방법 논문

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

DOI:

10.3791/54315

⸱

2016년 9월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 특정 관심 세포 유형을 분리하기 위해 desthiobiotin, streptavidin, APTES 시스템의 사용자 정의 가능한 표면 기능화를 설명합니다. 또한 이 원고는 이 프로세스의 적용, 최적화 및 검증을 다룹니다.

초록

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개인 맞춤형 의학의 채택과 발전을 제한하는 요인 중 하나는 환자 간 표현의 개별 뉘앙스를 조사하는 진단 도구를 개발할 수 없다는 것입니다. 이 틈새를 채우기 위해 세포를 분리하려는 현재의 방법론은 생리학적 발현을 방해하여 분리 기술을 진단 도구로서 무용지물로 만듭니다. 이 프로토콜에서는 세포 포획 및 방출을 위한 표면의 기능화 및 최적화에 대해 설명합니다. 이 기능화된 표면은 비오틴화 항체와 아미노실란(APTES), 데스티오비오틴 및 스트렙타비딘으로 기능화된 유리 표면을 통합합니다. 세포 방출은 비오틴의 도입을 통해 촉진되어 표면에 포착된 세포의 회수 및 정제를 가능하게 합니다. 이 방출은 2차 부분 desthiobiotin의 표적화를 통해 이루어지며, 이는 훨씬 더 부드러운 방출 패러다임을 초래합니다. 이러한 가혹한 시약과 전단력의 감소는 세포 발현의 변화를 감소시킵니다. 기능화된 표면은 단일 세포 혼합물에서 세포의 최대 80%를 포착하고 이중 세포 혼합물에서 50%를 포착하는 것으로 입증되었습니다. 이 기술을 이종 이식편 및 암 분리 연구에 적용하는 방안이 조사되고 있습니다. 플레이트 리더 및 ImageJ 분석과 같은 표면 검증을 위한 정량화 기술도 설명되어 있습니다.

서론

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현재 벤치 탑 세포 분리 방법 (예, 형광 활성화 셀이 1 정렬, 레이저 캡처 마이크로 해부 (2), 면역 자기 비드 분리 1) 준비 및 정렬의 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 큰 시간 규모는 생리적 반응 (3)의 대표하지 분석 결과, 생리적 반응과 표현 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 시스템은 신속하고 효율적으로 생체 의학 애플리케이션에 세포 분리 및 농축을 향상시키기 위해 세포 표면 수용체 수준을 중단없이 특정 세포 유형을 분리 할 수​​있는 요구된다. 따라서, 우리의 접근 방식에 대한 이론적 근거는 세포 분리를위한 부드러운 접근 방식을 개발하는 것입니다.

은 "칩에 연구소는"개념은 크기 빨리 (시간 - 투 - 분) 세포 분리의 주문 약속을 제공하며, 가장 자주 표면에 세포를 캡처하고 세포 또는 세포 내 콩트를 방출 포함물리 4,5를 통해 국세청 또는 화학적 방법 6. 이러한 방법은 체외 배양 (12, 13)에 대한 세포를 제공하는 경우에도 RNA 발현 9-11, 식별, 단백질 7,8 식을 식별하거나 몇 가지 장점을 제공하지만, 이러한 기술의 대부분은 이러한 세포 수용체 프로파일로 인해에게로 진단로 번역 할 수 없습니다 자신의 비 생리 학적 환경. 이러한 정확한 생리 학적 데이터를 생성하지 않습니다이 해제 에이전트를 사용하여 세포 수용체의 정량화 기법을 의미 이러한 수용체 수량 14, 15에 영향을 미칠 수있는 콜라게나, 같은 효소 리프팅 에이전트. 세포 용해는 기본 표면 수용체 사이의 분화를 방지하고 이전 16 내재화 된 것과. 이 프로토콜은 세포 분리를위한 빠르고 부드러운 접근 방식을 설명합니다.

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프로토콜

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1. 유리 표면 청소 및 준비 시약

  1. 청소 50 % 전력에서 5 분 동안 산소 플라즈마 시스템에서 유리 표면을 놓는다.
  2. APTES 50 μL 및 원뿔형 튜브에 2.45 mL의 에탄올을 첨가하여, 2.5 mL의 2 % 재구성 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES) 용액을 제조 하였다.

