방법 논문

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

DOI:

10.3791/54357

⸱

2017년 5월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

이 논문에서

요약

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신경 세포의 문화는 하나의 신경 세포에 대한 효과 나 신경 세포의 인구를 통해 새로운 뇌 자극 기술을 연구하는데 좋은 모델입니다. 목욕 전극에 의해 직접 생산 또는 시변 자기장에 의해 유도되는 전계에 의해 패터닝 신경 배양 자극하는 다른 방법들이 여기에 제시 하였다.

초록

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뉴런은 멤브레인 전위가 특정 임계 값을 초과 할 때 활동 전위를 발화시킵니다. 뇌의 전형적인 활동에서, 이것은 시냅스에 대한 화학 물질 투입의 결과로서 발생합니다. 그러나 뉴런은 부과 된 전기장에 의해 흥분 될 수도 있습니다. 특히 최근의 임상 응용은 외부에서 전기장을 만들어 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서 신경 세포가 외부 장에 어떻게 반응하는지 그리고 활동 잠재력을 유발하는 원인을 조사하는 것이 중요합니다. 다행히도, 외부 전기장의 정밀하고 제어 된 적용은 배양에서 절제되고, 해리되고 성장되는 배아 신경 세포에 대해 가능하다. 이를 통해 매우 재현 가능한 시스템에서 이러한 질문을 조사 할 수 있습니다.

이 논문에서는 신경 세포 배양에 외부 전계의 제어 된 적용을 위해 사용되는 기술의 일부가 재검토된다. 네트워크는 1 차원 일 수 있으며, 즉 선형으로 패턴 화 될 수 있습니다R 양식 또는 상기 기판의 전체면 상에 성장시키고, 따라서 이차원. 또한, 음원은 유체 (욕 전극) 또는 자기 펄스 원격 생성을 이용하여 전계를 유도하여 침지 전극을 통하여 전계를 직접 애플리케이션에 의해 생성 될 수있다.

서론

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신경 세포와 외부 전기장 사이의 상호 작용은 근본적인 의미뿐만 아니라 실제 사람이있다. 이 외부인가 전계 조직을 자극 할 수있는 볼타 시대부터 알려져 있지만, 뉴런에서 얻어진 활동 전위의 제조를 담당하는 기전은 최근 4 3 2 1 풀어되기 시작한다. 이 전기장 2, 5에 응답하는 신경 세포의 막전위의 탈분극, 막 특성 및 이온 채널의 역할, 심지어 지역을 유발하는 메커니즘에 관한 질문에 대한 답을 찾는 포함되어 있습니다. 신경 자극 6, 7, 8, 9, 치료

생체 내 뇌 에서 의 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 이해에 중요한 요소를 추가하지만, 두개골 내 측정의 부정확성과 낮은 제어 가능성으로 인해 방해 받는다. 대조적으로, 배양 물에서의 측정은 고정밀, 우수한 신호 대 잡음 성능 및 고도의 재현성 및 제어로 대량으로 용이하게 수행 될 수있다. 문화를 사용하여 집단 네트워크 행동의 다양한 연결 특성을 밝혀 낼 수 있습니다 11 , 12 , 13 , 14 , 15, 16. 마찬가지로,이 또한 제어 시스템 optogenetically 활성 뉴런 17, 18의 광 자극 동안의 채널 개구부 (19)가 활동 전위를 생성 할 책임이 방법, 예를 들면 다른 자극 방법이 작동하는 메커니즘을 해명에 매우 효율적일 것으로 예상된다.

여기에 초점을 효율적으로 외부 전기장을 통해 신경 세포를 자극 수있는 도구의 개발과 이해를 설명에 있습니다. 본 연구에서 우리는 하나 차원 배양 상이한 구성 및 목욕 전극에 의해 직접인가 전계의 방향 및 2 차원의 마지막 자극을 이용하여 자극, 2 차원 일차원 패터닝 해마 배양의 제조를 설명하고 패터닝 시변 전기장을 유도하는 자기장을5, 20, 21.

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프로토콜

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윤리 문 : 동물 취급을 포함하는 절차는 과학의 와이즈만 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 적절한 이스라엘 법의 원칙에 의거하여 이루어졌다. 와이즈만 연구소 실험 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받았으며. 와이즈만 기관 동물 케어 및 사용위원회는 해마 신경 세포와 수행이 연구를 승인했다.

