Method Article

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

DOI:

10.3791/54401

⸱

August 4th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1The School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 2Neuroscience Research Australia, 3Biomedical Imaging Facility, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

Abstract

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피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 외부 표피 층은 모낭과 땀샘 우리의 몸과 표피 부속의 대부분을 커버하는 층상 편평 상피이다 interfollicular 표피로 구성되어 있습니다. 표피는 일생 동안 부상에 응답하여 재생을 겪는다. 이 긴밀하게 표피 내부와 표피와 진피 사이의 활성 여러 규제 메커니즘에 의해 규제되는 기저 상피 줄기 / 전구 세포 인구를 K14이 발현으로 활성화되어 있습니다. 이 문서는 전체 두께 마우스 피부 생검을 명확히하고, K14 단백질 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 설명, 사료된다 세포 증식라고 표시된, 나일 레드 sebocytes를 표시 및 3D에서 단일 셀 해상도 DAPI 핵 라벨. 이 방법은 정확한 평가와 피부 해부학과 병리학의 정량 및 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의 수 있습니다. 입방 프로토콜은 일입니다단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 생검 분자 및 세포 상호 작용을 조사 날짜에 사용할 수 전자 최선의 방법.

Introduction

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피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 그것은 세 가지 주요 레이어 외부 표피, 진피 및 피하로 구성되어 있습니다. 표피는 높은 재생 조직이다. 그것은 주로 각질 구성된 층상 편평 상피이다. 각질 세포는 기저층에서 태어나 차별화하면서 suprabasal 레이어를 통해 위쪽으로 이동하고, 결국은 자신의 출생 후 한 달에 대한 외부 각질화 층에서 발산되어있다. 표피는 모낭 및 피지선 포함 부속물들을 개발하고있다. 모낭은 생활 1 전체에 순환 방식으로 재생. 표피의 재생 능력은 interfollicular 표피와 모낭 (2)의 기저층에있는 줄기 및 전구 세포의 존재에 의해 사용할 수 있습니다.

많은 신호 전달 경로는 표피 개발 및 재생에 관여하고있다. 이들 중 일부는 내 발생이러한 헤지 호그 경로로만 표피. 다른 신호 이벤트는 진피와 표피 세 사이에 발생한다. 예를 들어, 진피의 Wnt 신호 모낭 발달에 중요한 것으로 생각되며, 그들은 활성화 성장기의 발병 모유두에서 분비되는 모낭 벌지 줄기 / 선조 세포의 증식 및 모발 성장은 4. 더 나은들이 피부암으로 회생 피부 질환으로 교란 될 수있는 방법을 이해하는 표피 발달 및 재생을 제어하는​​ 세포 및 분자 적 메커니즘....

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Protocol

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윤리 문 : 동물 주제와 관련된 모든 절차 승인 ACEC 프로토콜 13 / 64B에서 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오.

투명 마우스 피부 조직의 1. 준비

참고 : 본 연구에 사용 된 모든 마우스는 C57BL / 6 유전 적 배경에 있었다

  1. 마우스 피부 조직의 컬렉션입니다.
    1. 인도적 경추 탈구로 쥐를 안락사.
    2. 조심스럽게 피부에 상처하지 트리머 복용 관리와 관련 피부 영역에서 머리카락을 제거합니다.
    3. 워시 피부 인산염 완충 식염수 (PBS)에 70 % 에탄올로 오염을 제거합니다.
    4. 집게와 지느러미 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개를합니다.
    5. 지느러미 마우스 피부 (약 1.5 × 4cm)의 큰 영역을 해부하다.
    6. 필터 종이에 피부 진피 쪽을 평평하게하고, 샘플의 전후방 방향을 기록하십시오.
    7. 트라이PBS에서 새로 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액으로 가득 15 ML 튜브에서 m 필터 해부 피부 주위에 종이, 장소.
    8. 4 ℃에서 냉장고에 밤새 실온에서 1 시간 동안 고정하거나.
      9. <....