2. APTES와 DSB의 기능화

  1. 표면에 APTES 솔루션을 추가합니다. 8 웰 플레이트에 잘 당 피펫 150 μL. 24 웰 플레이트에 잘 당 피펫 100 μL. 60 X 15mm의 유리 접시 1.1 ml를 피펫. 증발 APTES 용액의 치우침을 방지하기 위해 표면을 커버한다. APTES 층의 고른 분포를 만들어 실온에서 50 분을위한 플랫폼 통의 표면을 놓습니다.
    주 : APTES 표면의 제 1 층을 형성하는 아미노 실란이다. 다른면을 사용하는 경우에는 경험적으로 표면을 커버하는 데 필요한 용액의 부피를 결정한다.
  2. 표면이 통에있는 동안, 오븐의 온도를 선택 : 열을 55 ° C로 8 웰 플레이트 2 시간 24 웰 플레이트에 대해. 열 유리 1 시간 동안 90 ° C 만 요리.
  3. 에탄올로 표면을 씻어.
    1. 사용되는 표면에 기초한 참조하여 요구되는 에탄올의 양을 관리. 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 각 웰 24 웰 플레이트에 125 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 유리 접시 1.1 ml의 에탄올을 추가합니다.
    2. 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 두 번 더 사용하여 에탄올을 씻어.
      참고 : 유리 바닥 웰 플레이트의 그들에 어떤 플라스틱이있는 경우 플라스틱이 녹아 워프하기 시작으로, 65 ° C 이상을 가열하지 않습니다.
  4. 탱크로부터 분배 100 %의 질소 가스로 건조. 오의 표면을 배치VEN.
  5. 2462.5에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 37.5 ㎕의 1.5 ㎎ / ㎖ DSB 결합하여 D-desthiobiotin (DSB) 용액 2.5 ml를 준비하고, 5 ㎎ / ㎖ 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 (EDC) 0.1 M 4 morpholinoethanesulfonic 산 수화물 (MES) (산도 6) 버퍼의 μL. 그런 다음 두 솔루션을 결합한다.
  6. DSB 및 EDC의 반응을 해소하기 위해 용액에, 15 분 후, 2-β 머 캅토 에탄올의 1 μl를 추가합니다. 오븐에서 유리 표면을 기능화 뜨거운 APTES를 제거합니다. 냉각 유리 표면에 대해 5 ~ 10 분을 기다립니다.
  7. MES 표면에 기초한 양을 사용하여 세척 할 표면 버퍼에 추가. 150 μL의 MES 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 125 μL의 MES 24 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 유리 접시 1.1 ML의 MES 버퍼를 추가합니다.
  8. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁 직접 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡고표면에. MES 버퍼와 두 번 더 씻어.
  9. 그들이 부화 할 수 있도록 표면에 DSB 솔루션을 적용합니다. 8 웰 플레이트 잘 당 150 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 24 웰 플레이트 잘 당 100 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 유리 접시의 DSB 솔루션 1.1 ML을 추가합니다.
  10. 페트리 접시 내부에 젖은 종이 타월에 DSB 덮여 유리 표면을 놓습니다. 덮고 18 ~ 24 시간 동안 4 ° C 냉장고에 품어.