(2D) 2 차원 일차원 (1D) 해마 배양 1. 제조

  1. 2D 문화에 대한 커버 슬립의 준비.
    1. 0.9 mL의 최소 필수 매체 (MEM) + 3G, 0.05 ㎖의 소 태아 혈청 (FCS), 0.05 mL의 열 불 활성화 된 말 혈청 (HI HS) 및 B27 보충제 1 μL : 도금 매체 이루어지는 (PM)을 준비한다. 주 : MEM + 세대 MEM 1 × 500 ㎖마다 위해 포함 겐타 마이신 1 ㎖, 안정화 L 글루타민 100X 5 ㎖ (참조
    2. 200mL의 증류수 (DDW) (60 ℃에서 혼합)와 1.24g의 붕산 (200mL DDW)에 1.9g의 붕사 (sodium tetraborate decahydrate)를 준비한다. 1 M HCl을 사용하여 최종 용액을 pH 8.5로 적정한다. 참고 : 최종 솔루션은 400 ML 0.1 M 붕산염 버퍼입니다.
    3. 65 % 질산에 유리 coverslips을 2 시간 동안 담그십시오. DDW에서 3 번 헹구고 절대 분석 시약 (ABS AR) 에탄올로 3 회 헹구십시오.
    4. 1 - 2 초 동안 분젠 버너의 화염을 통해 각 coverslip을 잠시 통과시킨 후 붕산염 완충액에서 1 : 5로 희석 한 1 mL poly-L-lysine 0.01 % 용액이 들어있는 24 개의 웰 플레이트에서 밤새 배양합니다 ( 0.1 M, pH 8.4). 그런 다음 DDW에서 coverslips를 세 번 헹구고 표준 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 웰 당 1 mL PM으로 밤새 두십시오.
  2. 1D 문화에 대한 coverslips의 준비.
    1. 클린 g75 mL의 DDW, 25 mL의 25 % 암모니아 수용액 및 25 ㎖의 30 % 과산화수소로 이루어진베이스 피라니아 용액에 침지하여 아가씨 커버 슬립. ~ 50 ℃에서 가열 플레이트에 커버 글라스 30 분 후 질소와 커버 글라스를 놓고 건조와 용액.
    2. 제 1 증착 또는 스퍼터 증착을 사용하여 금 (99.999 %)의 30 층 뒤에 6 개 Å 두께의 얇은 크롬 막 (99.999 %), 코트 커버 슬립.
      1. 0.05 스퍼터링 속도 달성하는 -을 1 Å / s 2 전자 빔 진공 타겟 260 리터 / S의 시스템 (2) 크기 "4"인 스퍼터링 장치를 사용한다. 분 (RPM) 당 100 원 - 0에서 갈 수있는 회전 무대를 사용합니다. 750 와트 - 0의 스퍼터 전력 직류 (DC)를 사용합니다.
      2. 30 rpm의 회전을 사용하여 10 mTorr의 챔버 압력에서 플라즈마를 얻을 99.999 %의 아르곤.
      3. 선도의 크롬 DC 스퍼터 전력 W 40 스퍼터링 총 전력 공급을 작동 ~ 0.12 Å / s 범위의 속도 및 10 DC W ~ 0.28 Å / s에 이르는 금 전력 스퍼터.
    3. 30 분 동안 초음파를 사용하여 100 ㎖ ABS AR 에탄올 0.1 g -1- octadecanethiol 녹인다. 다음 에탄올 ABS AR의 건조 질소로 씻어,이 용액에 2 시간 동안 CR-Au로 코팅 된 커버 슬립을 놓는다.
    4. 700 RPM - 600에서 2 시간 - 100 ㎖ 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS) 및 트라이 블록 공중 합체 3.5 g의 용액을 제조 한 교반 (자재 / 시약의 도표 참조). 1 시간 동안 용액에 커버 슬립을 놓는다. 질소로 건조 커버 슬립.