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Results

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성인 야생형 마우스의 전체 두께 등의 피부 생검은 기저 각질 세포 마커 Keratin14 (K14)를 결합하는 항체로 염색, 명확하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 2, 영화 1)으로 대조 하였다.

DAPI 양성 핵 샘플 (도 2A, C)에 걸쳐 볼 수 있었고, K14 염색 배타적 interfollicular 표피의 하나의 셀 두께의 기초 층에 표시이고, 피지선 (검은 색 별표)의 외주 루트 칼집을 개략적 모낭은 모발 이차 세균 (도 2B, C)에서, 앞서 구 출판. K14 염색 강도는 interfollicular 표피 원위 모낭 및 보조 헤어 세균 (흰색 별표)에 높고, 그리고 모낭 (도 2c에 니어)의 팽창 영역에서 상대적으로 낮았다. 진피 유두 명확하게 visibl도했다DAPI 라벨을 통해 전자 <.......

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Discussion

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피부 개발 및 항상성 제어 규제기구는 가장 일반적으로 피부 형태학, 세포 집단 또는 단백질 발현의 제한된 하락 가능 항체와 조직 절편의 조직 학적 염색 또는 표지를 사용하여 2 차원으로 연구된다. 다수의 방법은 표피 전체 마운트 10-13의 3 차원 단일 세포 해상도 세포 단백질의 공간적 조직의 시각화를 개선하기 위해 개발되었다. 이들 중 일부는 특히 그러나 털이 피부를 사용하여 기술적 도전 진피에서 표피의 분리를 포함하고, 종종 모낭 조직 손상 및 파손을 초래한다. 또한, 배아 개발 및 조직의 항상성 동안 그들 사이에 발생하는 세포와 분자의 상호 작용을 연구 표피와 진피 손상의 분리.

'플랫 마운트 방식은'다른 방법입니다 전체 두께 마우스피부 절개 및 면역 염색, 면역 후 신호 (14)를 유지하면서 벤질 벤조 에이트 및 벤질 알콜 (BBBA)을 이용하여 정화된다. 이 방법은 진피, 표피의 기술적 도전 분리를 필요로하지 않.......

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Disclosures

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저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 동물 실험과 지원을 위해 호주 생물 자원 (Garvan 연구소, 호주), 생물 자원 센터 (UNSW 호주)와 동물 관리 및 윤리위원회 감사합니다. 이 작품은 호주 국립 보건 의료 연구위원회 (프로젝트 그랜트 APP1062720)에 의해 지원되었다. 박사 세자르 P. 카날 레스는 CONICYT - Becas 칠레 장학금 (# 72101076)의받는 사람입니다. 씨 바셈 Akladios는 UNSW 호주로 대학 국제 대학원 상을받는 사람입니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
파라포름알데히드시그마-알드리치 P6418
에탄올 96% (비변성)Chem-supplyUN1170
나일 레드시그마-알드리치 72485-100MG
4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)로슈10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamineMerck Millipore821940
폴리에틸렌 글리콜 mono-p-isooctylphenyl etherMerck Millipore648462
Triton X-100Merck Millipore648462
SucroseSigma-Aldrich S0389
최적 절단 온도 (OCT) 화합물Tissue-Tek4583
항케라틴14 항체CovancePRB-155P
항-Ki67 항체 Abcamab16667
당나귀 안티-토끼 Alexa 594Life TechnologiesA21207
디메틸설폭사이드Sigma-Aldrich D2650
우레아머크 밀리포어66612
2,2&프라임;,2&프라임; '-니트릴로트리탄올Merck Millipore137002
컨포칼 현미경Nikon Instruments IncNikon A1 - 컨포칼 현미경
cruZer6 페이스 트리머BraunBraun cruZer6 페이스
아지드나트륨시그마-알드리치 
438456

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
  2. Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
  3. Hardy, M. H.

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