계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

요약

이질적인 세포 집단을 가진 하중지지 조직의 엔지니어링 및 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 하나의 구조 내에서 다양한 세포 집단의 공동 배양을 위한 플랫폼으로서 이중층 알기네이트 하이드로겔 디스크를 만드는 방법을 설명합니다.

초록

많은 하중지지 조직은 구조적으로나 기능적으로 뚜렷한 영역을 가지고 있으며, 일반적으로 차등적인 메카노센싱 특성을 가진 서로 다른 세포 표현형을 동반합니다. 이러한 조직 유형에 대한 엔지니어링 및 분석은 여전히 과제로 남아 있습니다. 층상 하이드로겔 구조체는 단일 구조체 내에서 여러 세포 집단 간의 상호 작용을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. 알긴산 하이드로겔은 생체 적합성이 있으며 실험 후 세포를 쉽게 분리할 수 있습니다. 여기에서는 소형 2층 알기네이트 하이드로겔 디스크의 개발 방법을 설명합니다. 이 과정은 형성 과정에서 인간 중간엽 줄기세포의 높은 세포 생존력을 유지하며, 이러한 층상 디스크는 연골 형성을 겪고 있는 hMSC의 자극에 일반적으로 사용되는 제한되지 않은 순환 압박을 견딜 수 있습니다. 이러한 층상 구조는 잠재적으로 추가 수준을 포함하도록 확장될 수 있으며 층화 후 초기에 세포 집단을 분리하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 이중층 알긴산 하이드로겔 배양 플랫폼은 하중을 견디는 조직의 세포 엔지니어링 및 분석과 다른 세포 유형의 공동 배양을 포함한 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

서론

이러한 관절 연골이나 척추 디스크와 같은 압축 하중 베어링 조직은 조직에서 모두 생체 역학적 기능과 적절한 메카-전달에 중요한 이종 조직 영역으로 구성되어 있습니다. 뿐만 아니라이 세포 조직과 다른 지역의 구별을 작동하지만, 세포 외 기질 (ECM)도 조성 및 조직의 변화된다. 예를 들어, 관절 연골은 다양한 세포 형태, 기계 기능, ECM와 세 가지 주요 영역으로 구성되어 있습니다. 로드 베어링 책임을 차등 그들의 ECM 리드의 차이; 중간과 깊은 영역이 압축 ¹ 응답을 주로 책임있는 동안 표면 층은 주로로드 인장 응답에 참여하고있다. 마찬가지로, 추간판에 겔상 수핵은 라멜라 환형 섬유화에 의해 둘러싸인 이들 두 개의 별개의 영역 내에서 세포 생 물리적 자극의 종류를 경험티슈가 겪는 기계적인 힘에 반응로 (2). 티슈 층 내의 조직, 세포 및 세포 외 매트릭스의이 종류가 서로 상호 작용한다.

이러한 이종 조직 구조의 재현부는 조직 공학 및 재생 의학에 도전 남아 있고, 생물학적 중요성에 대한 우리의 이해는 제한됩니다. 일 구조에서 세포 개체군의 층상 조직과 공동 배양 분석 플랫폼 배양이 필요하다. 관절 연골 조직 공학에서, 비계없는 계층 구조는이 조직 ^3,4의 다른 레이어를 모방하는 다양한 ECM을 증착하는 동서 연골 세포의 능력을 활용하여 구성되어있다. 그러나, 적층 구조 하이드로 겔 독립적 견고한 조직을 형성하는 능력이 부족한 세포 집단 다양한 형태의 상호 작용을 연구하기위한 기회를 제공한다. 예를 들어, 다른 팝업중간 엽 줄기 세포의 ulations 계층화 구조물 내에 공 배양 할 수있다. 이러한 층상 지지체는 연골 향상된 조직 공학 ⁵ 중간 엽 줄기 세포의 분화를 모두 사용되어왔다. 뿐만 아니라, 다른 세포 집단 유사한 겔 층에서 배양-협력 할 수 있지만, 하나의 세포 유형은 세포 ^-6,7- 상이한 반응을 유도하는 다양한 강성 또는 생화학 함량을 갖도록 조작 한 층 내에서 배양 될 수있다.