    5. 기계적 바이오 거부 층 (22)에 의해 긁 원하는 패턴을 에칭. 펜이 에칭 바늘로 대체 펜 플로터를 사용하여이를 수행. 하부 글라스에 도달하는 금속 층을 통하여 패턴 스크래치. 복제에 원하는 패턴을 달성하기 위해 컴퓨터에 의해이 처리를 제어한다. 이 공정에 의해 형성된 패턴은 입증되어 도 2 및도 3의 (D).
    6. 100 ㎖의 PBS-D, 3.5 g 트리 블록 공중 합체, 35.7 μL / ㎖ 피브로넥틴 29 μL / ㎖ 라미닌의 생체 적합성 층을 준비한다.
      1. 적어도 10 분 동안 자외선에 커버 슬립 멸균. 제조 된 바이오 호환 솔루션 하룻밤에 커버 슬립을 품어.
        참고 : 바이오 호환 층은 바이오 거부 층이 이전 단계에서 떨어져 에칭 된 경우에만 형성됩니다.
      2. 다음날 세척에 P-DBS로 2 회를 ​​커버 슬립. 하룻밤 오후에 커버 슬립을 품어. 커버 슬립 이제 세포 도금을위한 준비가되어 있습니다.
  3. 이전 23, 24 광범위하게 게시 된 표준 절차에 따라 절개를 수행합니다.
    1. 일반적으로 하루에 E19 쥐 배아에서 간단히 추출 해마 또는 피질에서, 또는 일반적 날 마우스 E17 23,클래스 = "외부 참조"> 24.
    2. 그 팁 화재 연마 유리 피펫으로 기계적 분쇄 한 다음 24 분, 30 - 제 20 파파인 용액에 세포를 해리.
      주 : 다음 세포 유전자 변형 마우스로부터 나오면 각각의 배아 조직이 전체 공정 동안 별도 150 mL의 플라스틱 튜브로 유지되어야한다.
    3. 파종 전에 트리 판 블루 세포를 계산합니다.
      참고 : 유전자 변형 동물의 경우 계수는 각각의 배아에 대해 개별적으로 수행해야합니다.
    4. 물론 당 850,000 세포에서 75 개 쥐의 뉴런에서 2D 문화, 종자 마우스 뉴런하십시오. 1D의 경우, 물론 당 650,000 세포에 씨앗. 커버 슬립의 균일 한 커버리지를 보장하기 위해 약간의 시딩 후 즉시 플레이트를 흔들어.
  4. 신경 문화의 유지.
    1. 중간 길이 (ML 당)으로 이루어지는 (CM) 변경 준비한다. 0.9 ㎖의 MEM + 3G, 0.1 mL의 HI HS 10 μL 딘의 100X와 5- 플루오로 -2'- 데 옥시 우리 딘 (FUDR)를
    2. 0.9 mL의 MEM + 3G 및 0.1 mL의 HI HS : 최종 (ML 당)으로 이루어지는 매체 (FM)을 준비한다.
    3. 체외에서 사일 (DIV) 후 1.5 mL의 CM과 PM을 교체합니다. 6 DIV에서 신선한 CM과 CM의 50 %를 대체합니다. DIV 8에서, 2 일마다 FM의 50 %의 변화에 ​​이어 1.5 ㎖의 FM에 매체를 변경. 일주일 정도 후에 자발적인 동기 활동이 나온다.
  5. 형광 염료와의 연결을 문화에 자발적 또는 유발 된 활동의 영상.
    1. 50 μg의 형광 칼슘 민감 염료 용액을 제조 50 μL DMSO (디메틸 술폭 시드)에 (재료 / 시약의 도표 참조).
    2. 세포 외 기록 용액 (EM) (단위 : mm) 10 HEPES, (4)의 KCl을 함유 준비 CaCl2를 2, 1의 MgCl 2, 139의 NaCl, 10 D 글루코오스, 수크로오스 45 (PH 7.4).
    3. 1 시간 동안 형광 칼슘 민감 염료 용액 8 μL 2 EM 용액에서 배양 신경 세포를 인큐베이션. 빛으로부터 보호하고 부드럽게 homogen을 보장하기 위해 회전세포에 염료의 확산.
    4. 이미징 전에 새로운 EM으로 용액을 교체하십시오. 형광 이미징은 그림 4 에 나와 있습니다.
    5. 시야 내의 관심 영역 (ROI)의 강도를 정량화 할 수있는 카메라와 소프트웨어를 사용하여 칼슘 형광 이미지 (488 nm에서 여기 피크, 520 nm에서 방출 피크)를위한 광학 필터가있는 형광 현미경 이미지 현미경.

