럽게 아가로 오스를 통해 바늘 끝을 드래그하여 닦아 할 수있다. 공기 주입 튜브에 거품 및 / 또는 바늘을 제거해야합니다. 니로 주입 부피보다 잘 제어 바늘 변경DLE 팁은 휴식 또는 주사에 따라 방해 할 수 있습니다. 계란을 씻어 이물질이 접시에 축적 된 경우 깨끗한 주입 접시에 배치합니다. 어떤 작은 입자 또는 결정을 침전시키기 위해 신선한 바늘을 충전하기 전에 주입 용액을 원심 분리기. 또한 도움은 중요한 염료 주입을 연습한다. 주입과 비 주입 계란 시비하여 주입 기술을 확인한다. 마지막으로, 경험있는 동료와 상담하는 사출 기술을 개선하기 위해 도움이 될 수 있습니다.

오프 대상 효과를 제어하기 위해 두 번째 비 중첩 충실 Ciona에서 불특정 표현형 효과를 배제 할 수있는 MO들에 의해 인식되지 않는 수정의 mRNA와 MO 및 구조를.

미세 주입 : 의의와 한계

Ciona에 미세 주입은 척색 ^(11)에 전체 배아의 유전자 조절 네트워크 (GRN)에 대한 첫 번째 청사진을 생성하기 위해 사용 하였다. 그러나, 이러한 REMA 불구Ciona 배아에서 rkable 업적, 미세 주입으로 인해 Ciona 계란의 상대적으로 작은 크기 (직경 0.14 mm)에 제한이 있습니다. 외국 DNA / mRNA의이 microinjections에 의해 도입되는 다른 척색 종에 비해, Ciona 달걀 취급 비교적 어려운 실험 당 주입 Ciona 배아의 비율은 정량적 분석을 방해, (실험 당 평균 30 ~ 50 배아에) 낮은 남아있다. 그럼에도 Ciona의 섭동 모체 인자 모스의 미세 주입법은 또한 16 내지 32 세포의 발달 접합체 발병 그들의 관련 ¹⁵ 단계 공부 선택의 방법이다. 또한, 더 어려운가 16-32 세포 단계까지 각각의 할구를 microinject 할지라도 가능하다. 마지막으로, 마이크로 인젝션은 Ciona 이외 멍게의 종 (또는 mRNA의 DNA 주입에 의해) 트랜스 제닉 태아를 생성하기위한 가장 효율적인 방법을 완전하게 유지하는 데이터 최적화데이빗 전기 천공 프로토콜이 존재하지 않는다.

전기 : 의의와 한계

이 개발 젤러 등에 의해 최적화 및 표준화 프로토콜로 발행 된 이후에 낮은 번호와 미세 주사의 다른 제약 조건을 극복하기 위해 Ciona 커뮤니티의 대부분은 플라스미드 DNA의 전기를 사용하고있다. 2004 ^9. 사실, 유전자 변형 Ciona 배아의 수천 동시에 하나의 베트에 일렉트로 500 배아 16 밀리 초 중 하나의 50 V의 펄스를 이용하여 한 시간 내에 생성 될 수있다. 형질 전환 배아 대규모 번호를 생성하는 방법은 여전히 ​​척색 모델 유기체 중에서 유일하다. 신속하게 생체 내에서 수행하기위한 강력한 모델 시스템으로 인식 여기에 예시 된 바와 같이 이것은 잠재적 인 시스 규정하는 지역 및 세포 내 / 셀룰러 지역화 분석 Ciona을 주도했다.

electroporati 있지만Ciona의 접합자에 근본적으로 척색 GRN의 연구 분야를 혁명에,이 기술은 그럼에도 불구하고 몇 가지 한계에 직면 해있다. 첫째, 플라스미드는 일시적으로 Ciona 배아에 도입하고 대부분 투기 전기 천공 플라스미드 DNA의 안정성을, 염색체 외 배열로 상속됩니다. 또한, 이와 같이 형질 변동 결과 접합체 당 흡수한다 일렉트로 플라스미드의 카피를 제어하기 위해, 심지어 불가능 매우 어렵다. 전기의 결과를 해석하기 어렵게 만드는 또 다른 문제는 우리가 염색체를 부르는 현상이다. 일렉트로 플라스미드 DNA는 한 세포 단계 배아의 상이한 위치에서 채택 될 수있다; 이는 후손 할구 상속 할과 접합자의 많은 분기 플라스미드를 받게됩니다 방법을 결정합니다. 이러한 변형은 명백히 정량적 효과의 해석을 더욱 어렵게 만든다. 그러나 electropora으로 대부분의 문제를 와서 그기 변동을 계산하고, 일괄 적 입수가 용이 LacZ를 (또는 GFP) 양성 세포의 통계, 생물학적 시료의 적정량에 의해 해결된다.

다양성 및 유전 공학에 대한 전기의 가능성

전기는 결국 한 번 기자 또는 발현 플라스미드에 클로닝 가능성 시스 규정하는 지역과 유전자 기능의 정량적 분석의 중간 스크리닝 수 있습니다. 때문에 소형 Ciona 게놈을 식별하고 잠재적 규제 지역의 복제하면 ³ 매우 간단합니다. 커뮤니티 데이터의 재산을 사용하는 전략도 2a에 설명된다. 기자와 유전자 코딩 플라스미드의 복제가 더 Ciona의 발생에 의해 적응 용이, GATEWAY 호환 벡터 스위트 룸 ^(19)와 호환되는 전체 길이 ORF 라이브러리 ^18. 두 도구는 지역 사회에 사용할 수 있으며,도 2b에 도시 된 바와 같이, 규제 드라이버 및 코딩 영역의 효율적인 제한 효소없는 재조합 허용한다.