다양한 생체 하이드로 겔은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리 비닐 ^알콜을 사용하여 염기 ^7-9 것과 연골 조직 공학을위한 세포 집단 레이어하는데 사용되어왔다. 그러나, 알지네이트 하이드로 겔은 공동 문화에서 이종 세포 인구를 공부 계층 발판을 만드는에서 간단한 생체 재료 중 하나입니다. 아가 로스 하이드로 겔은 쉽게 형성되지만, 알지네이트 하이드로 겔은 쉽게이 허용하는 추가 혜택을개별 세포의 분석을 위해 3-D 구조에서 셀 olation 이전 ¹⁰ 설명한 바와 같이. 이전의 연구에서, 이중 층 알지네이트 하이드로 겔은 얇은 시트에 형성되었으며, 이러한 시트에서, 섹션 분리되었다 (예., 생검 펀치 사용) 등의 생화학 적 내용이나 계면 전단 특성 ^{(11, 12)의} 분석과 같은 특정 응용 프로그램을. 알긴산 얇은 시트를 형성하기위한 다른 방법은 복수의 층으로 층화의 가능성을 설명 하였지만, 여전히 기계적 시험 ^(13)에 사용하는 하이드로 겔에 대한 변경을 필요로한다.

여기서는 재현성 세포를 공동 배양하는 다른 집단에서 사용하기위한 이중층 알긴산 겔 디스크를 생성하기위한 방법을 제시한다. 이것은 알긴 디스크 플랫폼은 여러 가지 장점을 가지고있다. 주로, 재생 가능한 형상과 작은 크기 생검 PU 없이도 내장 세포의 기계적 자극 도움이되는NCH​​ 또는 여러 응용 프로그램의 하이드로 겔에 다른 물리적 변경. 또한, 세포 생존율은 레이어링 공정 동안 높게 유지하고, 겔 형성 후에 겔 내의 두 개의 세포 집단의 명확한 분리가없는 초기의 중복 영역으로 볼 수있다.

프로토콜

알긴산 디스크의 형성 1. 준비

1. 4 % 준비 (W / V), 37 ° C 수조 첨가 염화칼슘 또는 염화 마그네슘이없는 장소 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 알지네이트 용액. 알지네이트 용액의 농도는 다를 수 있지만, 1~4% (W / V) 알긴산 용액을 사용하는 것이 좋습니다.
2. 원하는 세포 유형 따뜻한 세포 배양액베이스로 한 (예를 들면, 둘 베코 변형 이글 매체.) : 1의 비율로 알지네이트 용액을 혼합한다. 알기 네이트 농도가 이제 원래 농도의 절반 즉., 2 % (W / V). 멸균 된 0.2 ㎛의 나일론 주사기 필터를 사용 알긴산 / 미디어 용액 살균.
3. (- 300㎖의 ~ 200)을 주형 잠수함 충분한 용액을 멸균 무균 102 mM의 염화 칼슘 이수화 물 목욕을 준비한다.
4. 멸균 "겔 형성 금형"알루미늄 플레이트 × 3의 3 (6mm 직경 X 3mm 높이의 원통형 우물을 수집, 참조 그림 1)과 종판 (바닥 : 하나의 알루미늄 판에 × 3에서 3 위 : 알루미늄 플레이트 × 3 한 1.5) 다음과 같이 금형을 준비 :
   1. 약 1 분 두꺼운 종이 필터 (흡착 여과지) 및 상부 및 하부 종판의 크기의 셀 마이크로 시브 막 (10 ㎛의 공극 크기)을 차단시키고, 포화 될 때까지 염화 칼슘 욕에 배치. 필요하다면, 사용하기 전에 30 분 동안 오토 클레이브 또는 자외선을 통해 두꺼운 종이 필터와 마이크로 시브 막 살균.
   2. 설정 금형 구조의 절반 (하단 참조).
      1. 다음 순서에 따라 서로 꼭대기 다음 항목을 넣고 멸균 주걱을 사용하여 부드럽게 : 큰 단부 판 두께 여과지하고 마이크로 시브 막 (3 × 3의 단위).
      2. 전환 과량의 염화칼슘 용액의 손실을 보장하기 위해 종이 타월의 스택 상에 몰드를 누른다.
      3. ㄴ 위에 원통형 웰과 '겔 형성 몰드 "놓고엘의 마이크로 시브 막 부드럽게 좌우 양측에 바인더 클립을 이용하여 양면에 함께 몰드를 고정. 완전히 나중에 우물을 충당하기 위해 (의 × 3 1.5) 상단 엔드 플레이트에 대한 충분한 공간을두고 있는지 확인합니다.
   3. 설정 금형 구조 하반기 (위쪽 절반).
      1. 다음과 같은 순서로 서로 꼭대기 다음 항목을 놓고 부드럽게 : 작은 엔드 플레이트, 두꺼운 종이 필터, 마이크로 시브 막을.
      2. 반전 및 초과 염화칼슘 용액의 손실을 보장하기 위해 종이 타월의 스택에 금형이 절반을 누릅니다. 이 때 바인더 클립을 사용하여 금형의 끊임 고정하지 마십시오.
5. 문화 전지는 제조업체의 지침에 따라 권장합니다. 층상 알지네이트 하이드로 겔에 포함 할 원하는 세포를 수확. 권장 세포 밀도는 1 - 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖, 그러나 이것은 실험 목적에 따라 변화 될 수있다.
   참고 :이 방법을 사용하는 경우다른 세포 유형의 레이어를 만들기 위해, 레이어에 대한 병렬 문화 두 가지 세포 유형을 확인합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 1 × ¹⁰⁶ 세포의 세포 밀도로 접종 / ㎖가 다음과 같은 프로토콜을 일례로서 사용한다. 필요에 따라 휴대폰 번호 및 디스크 번호는 실험을 위해 확장 할 수 있습니다.
   1. 기저 성장 배지 10 ㎖ (둘 베코 변형 이글 중간 10 % 태아 소 혈청, 2 % L 글루타민, 1에서 5,000 세포 / ^㎠ - 1 ~ 2 주 전에 3000의 세포 밀도에서 시드 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 T-75 플라스크 % 비 필수 아미노산, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신).
   2. 3 일 세포가 80 때까지 기저 성장 미디어 10 ㎖로 교체 - - 매 2 소모 된 용지를 제거 90 % 합류.
   3. 추가 염화칼슘 또는 세포를 세척하는 염화 마그네슘없이 1 배 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 3 ㎖를, 세포를 수확 동안 미디어를 제거하고, 피펫합니다. 피펫, 0.25 %의 시도 3 ㎖를이 솔루션을 제거T-75 플라스크에서 성장 세포 상에 psin-EDTA를, 37 ℃에서 5 분 동안 품어. 기저 성장 미디어의 9 ml의 - 세포가 부착 표면에서 해제 한 후, (6)을 추가합니다.
   4. 원심 엽 줄기 세포는 실온에서 5 분 동안 600 XG에서, 상등액을 흡인하고, (1)에 다시 일시 - 기저 성장 배지 5 ㎖. 디바이스 명령어를 이용하여 혈구를 사용하여 세포를 카운트.
   5. 원심 동일한 조건을 이용하여, 총 부유 셀에서 1 × ¹⁰⁶ 세포를 제거하고, 상층 액을 흡인.