2. 문화의 전기 자극

참고 : 전기 자극의 기본 설정은 그림 1 에 나와 있습니다. 신경 세포 배양이 약 14 일 동안 성장한 커버 슬립을 형광 현미경하에 페트리 접시에 둔다. 뉴런의 전기적 활동은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 영상화되는 반면, 전압은 배양 물 외부에 위치한 2 쌍의 욕 전극을 통해인가된다. 전극은 다음과 같이 구동된다.출력이 듀얼 채널 증폭기에 의해 증폭된다 ignal 발생기. 자극 전압 제어 따라서 간단 벡터 덧셈 및 조합을 가능하게 더 기준 전류 제어부 (25), 전계 벡터를 직접 결정하기 때문에 (26) 위에 바람직하다. 이것은 전압 제어의 경우의 샘플 전체에 걸쳐 수행 될 수있는 전계의 균일 성을주의 깊게 검사를 필요로한다. 사용 전압 제어 관리 어떤 접지 루프를 피하기 위해주의해야한다 전계의 균질성을 확인해야하는 경우 (아래 2.2 참조).

  1. 균일 한 전기장과 전기 자극 평행 전극 와이어 쌍을 사용한다.
    1. 0.005 ''(127 μm의) 정도의 두께를 갖는 백금 전극을 사용한다. 13 밀리 커버 슬립으로 사용될 때, 두 전극 사이의 거리가 약 11 mm로되도록, 상기 전극 위치상기의 배양 1mm.
      주 : 전극 홀더 (도 5A 및 6A)을 사용하여 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)을 확인한다. 전극을 삽입 PTFE 통해 좁은 구멍을 뚫는다. 전극이 노출되는 상단은, 용액과 접촉하지 않도록 장치는 세포 외 솔루션보다 더 높아야한다. 절연 노광 될 수있는 전극 리드의 일부에 에폭시 접착제를 사용한다.
    2. 전기를 피할 수없는 DC 구성 요소와, 50 % 듀티 사이클 사각 펄스 형태를 사용합니다. 문화를 굽기없이 효과적인 자극을 유발하는 10 μs의 4 MS 사이의 기간을 펄스 다릅니다. 진폭이 ± 22 V (도 5 참조)의 순서로되어 있는지 확인. 사각 펄스가 전극에 병렬로 접속 된 오실로스코프에서 관찰 될 수있다.
      참고 : 원하는 파형을 쉽게 프로그래밍, 상업 파형 편집 소프트웨어를 사용하십시오 (재료 목록을 보려면
  2. 전계 균일 성을 테스트하려면 프로브 전극을 사용하십시오. 적어도 1mm x 1mm의 그리드를 사용하여 전극 사이의 영역에서 프로브를 움직여 전위를 측정하십시오.
    1. 전위를 측정하십시오. 용도 figure-protocol-1 전기장을 계산합니다. 전극 중 하나를 기준 전극으로 사용하십시오. 필드가 자극 지속 시간의 범위 내에서 균질하다는 것을 확인하기 위해 100 μs에서 4 ms 사이의 다양한 펄스 지속 시간 (100 μs 펄스 지속 시간의 예는 그림 5B 참조)으로 전기장을 측정하십시오.
      참고 : 펄스 지속 시간이 1ms 일 때 측정 된 전계 균일 성의 예는 그림 5D 를 참조하십시오.
  3. 더 복잡한 전계 형태를 생성하기 위해 2 개의 수직 쌍의 배쓰 전극을 사용하고(도.도 6b를 참조) 다른 방향으로 필드를 배향 할 수. 2 전극 쌍 장치가 사용되며, 각 전극 쌍의 두 개의 신호는 오실로스코프에서 관찰된다.
    1. 서로 11mm - 전극을 상기 배양하고 (10)의 거리에서 1mm의 위치. 두 전극 쌍 (에는 접지가없는) 플로팅되고, 전극들 중 어느 집합 사이의 저항을 측정하고, 전극 중 하나 사이의 단락의 유무를 확인하여 어떤 공통점을 갖고 있지 않은 것을 확인. 확인하여 (등과 오실로스코프, 증폭기, 신호 발생기 등) 전극에 연결되어 사용되는 모든 설비는 접지에 대해 플로팅되고 있는지 확인 모든 장비는 부동과 기준 전극의 어느 것도 터치 없는지 어떤 접지 장비.