3. 스트렙 타비 딘 작용 화

  1. 1.0 배 인산염 완충액 (PBS) 1 ml를 각각 유리 표면을 세 번 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 0.4 밀리그램에 스트렙 타비 딘 (SAV) 원액을 희석 / ㎖ (권장).
    주 : 희석 및 세척을위한 매체로서 이용 될 수 있도록 PBS가 등장한다. PBS는 SA를위한 용매로서 사용되는V, 따라서 표면에 결합하는 SAV의 능력에 영향을 미치지 않을 것이다.
  2. 유리의 아래쪽 형태의 얇은 층이 표면에 기반 용액의 양을 선택할 수 있도록 표면에 균일 SAV 용액 0.4 ㎎ / ㎖을 적용한다. 8 웰 플레이트를 들어, 웰 당 150 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 24 웰 플레이트를 들어, 웰 당 100 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 유리 접시를 들어, 1.1 ml의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
  3. 커버와 수분을 유지하기 위해 14cm 페트리 접시에 접시를 이동합니다. 18 ~ 24 시간 동안 냉장고에 페트리 접시를 품어.
    참고 : 각면에 APTES, DSB 및 SAV의 일관된 볼륨을 사용하는 것이 필수적이다.
  4. SAV을 제거하기 위해 각각의 유리 표면을 PBS 150 ㎕를 3 회 헹군다. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오.
  5. 종이 타월 w 젖은i 번째 탈 이온수와 우물에 수분을 유지하기 위해 판을 주변 14cm 페트리 접시에 평평한 종이 타월을 배치합니다. 웰을 함유하는 페트리 접시 커버. 필요할 때까지 4 ° C 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1) 냉장고에 페트리 접시를 품어.

4. 셀 캡처 및 릴리스

  1. 실험을위한 세포의 T175 플라스크 (들)로 시작합니다. 플라스크 (들)에서 미디어를 대기음. 실온 PBS 5 ㎖로 나머지 용지를 세척 할 것. 플라스크 (들)에서 대기음 PBS.
  2. 세포의 T-175 플라스크에, 이러한 세포 해리 솔루션 등의 비 효소 리​​프팅 제 10 ㎖를 추가합니다. 플라스크에서 세포의 리프팅 수 있도록 6 분 동안 인큐베이터에서 플라스크를 넣습니다.
  3. 6 분 후, 차가운 행크의 균형 소금 용액 10ml를 추가 (HBSS를, 재료의 목록 참조) 리프팅 에이전트를 비활성화 할 수 있습니다. hemacytometer를 사용하여 솔루션에서 세포의 수를 계산하는 세포의 20 μl를 꺼냅니다.
    주 : FUNC에 따라캡처 실험에 사용 된 표면 tionalized 필요한 세포의 수는 변한다. 작용 8 웰 플레이트를 들어, 잘 당 30 만 셀을 사용합니다. 작용 유리 접시를 들어, 110 만 셀을 사용합니다. 기능화 된 24 웰 플레이트를 들어, 125,000 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 계수에 대한 자세한 내용은 부록에서 발견된다.
  4. 단계를 반복 4.1- 4.3 세포의 또 다른 플라스크를 들어, 적은 세포 실험에 필요한 것보다있는 경우. 솔루션에서 세포의 총 수를 얻기 위해 세포 현탁액 및 재계 세포를 결합합니다.
  5. 집중 세포의 펠렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기에 세포 현탁액을 스핀. 다음 ml의 당 1 × 10 6 세포의 농도를 얻을 스핀 다운 세포에서 뜨는을 대기음하고, 계산 된 볼륨을 추가하기 위해 세포 현탁액에 추가 할 HBSS의 적절한 양을 찾습니다. 이 볼륨은 부록의 방정식을 사용하여 계산 될 수있다.
  6. 피펫 상하 (씹다) 일을 재현 탁하기솔루션 전자 세포와 항체 결합을 감소시킬 수있다 용액에 세포 응집을 줄일 수 있습니다. 별도의 제어 및 실험 솔루션에 셀룰러 솔루션을 분할합니다. 구성 요소와 계산을위한 보충 파일을 볼 수 있습니다.
  7. 보조 파일에 기술 된 바와 같이, 각 세포 용액을 비 오티 닐화 된 항체를 추가한다. 엔드 오버 엔드 믹서에 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    참고 : MCF7GFP 세포, 0.5 ㎎ / ㎖ hIgG 0.5 ㎎ / ㎖ HLA-ABC 항체를 들어 권장합니다. RAW 대 식세포를 들어, 1 ㎎ / ㎖ mCD11b은 희석 차이를 설명하기 위해 절반 볼륨을 권장합니다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) 0.5 mg을 들어 / ㎖ hCD31 권장합니다.
  8. HBSS로 작용 유리 표면을 세척 할 것. 이 실험을 위해, 8 웰 플레이트를 권장합니다.
    1. 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 추가합니다. HBSS를 사용하여 두 번 더 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어.팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 4 ℃에서 저온 보관하십시오.
  9. 우물에 셀 솔루션을 추가하고 세포가 셰이커에 얼음에 부화를 위해 45 분을 기다립니다. 는 Supplement에 설명 된대로 계산 볼륨을 사용하여 무균 HBSS에 비오틴의 솔루션을합니다.
  10. HBSS를 사용하여 유리 웰의 세포 용액을 제거한다.
    1. 조심스럽게 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 피펫. 그런 다음 HBSS을 피펫. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오.
    2. 두 번 더 반복합니다. 세안 후 젖은 세포를 유지하기 위해 우물에 HBSS를 추가합니다.
  11. 또한 각각의 릴리스에 20 mM의 비오틴 용액 150 μl를 추가 한 다음 반응을 허용하는 20 분을 기다립니다.
  12. 비특이적으로 결합 된 세포를 채취HBSS로 세척하여 (S)는 전술 한 바와 후 형광 표지 된 세포를 사용하는 경우, 화상을 세포를 형광으로 진행. 또한, 플라스크 내의 화상 생균 (a 대조군으로는 웰의 세포와 비교). 녹색 형광 단백질 (GFP) 형질 감염된 세포를 사용하는 경우, 470 nm의 여기 것이고, 방출 515 nm 인 것이다.