셀 시드 알긴산 디스크 2. 형성

1. 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 세포 밀도를 달성하기 위해 무균 알긴 / 미디어 용액 1 ㎖로 세포 펠렛을 다시 일시. 세포가 적절하게 혼합되면, 셀 알긴산 혼합물 외관 균일 흐린 것이다.
2. 피펫 금형의 하단에 여섯 6mm 직경 X 3mm 높이 우물에 세포 알긴산 혼합물의 130 μL기포를 생성하지 않도록 적하를 구성. 약간 볼록 메 니스 커스가 아니라 각각의 가장자리 위에 표시해야한다.
3. 조심스럽게 멸균 주걱을 사용하여 금형 구조의 위쪽 절반을 부드럽게하고 셀 마이크로 시브 멤브레인은 우물의 상단에 위치하도록 뒤집습니다. 몰드 셀 완전히 알긴산 혼합물을 함유하는 웰을 덮 확인한 웰 위에 구축 놓는다.
4. 중앙에 단단히 누른 상태에서,로드 된 금형 구조를 올리고, 바인더는 금형 구조의 상단과 하단 반쪽을 고정하는 나머지 두 측면 (상단과 하단)를 클립. 세포 - 알지네이트 용액을 안전하게 이때 우물에 자리한다.
5. 전체 구조가 침수되어 있는지 확인하고, 102 mM의 염화칼슘 화장실에서 고정 금형 구조를 담가. 90 분 동안 실온에서 세포 배양 후드에서 인큐베이션.
6. 90 분의 끝에, 102 mM의 염화칼슘의 금형 구조를 제거세포 배양 후드에 종이 타월의 스택에 목욕 및 장소. 네 바인더 클립을 제거하고 금형 구조의 두 부분을 분리합니다. 우물에 형성된 하이드로 겔은 거품이 안 완전히 우물을 작성해야합니다.
7. 주걱을 사용하여 조심스럽게주의 깊게 풀고 하이드로 겔을 쐐기 하이드로 겔을 함유하는 웰의 에지를 추적. 몰드 구조체에서 하이드로 겔을 분리 한 후, 직접 칼슘, 염화 마그네슘과 1X 둘 베코 인산염 완충 염수 욕조로 하이드로 놓는다. 5 분 - 1 초과 염화칼슘 용액을 씻어 완전히 겔을 커버.
8. 완전히 하이드로 겔을 포함 원하는 요리의 기초 성장 미디어 솔루션 (예., 6 웰 플레이트)에 하이드로 겔을 전송합니다. 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에 최소한 1 시간 5 % 축성 단계를 계속하기 전에 CO ₂ 품어.
   주 : 세포를 함유하는 하이드로 겔을 유지할 수있다3 일 - 다른 세포 집단으로 겔 레이어까지 이때 무한정 세포 배양기는 매체마다 변경이 완료되었는지 제공 요구된다.