    2. 전계 방향을 변경, 입술과 두 전극 쌍에 공급되는 전압의 진폭을 변화서로 pect (도 7a 참조). 예를 들어, 0 °를 사용하여 전극 쌍에 대해 ± 22 V 패턴과 직교하고있는 다른 쪽의 전극에 대한 0 V. 45 °의 경우, 15.6 15.6 (2) 2 = 22 (2)의 진폭의 벡터 합의 경우, 위상 지연이 양 전극 쌍에 15.6 ± V 사용.
    3. 회전 필드 전계 회전 고정 된 진폭을 생성하는 정현파 전압 펄스의 어느 하나의 파형과 전극의 두 쌍 코사인 전압 펄스의 어느 하나의 파형을 사용하여 적용하도록 (도 6b 참조).
      주 : ± 22 한쪽 전극에 V 다른 쪽의 전극에 ± 22 V와 코사인 파의 한 사이클 사인파의 한 사이클을 사용하는 경우도 6b에서 볼 수있는 바와 같이, 벡터 합과 회전 전기 필드 사인 및 코사인 파 동일하고, ± 22 V.의 진폭과주기 기간
  4. 역대을 측정하고 계산하려면동일한 배양 수지상 대 배양 신경 축삭 axie Rheobase 및 다음 단계를 수행한다.
    1. 10mm) 라인 (가늘고 긴 (170 ㎛의 패터닝에 1 차원 배양)과 함께) 재료 / 시약의 표에 기재된 1.5 칼슘 이미징 칼슘 민감한 형광 염료를 사용한다. 칼슘 민감성 염료는 배양에 적용하고 45 분 동안 인큐베이션한다. 염료는 기록 신선한 용액으로 교체하여 세척한다.
    2. 시냅스 전달의 영향없이, 전기 자극에 직접 응답의 인구 통계를 달성하기 위해 네트워크 연결을 해제. 이를 위해, 40 μM bicuculline 블록 감마 - 아미노 부티르산-A의 억제 작용 (GABA A) 수용체의 조합을 적용한 10 6- 시아 노 -7- 퀴녹 살린 -2,3- 디온 μM (CNQX) 상기 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic (AMPA)과 발생한 kainate 수용체 및 (2R)의 20 μM 아미노 -5- phosphonovale을 차단RIC 산 (APV)하는 블록 N- 메틸 -D- 아스파 테이트 (NMDA) 수용체. 차단제는 기록 액에 첨가된다.
    3. 100 μS 4 개 단말 사이의 지속 시간을 가변으로 2.1 및 2.3에 기술 된 바와 같이 사각형 펄스를인가. 신호는 오실로스코프에서 관찰 할 수있다.
    4. 여러 로아에서 칼슘 과도의 강도를 모니터링하기 위해 (1.5 참조) 이미지 수집 프로그램을 형광 현미경을 사용하여 몇 백 뉴런을 포함하는 각. 적어도 초당 20 프레임의 영상 획득 속도 가능한 EMCCD 민감한 카메라를 사용하여 이미지 (자재 목록 참조) 획득. 빛의 강도의 변화는 자극 하였다 뉴런의 양에 비례한다. 상대 강도의 변화를 자극하여 신경 세포의 비율을 추정한다.
    5. 각 펄스 기간 (4 MS 100 μS)의 경우, 강도에 변화 (몇 볼트) 보이지 않는 전압에서 시작하는 전극에인가되는 전압의 진폭을 변경 토륨(22 V 최대 ±) 때문에,인가 전압의 강도의 변화가 포화 전압 E있다.
      주 : 강도 변화는 전압 펄스 각각의 지속 시간에 대한 자극인가 전압에 대한 누적 가우시안 5로 배포한다.
    6. 각 기간에 대한인가 전압 대 강도의 누적 가우스 분포에 맞는이 맞는에서 가우스 평균을 추출한다.
      참고 :이 평균은 신경 세포가 반응하는에 대표 전압이다.
    7. 이 프로세스의 마지막에있는 신경 세포가 반응하는 각 자극 동안의 평균 전압을 얻었다. 힘 - 시간 곡선을 플롯 기간과 강점이 쌍을 사용합니다 (그림 7 참조).

