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방법 논문

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54375

⸱

2016년 11월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

초록

생체의 입양 전송 전이성 흑색 종 환자의 상당한 부분 집합의 내구성과 완전한 응답을 중재 할 수자가 종양 침윤 림프구 (TILS)을 확장했다. 이 접근법의 주요 장애물 텔로미어 단축에 의한 전사 T 세포의 감소 된 가능성, 그리고 TILS의 제한된 수의 환자로부터 얻은. 그러나, 이들 덜 분화 된 T 세포의 다수 발생하는 문제이다 텔로미어 길이 덜 분화 된 T 세포는 T 세포 대체 요법을위한 이상적인 T 세포의 서브 세트 일 것이다. 대체 T 세포 요법이 제한 이론적하여 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에 의해 극복 될 수있는 자기 갱신 능성, 길쭉한 텔로미어를 유지 및 면역 요법자가 T 세포의 무제한 소스를 제공한다. 여기서는 TILS로 프로그래밍 인자의 형질 센다이 바이러스 벡터를 사용 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 생성완전히 재 프로그래밍, 벡터없는 클론이야. 이러한 TIL 유래 iPSCs는 T 세포 대체 요법에 대한 환자 - 덜 분화 된 종양 특이 적 T 세포를 생성 할 수있을 것이다.

서론

전사 인자의 정의 된 설정의 과발현을 통해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 생성을 허용 세포 리 프로그래밍 기술은 세포 기반 치료 1,2- 분야에서 큰 가능성을 보유하고있다. 이러한 iPSCs는 전사와 후생 유전 학적 특징을 나타내는 유사 배아 줄기 세포 (는 ESC) 3-5 자기 갱신과 다 능성에 대한 용량을 가지고있다. 지난 10 년 동안 프로그래밍 기술로 만든 놀라운 진보는 우리가 심지어 T 세포 6-8으로 말기 분화 세포에서 인간 iPSCs를 생성 할 수있다. T 세포 유래 iPSCs는 (TiPSCs)는 TiPSCs 9-11에서 항원 특이 적 T 세포의 재생을 허용하는 원 T 세포와 같은 T 세포 수용체 (TCR) 쇄 유전자의 동일한 재 배열 된 구성을 유지한다.

흑색 침윤 림프구의 약 80 % (TILS)이 환자의 종양 특이 적 종양 관련 항원 A를 인식 얻은차 원래 암세포 (12)에 대한 세포 독성을 유지한다. 특히 TILS에 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1)의 발현은 돌연변이 neoantigen 특정 CD8 + 림프구 (13)을 포함한자가 종양 반응성 레퍼토리를 식별하는 것으로 밝혀졌다. 예비 lymphodepleting 요법 및 인터루킨 -2 (IL-2)의 전신 투여와 함께 전 생체 확장자가 TILS의 입양 전송 환자 (14)의 하위 집합에서 전이성 흑색 종의 실질적인 회귀가 발생할 수 있습니다. 전임상 모델에서 환자의 결과를 유도에도 불구하고, 불량한 주입 된 T 세포의 생존과 면역 억제 경로의 존재는 T 세포 대체 치료 잠재력을 손상시킬 것으로 보인다. 현재 임상 프로토콜은 다수 얻기 위해자가 T 세포의 광범위한 생체 조작을 필요로한다. 이것은 생존율이 불량한 말단 분화 된 T 세포를 감소 prol의 발생을 초래iferative 용량, PD-1 (15)의 높은 수준.