5. 항체 최적화 : 항체 적정

  1. 단계 4.1- 4.3에 설명 된대로 T75 또는 T175 플라스크에서 세포를 올려 시작합니다.
    참고 :이 볼륨을 24 웰 플레이트에 대한 교정되어 있지만, 경험적 테스트를 통해 모든 유리 작용 표면에 맞게 변경할 수 있습니다. 대표적인 항체 적정는 그림 1과 같다.
  2. hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산하고, 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 튜브에 세포 용액을 스핀. 는 Supplement에 설명 된 계산을 이용하여, 용액 100 만 세포에 세포를 재구성한다.
  3. 1 미터 분할항체 (AB) 솔루션에 대한 다른 원심 분리기 튜브에 500 ㎕의 6 가지 솔루션으로 ㎖의 용액 당 illion 세포.
    1. 10 ㎍ / ㎖, 1 μg의 / ㎖, 100 ng를 / ㎖, 10 ng를 / ㎖, 1 NG / ㎖의 항체 원액을 희석. 얼룩 완충액 (PBS + 1 % 아 지드 화 나트륨 + 1 % BSA) 100 ㎕ 및 가지지과 AB 컨트롤 세포 500 μl를 사용하여 제어를 만든다. 빈 제어를 위해 (없음 순이없이 세포), 300 ㎕의 PBS 용액을 사용하지 않습니다.
      참고 :주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이 폭발하고, 그것을 사용하는 경우 극도의주의를 기울여야합니다. 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하여 적절한 안전 장비를 사용하십시오.
  4. 결합하고 30 분 동안 4 ℃에서 엔드 오버 엔드 혼합기 셀 솔루션 구간 솔루션을 배양한다. HBSS로 3 회 기능화 된 24 웰 플레이트를 씻어. 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 파이를 잡고pette 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도.
  5. 적절한 APTES에 각 시료 용액의 분취 량 125 ㎕를가 DSB 및 SAV 잘 관능. 39 ° C에서 또는 유리 표면에 45 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 비특이적으로 부착 된 세포를 제거하는 HBSS로 3 회 표면을 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 그 컨트롤과 마찬가지로, 맨 아래 행을 씻어하지 마십시오.
  6. 잘 세척 각 HBSS 150 μl를 추가 얼음에 24 잘 접시를 넣어, 다음 GFP 세포 (여진 485 nm의 / 방출 528 ㎚)의 형광을 측정하는 플레이트 리더를 사용합니다.