문화의 3. 자기 자극

주 : 자기 자극의 기본 설정이도 2에 도시되어있다. 오른쪽 상단에 표시됩니다뉴런의 영상 칼슘에 민감한 염료로 사용되는 거꾸로 형광 현미경. 자기 코일 (청색 원)가 동심 링 신경 배양 (청색 윤곽)보다 약 5mm에 위치된다. 페트리 접시의 외주에 픽업 코일 (적색 원)의 자기 펄스에 의해 유도 된 전압을 모니터한다. 픽업 코일로부터 집적 같이 왼쪽 상단 5000 kV의 커패시터의 전압 부하와 자기 자극기 (MS) 코일의 측정 동력학을 나타낸다. 자기장은 청색에 도시 된 상태 (14mm의 링 반경 계산)에 유도 전기장이 녹색으로 도시되어있다. 하단에있는 신경 세포 문화의 이미지를 표시됩니다. 왼쪽 하단 패터닝 24 mm의 커버 슬립의 야상이다. 흰색 영역은 뉴런이다. 촬영 패턴은 서로 다른 반경 동심 링 문화로 구성되어 있습니다. 오른쪽 하단에서 개별 뉴런을 보여 반지의 짧은 세그먼트 상으로 크게된다. 규모를 들어, 고리 '떨어 졌th는 약 200㎛이다.

  1. 1D 문화 자극에 대한 원형 링 패턴 (1.2.5에 설명 된대로 에칭)에서 뉴런을 성장. 얇은 (170 μm), 길이가 긴 (10 mm) 라인에 패턴 화 된 1D 배양 물을 사용하여 칼슘 이미징 (1.5 절에서 설명)에 칼슘 민감 형광 염료를 사용하십시오.
    1. 원형 마그네틱 코일을 사용하고 페트리 접시를 코일과 대략 동심 5mm 아래에 위치시킵니다. 최대 전압이 5 kV 인 수제 또는 상업용 MS로 구동되는 인덕턴스가 L = 90 mH 인 약 30 mm (내경, 46 mm 외경) 코일의 맞춤 코일을 사용하십시오.
    2. 고전류 - 고전압 스위치를 사용하여 전도성 코일을 통해 고전압 및 전류를 방출하여 신경 세포 배양을 자기 자극합니다. 자기 자극기 (MS)는 1 ~ 5 kV의 고전압을 얻기 위해 100 mF 정도의 커다란 커패시터를 사용하여 21에 설명 된대로 제작할 수 있습니다. 또는 상업적으로 사용하십시오.가능한 MS (참조 재료 / 시약 표).
      주 : 제 코일 (21)을 제조하기 위해 0.254 mm 두께 6.35 mm 폭 폴리 에스테르 코팅 직사각형 구리 와이어를 사용한다. 에폭시 유리 섬유 캐스트 절연 주문품 프레임에 와이어를 켜고 (자재 / 시약의 도표 참조). 또는 (재료 / 시약의 표 참조) 상업적으로 이용 가능한 코일을 사용합니다.
  2. 2D 문화를 자극하는 자기장을 회전합니다.
  3. 이제 2D의 문화를 자극하는 회전 자기장을 사용합니다. 강도와 코일 독서의 선형 상관 관계를 보여주고, 다른 강도에서 접시에 어떤 문화와 TMS 화재.
  4. 뉴런 배양 칼슘 과도 녹화 중 다음에, 칼슘, 과도 코일 모두를 기록하면서 강도 증가에 TMS 소성 시작. 먼저, 네트워크 버스트 SHO 큰 칼슘 과도 관찰uld가 코일 TMS 스파이크를 집어 올리는 것과 동기화되지 않습니다. 강도를 계속해서 증가 시키면 어느 시점에서 칼슘 과도 현상이 TMS 스파이크와 동기화되기 시작합니다. 대안으로, 또는 추가적으로, 동기화 된 응답을 달성 한 후, 동기화가 폐지 될 때까지 강도를 감소시켜 TMS 임계 값을 결정할 수있다.
    참고 : 매번 정확한 볼륨을 사용하여 동일한 용기와 정확한 코일 위치 및 방향을 사용하여 각 설정에 대해 조건을 엄격하게 고정해야합니다.
    1. 기록 접시의 바닥에 픽업 코일을 장착하여 그것이 연결 문화와 평행 한 평면에 있고 문화와 관련하여 고정 된 위치에 있도록하십시오.
      참고 : 이것은 자석에 대한 픽업 코일의 위치의 의존성이 배양체의 위치에 충실하고 포지셔닝의 불일치가 픽업 코일 판독 값에서 무시할 수 있음을 보장합니다.
      1. 두 개의 독립적 인 코일을 사용하십시오.서로 수직 위치 (도 8b)은 회전 자기장과 유도 전기장을 생성한다. 자신의 MS에 각각 코일을 연결합니다. 자극제가 ~ 270 V / m의 최대 필드 (도 10b)에, 실 공간의 270도 스캔 회 전자계 결과 90 ° (도 10a)의 위상 지연에 유사한 전류를 토출하는 것이 확인.
      2. 외부 기록 용액 (EM)로 채워진 구면 유리 용기 내에 신경 배양을 위치.
      3. 단계 2.4.4에서 설명 된 바와 같이 카메라 자극 (뉴런의 형광 강도의 변화)를 모니터링.
      4. 크로스 코일 (도 8B)의 경우에는, 픽업 코일과 평행하게 위치시키고 신경 배양 아래 특정 거리. 조심스럽게 실험에 걸쳐이 구성을 유지한다.
  5. 분석적 1 차원 형 구성에 대한 전기장을 계산E는 최대 유도 전기장의 최대 진폭이고 반경 (r)을 가진 링의 접선을 따라 지향 E 최대 K = 1 브롬에 의해 기. B는 자기 펄스의 진폭이고, k (1)는 픽업 코일 (도 8A)를 이용하여 측정 할 수있는 치수의 비례 상수이다.
  6. 수치 전기장 (21)을 시뮬레이션 수치 시뮬레이션 패키지를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다.