대체 T 세포 요법이 이론적 한계에 대한자가 면역 T 세포의 무제한 소스를 제공 할 수 iPSCs를 사용함으로써 극복 될 수있다. 최근 센다이 바이러스 (SEV) 네 개의 전사 인자 - 매개 전달, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC × 16 PD-1의 높은 발현 수준을 흑색 TILS의 프로그래밍을보고 하였다. 레트로 바이러스 벡터가 재 프로그래밍 유전자를 표현하기 위해 호스트 염색체에 통합을 필요로하지만, SEV 벡터가 아닌 통합하고 결국 세포질에서 제거된다. 효율성을 재 프로그래밍하는 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 비해 6-8 SEV 시스템 훨씬 높다. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 의해 생성 된 일부 IPSC 클론 nonlymphoid 계통 6-8에서 할 수 있지만 또한 SEV 특히, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서의 T 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기, 우리는 세부 사항절차는 인간 흑색 종 TILS의 단리 및 활성화와 SEV 리 프로그래밍 시스템을 사용 TIL 유래 iPSCs의 발생 구현.

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프로토콜

참고 : 환자는 셀위원회가 연구를 승인 줄기 임상 시험 심사위원회와 인간 다 능성에 참여하는 동의를 제공해야합니다.

1. 분리 및 TILS의 문화

  1. 병리 서비스 / 조직 조달 코어에서 병리 조직 학적 진단을 위해 필요하지 않습니다 종양 물질을 얻습니다. 30 ml의 종양 수집 미디어 (표 1)과 50 ml의 튜브에 종양 표본의 20-100g를 놓습니다.
  2. 고체, 회사, 가위를 사용하여 깨지기 쉬운 및 / 또는 피 묻은 괴사 지역에서 종양 표본의 정상 조직을 해부하다. 괴사 조직을 제거한 후 가능한 한 작게 시편을 말하다하기 위해 가위를 사용합니다.
  3. 제조자의 지시에 따라 dissociator 종양 분리 키트 (인간)를 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 다진 표본. 50 ML 튜브에 설정되어있는 70 μm의 셀 스트레이너와 서스펜션 필터와 함께 스트레이너을 2 회 반복한다RPMI 1640 2 ㎖.
  4. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 T 세포 배지 (표 1) 10ml에 세포를 재현 탁.
  5. 예컨대 피콜 100 % 구배 용액 10 ㎖의 하부 단계 및 둘 베코 인산염으로 희석하고 75 % 구배 용액 30 ㎖의 중간 단계로 50 ㎖의 튜브 (구배 용액)으로 두 단계 구배 용액을 준비 완충 식염수, 아니 칼슘, 아니 마그네슘 (D-PBS (-)).
  6. (단계 1.5) 구배 용액에 (단계 140에서) 세포 현탁액 층을 포함한다. 45 분 동안 20 ° C에서 400 XG에 원심 분리기.
  7. 100 % 구배 용액 및 50 ㎖ 튜브에서 75 % 구배 용액의 계면에서 농축 TILS을 함유하는 층을 수집한다. D-PBS 중 20 ~ 30 ml를 첨가하여 농축 TILS와 용액의 희석 층 (-).
  8. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 10 ml의에 TIL 풍부한 부분을 재현 탁T 세포 매체.
  9. 배양 37 ° C에서 6 웰 플레이트에 2 T 세포 배지 ㎖의 6000 IU / ml의 재조합 인간 (RH) IL-2로한다 (단계 1.8)에서 분획, 5 % CO 2.
  10. 배양 개시 후 5 일에 절반 미디어를 변경 한 후 2-3 일마다.
  11. 1의 비율로 세포 분열 2 : 트립신없이 부드럽게 80~90%에 포화 상태에 도달 할 때 우물의 수를 두배로 현탁 한 후. 6000 IU / ml의 신선한 T 세포 매체와 rhIL-2의 절반 량 (1ml)에 추가한다.