6. 셀 최적화 : 셀의 적정

  1. 단계 4.1 -4.3에서 언급 한 바와 같이 세포를 올립니다.
  2. hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 그래서 세포를 스핀 다운4 ° C에서 5 분 500 XG에 원뿔 튜브에 lution. ml의 당 1,000,000 세포에 세포를 복원합니다.
    참고 : hemacytometer의 사용에 대한 자세한 내용은 부록에서 찾을 수 있습니다.
  3. 피펫 원뿔 튜브에 160 만 셀 재고 및 장소 셀 솔루션에서 1.6 ml의. 원뿔 관에서 80 만 셀 재고 및 장소에 대한 세포 용액으로부터 세포를 800 μl를 피펫. 피펫 원뿔 관에서 80,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 80 μL. 피펫 원뿔 관에서 8,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 8 μL.
    참고 : 농도는 필요에 따라 복제, 8 웰 플레이트 측정에 따라 제공됩니다. 플레이트 출력의 예는도 2에 도시되어있다.
  4. 네 원액을 가지고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기의 회전. HBSS 400 μL의 모든 재고 솔루션을 다시 일시 중지합니다.
  5. 는 160 만 셀 재고로 100 NG / ㎖ 항체의 1.6 μl를 추가 0.8 μ800,000 셀 재고에 리터, 그리고 다른 모든 주식 0.5 μL. 4 ℃에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 혼합기에서 30 분 동안 인큐베이션 항체. HBSS로 3 회 작용 유리 표면을 세척 할 것.
    주 : 기능화 된 24 웰 플레이트는 플레이트 리더 정량화하는 것이 좋습니다 동안 작용 8 웰 플레이트, 현미경 정량화하는 것이 좋습니다. 8000 세포 주식에 대한 항체 농도는 용액 중의 항체의 부족하지 않다고 포집 표면의 제한 요소를 허용하도록 감소하지만되지 않고 표면의 촬상 특성.
  6. 각 웰에 샘플 솔루션의 150 μl를 적용합니다. 왼쪽에있는 우물의 첫 번째 열에에 160 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 두 번째 컬럼에 80 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 세 번째 열에에 80,000 세포 주식을 적용합니다. 마지막으로 마지막 열까지 8,000 셀 주식을 적용합니다. 진탕 기에서 4 ° C에서 45 분 동안 품어.
    참고 : 160 만세포 스톡 시험 될 최고의 농도로 제공하며, (600,000 셀 웰 당) 세포 분리 실험에 통상적으로 사용되는 것이 일반적인 셀룰러 농도 그대로 800,000 세포 스톡 실험을위한 대조군으로 제공되는 세포의 두 배이며 즉 (웰당 300 세포) 세포 분리 실험에 사용된다. 80,000 세포 주식은 휴대 캡처 낮은 농도 (물론 당 30,000 세포)를 테스트 할 수있는 10 배 희석 역할을한다. 백 배 희석 세포 분리의 하한 (물론 3,000 세포)를 확인하는 테스트로 사용할으로 8000 셀 주가는 역할을한다.
  7. HBSS로 3 회 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 모든 세척를 수집합니다.
  8. 이미지는 형광 현미경에 세포를 8 웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 SUR를 촬영할얼굴과 진탕 기에서 4 ° C에서 1 시간 동안 각면에 150 μL 비오틴을 적용합니다. 일시간 후, 이전과 HBSS 3 회와 비오틴 릴리스 우물을 씻어. 혈구와 이미지 릴리스 우물에 카​​운트 우물에서 모든 세척를 수집합니다.
  9. 24 웰 플레이트를 사용하는 경우, 1 시간 동안 비오틴 릴리스 우물을 적절한 다음 HBSS로 그 우물 3 번 씻어 20 밀리미터를 초과하는 비오틴 용액 150 μl를 적용합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 24 웰 플레이트를 정량. 수집 된 모든 잘 세척에서 세포를 계산하기 위해 hemacytometer를 사용합니다.

7. 이미지 분석

참고 : 피지 소프트웨어 패키지 (http://fiji.sc/Fiji) 이미지 분석을 권장합니다. 초기에, 이미지를 그레이 스케일 이미지로 변환 한 후, 휘도 / 콘트라스트 셀을 가지고 변경 하였다.