알긴산 디스크의 3 레이어링

1. 1 시간 보육의 마지막 시간 반 동안 수집하고 젤을 어닐링에 대한 멸균 금형 및 솔루션을 준비합니다.
   1. X는 (AN 단부 판에 3 (알루미늄 판에서 X 3 3 6 mm 직경 X 1.5 mm 높이 웰)은 "겔 형성 몰드"의 높이 웰 반을 갖는 금형을 체결하여 "절단 금형"준비 좌우의 바인더 클립을 사용하여 알루미늄 판 3).
   2. X에서 ((알루미늄 판에 × 3의 3 9mm 직경이 X 3mm 높이 우물)는 단부 판에 "겔 형성 금형"보다 직경이 3mm 큰 금형을 체결하여 3은 "열처리 금형을"준비 좌우의 바인더 클립을 사용하여 알루미늄 판 3).
   3. 의 솔루션을 준비100 mM의 시트르산 나트륨 / 30 mM의 EDTA 멸균 수 (구연산 나트륨 이수화 물, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 테트라 나트륨 염 이수화 물).
2. 원하는 세포 인구의 젤 제거합니다 (이 예에서, 두 중배엽 줄기 세포의 디스크) 접시에있는 미디어에서, 그리고는 "절단 금형"우물에 배치합니다. 각 겔 금형 위에 돌출 겔의 절반 우물에 잘 맞도록해야한다.
3. 메스를 사용하여, 금형의 표면을 따라 겔 (이 반 하이드로 겔을 절단한다) 조각. 겔의 상단 절반 플립 오픈 금형 우물에 배치합니다. 겔의 절반도 잘 금형에 잘 맞해야하지만, 지금은 모두 반 겔은 보이는 잘라 내면 몰드의 높이를해야한다. 두 번째 젤 반복합니다.
   참고 : 경고 : 만 내부 절단면은 레이어 디스크를 형성 할 것이다. 외면을 사용하면 반 분리 될 것이다. 이 겔 표면 방지에 전사 마이크로 시브 막에서 그 질감을 의심어닐링 공정의 성공.
4. 마이크로 시브 막을 어닐링하는 겔 절반 모두와 접촉하는 것을 확인하고 완전히 덮어서 웰의 상부에 건전지 마이크로 시브 막 조각을 놓는다. 완전히 젤을 포함해야하고, 마이크로 시브 막 위에 두꺼운 종이 필터를 놓습니다.
5. 이 포화 될 때까지 필터 두꺼운 용지에 100 mM의 시트르산 나트륨 / 30 mM의 EDTA (구연산 나트륨 이수화 물, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 테트라 나트륨 염 이수화 물)의 용액을 피펫. 약 750 ㎕의 네 우물에 충분하다.
6. 실온에서 1 분 동안 인큐베이션 젤. 이어서, 세포 마이크로 시브 막 두께 여과지를 제거하고 폐기. 바인더 클립을 제거하고 곰팡이를 엽니 다.
7. 각 어닐링 젤, 절단면이 위쪽으로 향하도록 준비 "어닐링 몰드"로 하이드로 겔의 일 시트르산 나트륨 / EDTA 처리 반 옮긴다. 이것은 어닐링 CONST의 절반 것ruct.
8. 절단면이되어 있으므로,이 후반 겔을 내리고, 이미 "어닐링 몰드"의 겔상에서 (다른 셀 타입을 포함 할 수있다) 주걱, 리프트를 이용하여 제 시트르산 나트륨 / EDTA 처리 반 겔 배치 이미 "어닐링 몰드"의 겔의 절단 표면에 접촉.
9. 부드럽게 아래로 두 젤에 사이의 거품을 제거하기 위해 주걱을 사용하여 두 젤 누릅니다. 그들은 서로의 상단에 직접적 있는지 확인하기 위해 필요에 따라 또한, 젤의 위치를​​ 변경.
10. 부드럽게 "어닐링 주형"을 올리고, 30 분 동안 102 mM의 염화칼슘 욕에서 잠수함. 엔드 플레이트와 우물을 덮지 마십시오.
11. 30 분 배양 한 후, "열처리 금형"을 제거하고 종이 타월 위에 놓습니다. 바인더 클립을 제거하고 엔드 플레이트에서 금형을 분리합니다.
12. 어닐링 젤을 수집하고 염화칼슘 및 m와 1 배 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수로 배치, 주걱을 사용하여agnesium 염화 목욕 젤을 씻어. 이어서, 소망의 접시에 세포 배양 배지 어닐링 하이드로 겔을 트랜스퍼 (예. 6 웰 플레이트) 배양.