마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 셀 플레이트 2. 준비

  1. 80-90% 합류 (3-4 × 106 세포)까지 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 SNL 피더 세포 배지 (표 1) 10ml에 문화 SNL 피더 세포로 진행한다.
  2. 직접 SNL 피더 세포 배양 접시에 0.4 ㎎ / ㎖ 마이 토마 이신 C 용액 310 μl를 추가하고 37 ° C 2 시간 15 분, 5 % CO 2 부화. 미디어 a를 대기음ND 5ml를 D-PBS로 두 번 세포를 씻어 (-).
  3. 0.5 ml의 0.25 % 트립신 / 1mM의 EDTA를 첨가하고 세포를 해리 1 분 동안 실온에서 배양한다. 중화 SNL 피더 세포 미디어 4.5 ML을 추가하고 하나의 현탁액에 세포를 재 - 일시 중지합니다.
  4. 5 분 동안 200 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 세포를 전송합니다. 미디어 대기음 SNL 피더 세포 배지 10ml에 다시 현탁 한 후 혈구 세포 계산.
  5. 플레이트 1.5 × 10 6 10cm 접시에 SNL 피더 세포의 웰 당 세포와 37 ° C에서 품어, 5 % CO 2. 삼일 이내에 SNL 피더 세포를 사용합니다.

센다이 바이러스를 사용하여 iPSCs의 3 세대 (SEV) 벡터

  1. 수확 TILS 및 플레이트 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / ㎖) TILS 5 × 105 세포를 활성화하고 수용성 마우스 항 - 인간 CD28 (/ ㎖ 5 μg의) (단계 1.11)에서, rhIL-2 세에서 6 웰 플레이트에서 T 세포 배지 2 ㎖에 (6000 IU / ㎖)7 ° C를 5 일 동안 5 % CO 2.
  2. 피펫을 사용하여 15 ml의 튜브 (단계 3.1)을 TILS를 수확하고, 혈구와 세포 수를 계산합니다.
  3. 500 μL의 rhIL-2 1 판 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / mL)로 TILS의 X 105 세포 및 가용성 마우스 항 - 인간 CD28 (5 μg의 / ㎖) (60 IU / ㎖) 활성화 37 ° C에서 24 웰 플레이트에 웰 당 프로그래밍 미디어 (표 1), 24 시간 동안 5 % CO 2의. SEV 감염에 대한 3 우물을 준비합니다 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC (1도) SEV 감염 (GFP : 녹색 형광 단백질) (1도) 세포 수 (1 웰).
  4. (단계 3.3에서) 24 시간 후, 혈구와 세포 수를 계산하고 감염의 다양한 (3-20) 다중도 (MOI) 각 바이러스의 양을 결정합니다. -80 ° C 저장 영역에서 센다이 바이러스 벡터 튜브 한 세트를 제거합니다. 수조 (37 ° C)에서 신속하게 SEV 벡터를 해동하고 얼음에 배치합니다.
    바이러스의 양 (μL)= MOI (CIU / 셀) 바이러스 / 역가 세포의 X 번호 (CIU / ㎖) × 10-3 (μL / ㎖)
  5. 활성화 TILS 포함 매체로 10-20 MOI에서 SEV 벡터의 혼합물을 첨가하여 개별적 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC을 수행 네 센다이 바이러스 벡터 튜브의 각각의 계산 된 양을 추가한다.
  6. 형질 도입 효율을 확인하려면 활성화 TILS의 우물에 SEV-GFP의 계산 된 볼륨을 추가합니다.
  7. (단계 3.5에서 3.6 단계) 접시를 놓고 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서. 24 시간 후, 형광 현미경 하에서 SEV-GFP 감염 TILS를 사용하여 감염 효율을 추정한다.
  8. 15 ML 튜브에 (단계 3.5에서) 세포를 수집합니다. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기.
  9. 상층 액을 제거하고 영장류 ES 세포 매체와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 hESC의 미디어 0.5 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
  10. 접점 10cm의 접시에 현탁액을 전송인 hESC의 배지 10ml에 SNL 피더 세포 미토 마이신 C는 처리. 식민지가 성장 될 때까지 다른 모든 날 hESC의 미디어를 변경합니다.
  11. 21 일 (18)의 주위에, 클린 벤치에서 10 μl의 팁을 사용하여 현미경으로 식민지 주위 SNL 피더 세포를 제거합니다.
  12. 10 μl의 팁을 사용하여 콜로니를 긁어 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰 당 iPSCs 배지 100 ㎕에 200 ㎕의 팁을 사용하여 전송. 피펫 최대 2-3 시간에 아래로 50 ~ 100 μm의 평균 크기가 작은 덩어리로 식민지를 중단합니다.
  13. 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 iPSCs 매체의 웰 당 2 ㎖ 중의 (단계 2)에서 미토 마이신 C 처리 SNL 피더 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에 작은 덩어리로 이동. 매일 iPSCs 미디어를 변경합니다.
  14. 모든 5~6일 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 신선한 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 세포와 6 잘 조직 배양 플레이트에 iPSCs를 전송합니다. immun 각 클론의 접시 당 2 우물을 준비ostaining.
  15. 만능 마커 (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 OCT3 / 4) (1) 면역 조직 화학 염색을하여 각 클론의 전체 재 프로그래밍을 결정합니다.
    참고 : 만능 잠재력의 추가 평가를 위해 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인이 배아 체 형성과 분화 분석 또는 기형 종 형성 분석 (16)에 의해 삼 배엽으로 분화 할 수 있는지 확인합니다.
  16. 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인은 세포 유전 학적 분석에 의해 정상 핵형을 보여 있는지 확인합니다.
  17. 기형 종 형성, 미분화 TIL 유래 IPSC DMEM 6-8 주령 암컷 NOD / SCID 마우스의 피하 조직에 10 % FCS를 함유하는 100 ㎕ (1 × 106) 현탁액을 주입. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 기형 종 섹션.