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결과

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제시된 프로토콜은의 연결 문화의 쉬운 patterning 수 있습니다. 우리가 자극을 위해 개발 한 여러 가지 방법과 결합되면 Chronaxie 및 Rheobase 5 와 같은 일부 고유 신경 세포 특성을 측정하고 건강한 사람과 질병이있는 뉴런의 특성을 비교하고 문화를 자극하는 최적의 방법을 찾기 위해 사용할 수 있습니다. 그들의 구조와 더 많은 새로운 접근 방식을 제공합니다. 몇 가지 예가 다음 그림에 나와 있습니다.

그림 3 은 1D 패턴 구성은 바이오 거부 레이어로 에칭된다. 약 170 μm 너비의 얇은 선은 전형적으로 다양한 반경 ( 그림 3A ) 또는 평행선, 일반적으로 길이가 ~ 11 mm 인 동심원 고리가 될 수...

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토론

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1D 패턴은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있는 중요한 도구입니다. 예를 들어, 우리는 신경 세포의 배양 물 (29)로부터 논리 게이트를 생성하고 최근 래트 해마 뉴런 5 Chronaxie 및 Rheobase를 측정하고, 상기 비교 다운 증후군 해마 뉴런 소성 활동 신호 전파 속도의 감속을위한 1 차원 패턴을 사용한 야생형 (WT) 해마의 뉴런 (27). 1 차원 패터닝 제안 된 프로토콜은 강력한이며 원하는 패턴을 형성하기 쉽다. 우리는 측정의 기능에 영향을 미칠 수있는 네트워크의 가능한 모든 단선, 알고 있어야하기 전에 1D 문화를 관찰하는 것이 좋습니다.