결과

도 1은 알긴산 하이드로 겔의 형성 및 레이어를 도시한다. 이러한 하이드로 겔 계층화 높은 벌크 하이드로 비교 남아 내에 내장 인간 중간 엽 줄기 세포의 그림 2. 세포 생존)에 도시 된 바와 같이,도 3에서와 같이 세포 집단의 전체 초기 거리를 나타내는 이중층 겔 완료. 생존력을 평가 하였다 어닐링 후, 다음 가운데에 액세스 할 수 수직 젤 슬라이스와 에티 디움 호모 다이머-1은 제조업체의 지침을 사용하여 함께 라이브 셀 추적, CMFDA (녹색)과 죽은 세포 (적색)로 어닐링 젤의 살아있는 세포를 염색. 공 촛점 Z - 스택은 약 100 μm의 겔로를 형광 현미경을 사용하여 절단면의 촬영 하였다. 이러한 이미지는 하나의 2D 이미지로 예상했다. 라이브와 죽은 세포는 그 다음이었다 ImageJ에 소프트웨어의 입자 분석기 기능을 사용하여 정량화.

FO 클래...

토론

여기, 우리는 예를 들어 생리 학적으로 계층화 된 조직에서 그, 연골 등 여러 세포 집단의 공동 문화를 연구하는 계층화 된 알지네이트 하이드로 겔 디스크의 형성을위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 기재된 배양 플랫폼으로서 계층화 구조, 동일한 배양 환경이나 하중 하에서 행하여 두 개의 별개의 세포 집단 사이의 상호 작용을 조사 할 수있다.

알긴산은 생체 것으로 밝혀졌다 성공적 연골 생물학, 조직 공학 연구 ^{(12, 14)에} 사용 된 음이온 성 선형 다당류이다. 알긴산 하이드로 겔은 가교 가의 양이온을 이용하여 형성된 예를 들어., 칼슘 이온. 이러한 가교는 시트르산 나트륨 또는 EDTA 등의 킬레이트 제를 이용하여 양이온을 제거함으로써 취소 될 수 있으며,이 과정은 겔 ^3,4,12에서 배양 한 연골 세포를 분리하기 이전에 사용되었다. 마찬가지로, 동일한 원리성공적 이중층 또는 알긴산 비드 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알긴산 나트륨 소금	시그마 알드리치	A1112	DPBS (-/-)
1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (-/-)	Gibco Life Technologies를	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco의 변형된 독수리 매체	Gibco Life Technologies	11965	예. 원하는 중간 유형
주사기 필터(0.02 μ m 나일론)	FisherBrand	0979C
염화칼슘 이수화물	Fisher Bioreagents	BP510	멸균수에 용액 준비
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	곰팡이 형성을 위한 종판 크기로 절단
Cell Microsieve Membrane (10 μ m 기공 크기)	Biodesign Inc of New York	N10R	곰팡이 형성을 위한 엔드플레이트의 크기로 자르기
시트르산나트륨 디하이드레이트	FisherScience	S93364
에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 디하이드레이트 (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
태아 소 혈청	Gibco Life Technologies	26140	중간엽 줄기세포 기초 성장 매체
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	에 사용됨Gibco Life Technologies	15140	중간엽 줄기세포 기저 성장 매체
L-Glutamine (200 mM)	에 사용됨Gibco Life Technologies	25030081	중간엽 줄기 세포 기초 성장 배지
비필수 아미노산 (100x)	에 사용됨Gibco Life Technologies	11140050	중간엽 줄기 세포 기초 성장 배지의 예에 사용됩니다