SSEA3, SSEA4, TRA1-60 및 TRA1-81에 대한 iPSCs 4. 면역 형광 염색법

  1. 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 및 4 % PA 1 mL로 iPSCs 해결10 분 동안 raformaldehyde 솔루션입니다. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회 1 mL로 iPSCs 씻는다.
    참고 :이 독성이 있기 때문에 파라 포름 알데히드를 사용하는 경우주의해야합니다.
  2. 30 분 동안 버퍼 (표 1)과 차단 iPSCs를 전처리. 한편, PBS 및 트리톤 희석 차 항체 (래트 항 - 인간 SSEA3 마우스 항 - 인간 SSEA4 마우스 항 - 인간 TRA1-60, 마우스 항 인간 TRA1-81) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액 -100 (총 용적 1 ㎖).
  3. 차단 버퍼 (표 1)를 제거합니다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 한편, 이차 항체 (항 - 마우스 IgG를 및 IgM의 또는 항 래트 IgM의) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액.
  4. 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 1 ml의 PBS 3 회, 각과 iPSCs를 씻는다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 암실에서 실온에서 45 분 동안 배양한다.
  5. 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경으로 iPSCs을 준수하십시오.

Oct3에 대한 iPSCs 5. 면역 형광 염색 / 4

  1. 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 10 분간 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 1 mL로 iPSCs 해결. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회와 iPSCs를 씻는다.
  2. permeabilization 완충액 (표 1)를 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 버퍼 (표 1) 차단 추가합니다.
  3. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 한편, 버퍼를 차단의 기본 항체 (마우스 항 - 인간 Oct3 / 4) 1:50 희석.
  4. 희석 차 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C에서 품어.
  5. 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 1ml를 3 회 각을 iPSCs를 씻는다. 한편, 디(항 - 마우스 IgG / IgM의 염소) 류트 이차 항체 1 : 100 버퍼를 차단한다.
  6. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 45 분 동안 암실에서 실온에서 배양한다.
  7. 희석 보조 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경에서 iPSCs을 준수하십시오.