  1. 이미지를로드하고, "유형"아래로 스크롤 한 다음 이미지 탭을 클릭 한 다음 클릭하여 그레이 스케일로 변환4 8 비트 ".
  2. 이미지 탭을 클릭 한 다음 "조정"으로 스크롤하여 이미지의 대비를 높입니다. "밝기와 대비"를 클릭 한 다음 세포가 눈에 띄는 수 있도록 스크롤 막대를 사용합니다. 형광 이미지를 사용하는 경우,보다 한정된 세포를 확인하기 위해 이미지를 반전한다.
  3. ImageJ에이 이미지를 분석하는 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN 전화에 플러그인을로드합니다.
  4. 열기 ITCN. 대화 상자는 해당 셀의 크기를 추정하기 위해 여러 매개 변수를 사용자에게 프롬프트를 표시 할 때, 제 관심 셀의 최소 폭을 설정한다. 이미지가 형광 및 세포를 어둡게하는 경우 "감지 다크 봉우리"옵션을 클릭합니다.
  5. 은 "개수"버튼을 클릭 한 후 처음 2의 임계 값을 설정합니다. 사진의 새로 계산 버전은 세포가 계산 된 위치를 서술 빨간 점으로 표시됩니다.
  6. defini보다 정확한 셀룰러 데이터를 얻을 수있는 임계 값과 폭 매개 변수를 조정는 "셀"의 크기 겨. 참고 : 오른쪽의 대화 상자에있을 것입니다 계산 세포의 수입니다. 매개 변수 변경 카운트 세포의 다른 수를 줄 것이다.
  7. 좋은 추정치는 세포의 수에 도달 할 때까지 임계 값 및 폭 매개 변수를 통해 반복을 계속합니다.

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결과

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우리는 세포 포착 (도 3A) 및 MCF7GFP 세포의 세포 분리 (도 3C)뿐만 아니라, 생균 제어 (도 4)이 표시 프로토콜 사용. 60 % 및 80 % (그림 3C) 발표 된 바와 같이 우리는 세포 캡처를 정량화. 우리는 RAW 264.7 대식 세포 및 MCF7GFP 세포의 혼합물에이 방법을 확장하면, RAW 식세포의 50 %를 점령 하였다 (도. 3D) 및 RAW 식세포의 80 %는 20 mM의 비오틴 (도 3b)와 분리 하였다. 과량의 항체가 세포 캡처를 줄일 수 있기 때문에, 우리는 HLA 항체의 0-10,000 nM의 적정을 통해 최적화 및 최적의 항체 농도가 100-1,000 mM의 항체 (그림. 1) 사이에 있는지 관찰한다. 마찬가지로, 우리가...