최근, 일렉트로 성공적 조직의 드라이버 ^{(21, 22)의} 제어하에 CRISPR / Cas9 성분 등 유전자 편집 도구를 발현 플라스미드 조직 타겟 유전자 조작을 실현하도록한다. 이러한 접근 방식은 신속하게 전사 인자의 조직 형성에 관여하는 코드와 만능의 단계적 출구를 포함 GRNs의 역학 및 잠재적으로 보존 신호 메커니즘에 대한 우리의 이해를 진출하게됩니다. 또한, 전기를 사용하여 조직 특이 loss- 또는 (CRISPR / Cas9에 의해 또는 과발현에 의해) 이득의 기능 방식은 인간의 질병 관련 유전자의 Ciona의 orthologs을 연구하는 수단이 될 것입니다. 사실, 클론을 코딩 Ciona 인간 질병 유전자의 orthologs과 전체 길이 ORF에 대한 카탈로그를 쉽게 availab이다Ciona ^{1 8} 분석을위한 제작. 척추 동물의 게놈 넓은 중복으로 인해, 대부분의 인간의 유전자는 유전자 기능 ^(1)의 분석을 복잡하게 기능적으로 중복 paralogs을 가지고있다. Ciona는 중요한 종종 기능적으로 보존 된 유전자의 근본적인 역할을 발견한다 유충의 전형적인 척색 조직 구성과 간단한 시스템을 주도했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
일정한 온도의 실험실. (~18 ° 다)			배아 작업
Ciona intestinalis 성인	UPMC - Station Biologique, Roscoff, France		수집용
NaCl	Roth	3957.1	ASWH
KCl	Roth	6781.1	ASWH
CaCl2x2H2O	Roth	A119.1	ASWH용
MgCl2x6H2O	Roth	2189.1	ASWH
MgS04x7H2O	Roth	P027.2	ASWH
NaHCO3	Roth	6885.1	ASWH
Hepes	Roth	HN78.3	ASWH
나트륨 티오글리콜레이트	Sigma	MZ-6	디코리온네이션
프로나제	Dechorionation	Sigma	T0632-100G
	Sigma Aldrich	M9546-250G	전기천공법용
플라스미드 DNA (prep >1µ g/&마이크로; l)	Macherey-Nagel	740410.100	전기천공법 또는 미세주입용
Agarose	어떤 공급업체		든지 배아 배양 접시 코팅용
플라스틱 페트리 접시	VWR	612-2079	ASWH에 1% Agarose로 코팅, ASWH로 덮여
있음 작은 가위로	있음 어떤 공급자		배우자 NaOH 해부용
	Roth	6771.1	디코리오네이션 솔루션 활성화를 위한
Tris	Roth	5429.3	1 M pH 9.5, 정자 활성화용
파스퇴르 피펫	VWR	612-1701	수돗물에 최소 12시간 동안 담가 처리
수동 원심분리기	Hettich Zentrifugen	1011	유리 원심분리기 튜브
사용 1.5ml Eppendorf 튜브	Sigma	T3406-250EA
2ml Eppendorf 튜브	Sigma	T3531-200EA
사각 전기자극기	Bio Rad Gene Pulser Xcell
전기천공법 큐벳 4 mm	Eurogentec	CE-0004-50
Coverslips	Sto 프리미엄	PR248212600
유리 슬라이드	VWR	ECN 613-1551
글루타르알데히드	시그마	G6257-10ML	LacZ 염색
파라포름알데히드	시그마에 고정용	P6148-500G	형광 시료 고정용
Vectashield	Vector	H-1000	형광 시료 장착용
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside)	Roth	2315.2	LacZ 기질; 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K4Fe(CN)6• 3H2O	Merck	4984	LacZ 염색 버퍼
K3Fe(CN)6	Merck	4973	LacZ 염색 버퍼
Na22HPO4	Roth	4984.2	PBT
KH2PO4	Roth	3904.2	PBT
트윈		PBT	시그마
	시그마	M8410	배아 배양 테스트
완료 그린 바이탈 염료	패스트 그린 시그마	F7251	; 10µ g/&마이크로; l
Micropipette Puller (Flaming / Brown)	Sutter Instruments	Model P-97	주사 바늘 당김
용 붕규산 유리 모세관 GC100TF-10	Harvard Apparatus Ltd. UK	30-0038	1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., 필라멘트 포함, 미세 주입
용 Micromanipulator	Narishige	MWS-2	3 축 오일 유압 시스템; 사출
중 3D 미세 이동주입 홀더	Narishige	1M-H1	주입 바늘을 고정하기 위해 미네랄 오일로 채워진 전체 시스템
모든 유리 주사기	Walter Graf & Co GmbH & 주식회사 KG	No. 95199.10427A4	10 ml FortunaOptima; 미네랄 오일로 채워져 있으며, 미세 주입 압력의 미세 조정을 위해
모르폴리노스	GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA		0.25-0.5 mM
주입 Capped mRNA	Ambion mMessage mMashine 키트		0.05-0.5µ에서 주입; g/&마이크로; 엘
플라스미드 DNA			주입; l
재조합 클로닝 키트	Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen	11789-013
재조합 클로닝 키트	Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen	11791-019
anti-HA tag 항체	abcam	ab9110	면역형광, 3% BSA/PBT
TRITC 염소 항토끼 항체	Jackson	111-025-144	사용면역형광의 경우 3% BSA/PBT에 1:300을 사용합니다.