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결과

그림 1은 항 CD3 / CD28와 활성화 및 TILS에 OCT3 / 4, KLF4, SOX2 및 c-MYC의 유전자 전달 뒤에 rhIL-2 흑색 종 TILS의 초기 확장을 포함하는 절차의 개요를 보여줍니다 iPSCs의 생성. 일반적으로, rhIL-2 시작과 문화에 TILS는 구체에게 문화의 개시 후 21-28일을 형성한다. 이 시점에서, TILS는 항 CD3 활성화 될 준비가되어 / CD28가. 그림 2A 문화에 TILS은 rhIL-2 21 일에, 활성화 될 준비가 쇼 항 CD3 / CD28.도 2b는 GFP 소개를 보여줍니다 (20)에 형질 전환 된 센다이 바이러스 (SEV)에 의해 MOI. 그림 2C는 18~21일 SEV 감염 후에 나타나는 SNL 피더 세포에 대한 전형적인 만능 클론을 보여줍니다. 그림 2D가 발...

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토론

여기, 우리는 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 네 개의 전사의 SEV 매개 형질 도입에 의해 iPSCs에 흑색 종 TILS를 재 프로그래밍하기위한 프로토콜 요인 보여 주었다. 이 방법은 T 세포를 재 프로그램하는 SEV 시스템을 사용하여, 비 - 통합 방식 (7)의 이점을 제공한다.

이전의 연구는 SEV 리 프로그래밍 시스템은 섬유 모세포뿐만 아니라 말초 혈액 T 세포 7,17뿐만 아니라 재 프로그래밍 고효율 및 신뢰성있는 것으로 나타났다. 또, 최근에는 더 분화되고 그러한 PD-1과 같은 SEV 16 벡터하여 재 프로그램 할 수있는 말초 혈액 T 세포보다 같은 억제 수용체의 높은 수준의 발현이 흑색 TILS을 보여 주었다. SEV 벡터와 항 CD3 / CD28 자극과 감염의 타이밍은 재 프로그래밍 TILS 중요했다. 말초 혈액 T 세포를 대상 7 whil으로부터 수확 후 즉시...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

조직 조달 코어의 Deborah Postiff 씨와 Jackline Barikdar 씨, 그리고 미시간 대학교 만능 줄기 세포 코어 연구소의 Cindy DeLong 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 미시간 대학의 스타트업 자금과 중앙 외과 협회(Central Surgical Association), 미국 외과의 협회(American College of Surgeons), 흑색종 연구 연합(Melanoma Research Alliance) 및 NIH/NCI(1K08CA197966-01)의 보조금으로 F. Ito에 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
gentle MACS C tubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentle MACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
Tumor Dissociation Kit, humanMiltenyi Biotec130-095-929
RPMI 1640Life technologies11875-093
Falcon 70 um Cell StrainerBD352350
BD Falcon 50ml 원뿔형 Cntrifuge 튜브BD352070
IMDM생명 기술12440053
인간 AB 혈청생명 기술34005100
L-글루타민(200mM)생명 기술25030-081
2-메르캅토에탄올(1000x, 55mM)생명 기술21985-023
페니실린-스트렙토마이신 생명 과학 기술15140-122
겐타마이신생명 과학 기술15750-060
Ficoll-Paque 플러스GE17-1440-02
D-PBS (-)생명 과학 기술14040-133
재조합 인간 (rh) IL-2Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
정제 된 NA / LE 마우스 Anti-Human CD3BD555329
정제 된 NA / LE 마우스 Anti-Human CD28BD555725
X-VIVO 15Lonza04-418Q
FBSGibco26140-079
HEPESLife Technologies15630-080
N-AcetylcysteineCumberland 제약 Inc.NDC 66220-207-30
팔콘 조직 배양 플레이트 (6-well)코닝353046
팔콘 조직 배양 플레이트 (24-well)Corning353047
Sendai 바이러스 벡터DNAVEC
SNL 피더 셀Cell Biolabs, IncCBA-316
미토 마이신 CSIGMAM4287물에 용해 (0.5 mg / ml)
젤라틴SIGMAG1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)Life technologiesPHG0264

참고문헌

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  16. Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11(2016).
  17. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  18. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
  19. Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052(2014).

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