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토론

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세포 분리 기술의 향상은 혈관 생물학 (19)의 세포 재생 생물학 프로그래밍 및 혈관 신생 신호 줄기, 신경 과학 (18)의 구조 - 기능 관계의 과학적 연구를 발전한다. 실제로, 일차 세포 배양 물 (20)은 (예 된 HUVEC), 혈관 생물학 주로 세포 분리 기술의 사용을 통해 수행된다. 세포 격리는 최근 세포막 수용체 3,14,15,19,21 정량적 흐름 (qFlow) 계측법 분석에 사용 하였다. 그러나, 기존의 세포 분리 방법은 세포 표면 수용체 수준에 영향을 미치는 인력 및 시약 모두에서 비용이 많이 든다. 우리는 이러한 단점을 충족 세포 유형의 혼합물로부터 단일 세포 유형의 재현성 캡처 완만 시스템의 생성을 허용 표면 기능화 17의 새로운 방법을 고급. 이 기술은 C의 가능성을 가능하게하는 반복적 인 시스템에 통합 될 수있다특이 적 항체를 사용하는 단계에서 다른 세포 유형 apturing. 추가 절차를 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기금 지원에 대해 American Cancer Society, Illinois Division(282802) 및 National Science Foundation CBET(1512598)에 감사드립니다. 또한 현미경 교육을 제공해 주신 University of Illinois Beckman Institute의 Dianwen Zhang 박사에게도 감사드립니다. 마지막으로, 통찰력 있는 토론을 해주신 Jared Weddell, Stacie Chen, Spencer Mamer에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)Acros Organics919-30-22% APTES 용액
플라즈마 클리너 PicoDienerModel 1PDMS를 유리에 접착 가능
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655세포 포획 표면에서 방출 메커니즘으로 사용됩니다.
디메틸설폭사이드(DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDSB를 용액
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		카르복실산을 활성화하고 단백질을 유리 표면에 결합할 수 있도록 합니다.
코팅되지 않은 8-웰 배양 슬라이드BD Falcon24개의 경우: 354118
96개의 경우: 354108		초기 포획 및 방출 정량화 실험과 같은 Zeiss 형광 현미경과 관련된 세포 실험에 사용됨
유리 바닥 24웰 플레이트MatTekP24G-0-13-F항체 및 세포 적정 실험과 같은 플레이트 리더와 관련된 세포 실험에 사용됨
메르캅토에탄올Science Lab60-24-2EDC와 DSB 사이의 반응을 담금질하는 데 사용됩니다
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250EDC 반응에 사용하기 위한 0.1M MES 버퍼를 만드는 데 사용됩니다
Precision OvenThermo Scientific11-475-153PDMS 및 APTES 층의 경화에 사용됩니다.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420APTES가 표면에 고르게 분포되도록 하는 데 사용됩니다.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1비오틴 결합 단백질. 자극을 유발할 수 있습니다.
5cm 유리 접시Fisher Scientific08748AHUVEC 연구 및 향후 프로파일링 연구에 사용됩니다.
덮개가 있는 14cm 페트리 접시Sigma-AldrichZ717231기능화되는 샘플을 잡고 운반하는 데 사용됩니다.
MCF7-GFP 세포Cell BiolabsAKR211액체 질소에 보관
RAW264.7 마우스 대식 세포ATCCTIB-71일리노이 대학의 스미스 연구실에서 우리에게 선물했습니다. 액체 질소에 보관됩니다.
TrypLELife Technologies12605036실온에서 100ml에 보관
Dulbecco' s modified Eagle mediumCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC50003PC공급업체: Corning
Nonessential amino acidsCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC25-025-CI시설별로 DMEM에 추가되었습니다. 공급 업체: Corning.
Cell scraperFisher Scientific12-565-58소형 23cm 50
세포 해리 솔루션CorningMT-25-056CI세포 실험에 사용하기 위해 비효소로 세포를 들어 올리는 데 사용
HemacytometerHausser02-671-54세포 용액의 정량화와 포획 및 방출 유효성을 위해 세포를 계수하는 데 사용됩니다.
비오틴Amresco58-85-5표면에서 세포를 방출하는 데 사용됩니다.
N/A로 만든HBSS현탁액에서 세포를 살아있게 유지하고 비특이적 결합의 표면을 세척하는 데 사용됩니다. Cold Spring Harbor Protocols에서 발췌: In 500  ml, 사용 4  g NaCl, 0.2  g KCl, 0.0402  g Na2PO4• 7H2O, 0.03  g KH2PO4 및 0.5  G 포도당. DI 워터를 추가하여 얻으십시오  500ml를 걸러낸 후 냉장 보관하십시오.
HLA-ABC 항체BioLegend311402MCF7gfp 세포를 캡처하는 데 사용되는 항체
hIgG 항체BioLegendHP6017MCF7gfp 세포를 캡처하는 데 사용되는 항체
MCF7 GFP 세포, Cell BiolabsAKR-211Luminal Breast Cancer 라인은 녹색 형광 단백질로 transfection되었습니다.
모듬 원뿔형Thermo-Scientific15mL: 12-565-268용액 및 분취액 보관용 50/15ml 플라스틱 원뿔형.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)Fisher Scientific05-450-127혼합하기 위해 항체를 배양하고 다른 세포 용액을 혼합하는 데 사용됩니다
.ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M 도립 형광 현미경.
Zeba 탈염 컬럼Thermo-ScientificPI-87770Biotinylation Kit 사용 후 새로 비오틴화된 항체를 정제하는 데 사용됩니다. 지침: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- Scientific항체를 비오틴화하여 포획 표면과 통합할 수 있도록 하는 데 사용됩니다.
ReaderBioTekSynergy HTX Multimode Reader적정 실험에서 형광 강도를 정량적으로 측정하는 데 사용됩니다.
을 만드는 데 사용 에 용해시키다 이미 팩 레시피 Axiovert 200M (형광 현미경)을 Plate

참고문헌

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