신경 구성 화학 패터닝은 유서 30, 31,

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 매우 도움이 토론 오퍼 펜어맨, 프레드 울프, 메나헴 시걸, 안드레아스 니프과 에이 탄 Reuveny 감사합니다. 저자는 기술의 초기 버전을 개발 일란 브레스킨와 조르디 소리아노 감사합니다. 저자는 이론적 인 개념에 도움을 트비 틀러스티와 장 피에르 에크 만 감사합니다. 이 연구는 미네르바 재단, 과학 기술, 이스라엘의 교육부와 이스라엘 과학 재단 보조금 1320년에서 1309년까지과 양성 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 교부금 2,008,331에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
APVSigma-AldrichA8054네트워크 연결을 끊습니다. 섹션 2.4.2
B27 suppGibco17504-044있습니다. 섹션 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343네트워크 연결을 끊습니다. 섹션 2.4.2
붕사(사붕산나트륨 12수화물)Sigma-AldrichS9640붕산염 완충액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.2
붕산Frutarom LTD5550710붕산염 완충액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098세포외 기록 솔루션. 섹션 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239네트워크 연결을 끊습니다. 섹션 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5. 섹션 3.5.2
D-(+)-포도당, 1M시그마-알드리치65146도금 매체, 세포외 기록 용액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.1 및 1.5.2
D-PBSSigma-AldrichD8537세포 배양에 언급되어 있습니다. 섹션 1.2.4 및 1.2.6
FCS(FBS)Gibco12657-029있습니다. 섹션 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141있습니다. 섹션 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Imaging of spontaneous or evoked activity(자발적 또는 유발 활동의 이미징)에서 언급됨. 섹션 1.5.1, 1.5.3 및 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503매체 변경에 언급되어 있습니다. 섹션 1.4.1
GentamycinSigma-AldrichG1272도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에서 언급됨. 섹션 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887세포외 기록 솔루션에 언급되어 있습니다. 섹션 1.5.2
HI HSBI04-124-1A도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에 언급됨. 섹션 1.1.1, 1.4.1 및 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000세포외 기록 솔루션에서 언급되었습니다. 섹션 1.5.2
Laminin 시그마-알드리치L2020바이오 코팅. 섹션 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에 언급됨. 섹션 1.4.1에서 언급됨      1.4.2
MgCl2, 1MSigma-AldrichM1028세포외 기록 솔루션. 섹션 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591세포외 기록 용액에서 언급되었습니다. 섹션 1.5.2
OctadecanethiolSigma-Aldrich01858Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures)에 언급되어 있습니다. 섹션 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 에서50475278생물 거부 코팅, 생물 코팅. 섹션 1.2.4 및 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% 용액에서 언급됨 시그마-알드리치  P47075세포 분열을 촉진합니다. 섹션 1.1.4
자당, 1M시그마-알드리치S1888세포외 기록 용액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.5.2
Thiol Sigma-Aldrich1858바이오 거부 코팅. 섹션 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750매체 변경에 언급되어 있습니다. 섹션 1.4.1
스퍼터링 머신AJA International, IncATC Orion-5Series 얇은 금속 층으로 유리를 코팅합니다. 섹션 1.2.2
펜 플로터 휴렛 팩커드 HP 7475A코팅된 커버슬립에 패턴을 에칭합니다. 섹션 1.2.5 전극 전선에 언급
 AM Systems, Carlsborg WA767000신경 세포 배양의 전기 자극. 섹션 2.1, 2.2, 2.3 및 2.4.5
신호 발생기BKPrecision4079전기 신호의 형성에 언급되어 있습니다. 섹션 2.3
AmpliifierHomemadeVoltage 신호 발생기에서 전극으로의 신호 증폭. 섹션 2.3
전원 공급 장치 MPS-3005 LK-3 스퍼터링 기계에 전원 공급 장치. 섹션 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulationMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetic stimulation of neuronal culture에서 언급됨. 섹션 3.1, 3.3 및 3.4
EpoxyCognisVersamid 140수제 코일의 주조에 언급되어 있습니다. 섹션 3.4
에폭시쉘EPON 815 수제 코일의 주조. 섹션 3.4
백금 와이어 0.005 ''두께에 언급됨; A-M 시스템,   워싱턴주 칼즈버그  767000신경 세포 배양의 전기 자극. 섹션 2.1
원형 자기 코일수제자기 자극. 섹션 3.3
WaveXpress SW; K 정밀 파형 편집 소프트웨어. 섹션 2.1.32
Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCD 카메라에서 언급되었습니다. 섹션 2.4.4에 언급되어 있습니다.
도금 매체에 언급되어 에서 언급 : 에서 언급: 수치 시뮬레이션에서 언급되었습니다 도금 매체에 언급되어 Bio Coating에 언급되어 언급됨;됨 매트릭스에서 언급됨에서 언급 : 신경 배양의 B&에서 언급됨

참고문헌

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