CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

Summary

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

Abstract

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 외부 표피 층은 모낭과 땀샘 우리의 몸과 표피 부속의 대부분을 커버하는 층상 편평 상피이다 interfollicular 표피로 구성되어 있습니다. 표피는 일생 동안 부상에 응답하여 재생을 겪는다. 이 긴밀하게 표피 내부와 표피와 진피 사이의 활성 여러 규제 메커니즘에 의해 규제되는 기저 상피 줄기 / 전구 세포 인구를 K14이 발현으로 활성화되어 있습니다. 이 문서는 전체 두께 마우스 피부 생검을 명확히하고, K14 단백질 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 설명, 사료된다 세포 증식라고 표시된, 나일 레드 sebocytes를 표시 및 3D에서 단일 셀 해상도 DAPI 핵 라벨. 이 방법은 정확한 평가와 피부 해부학과 병리학의 정량 및 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의 수 있습니다. 입방 프로토콜은 일입니다단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 생검 분자 및 세포 상호 작용을 조사 날짜에 사용할 수 전자 최선의 방법.

Introduction

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 그것은 세 가지 주요 레이어 외부 표피, 진피 및 피하로 구성되어 있습니다. 표피는 높은 재생 조직이다. 그것은 주로 각질 구성된 층상 편평 상피이다. 각질 세포는 기저층에서 태어나 차별화하면서 suprabasal 레이어를 통해 위쪽으로 이동하고, 결국은 자신의 출생 후 한 달에 대한 외부 각질화 층에서 발산되어있다. 표피는 모낭 및 피지선 포함 부속물들을 개발하고있다. 모낭은 생활 ¹ 전체에 순환 방식으로 재생. 표피의 재생 능력은 interfollicular 표피와 모낭 ^(2)의 기저층에있는 줄기 및 전구 세포의 존재에 의해 사용할 수 있습니다.

많은 신호 전달 경로는 표피 개발 및 재생에 관여하고있다. 이들 중 일부는 내 발생이러한 헤지 호그 경로로만 표피. 다른 신호 이벤트는 진피와 표피 ^세 사이에 발생한다. 예를 들어, 진피의 Wnt 신호 모낭 발달에 중요한 것으로 생각되며, 그들은 활성화 성장기의 발병 모유두에서 분비되는 모낭 벌지 줄기 / 선조 세포의 증식 및 모발 성장은 ^4. 더 나은들이 피부암으로 회생 피부 질환으로 교란 될 수있는 방법을 이해하는 표피 발달 및 재생을 제어하는​​ 세포 및 분자 적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다.

이 문서에서는 C의 리어 설명, U는 전체 마운트 피부 준비를 명확히하고, 공 초점 현미경에 의한 단일 셀 해상도에서 3 차원 단백질 발현 패턴을 시각화하는 B 비 I의 maging 칵테일과 C omputational 분석 (CUBIC) 프로토콜 ^5-7 nobstructed. 입방 방법은 피부의 몰입을 포함한다이 아미노 알코올 기반 화학 칵테일의 조직. 이러한 솔루션은 단일 세포 면역 해상도를 허용 투명 단백질 손상 조직을두고 피부 샘플의 굴절률을 조정한다.

interfollicular 표피와 모낭에서 각질 세포 인구를이 CUBIC 프로토콜, 기초를 사용하고 증식하는 안티 Keratin14 (K14) 및 안티 사료된다 항체를 사용하여 야생형 마우스의 전체 두께 피부 생검에 몇 군데 있었다. 야생형 피부 조직 검사에서 피지선은 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 하였다. 마지막으로, 야생형 및 증식 YAP2-5SA-ΔC 피부 생검의 기초 각질 세포 인구 ^8을 비교 하였다.

이 CUBIC 프로토콜은 단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 조직 검사에서 단백질 발현의 시각적 평가를 가능하게하고, 유전자 변형의 피부의 표피 해부학과 형태 학적 결함을 인식하는 중요한 도구입니다마우스 및 표피 개발과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사합니다.

Protocol

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 모든 절차 승인 ACEC 프로토콜 13 / 64B에서 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오.

투명 마우스 피부 조직의 1. 준비

참고 : 본 연구에 사용 된 모든 마우스는 C57BL / 6 유전 적 배경에 있었다

1. 마우스 피부 조직의 컬렉션입니다.
   1. 인도적 경추 탈구로 쥐를 안락사.
   2. 조심스럽게 피부에 상처하지 트리머 복용 관리와 관련 피부 영역에서 머리카락을 제거합니다.
   3. 워시 피부 인산염 완충 식염수 (PBS)에 70 % 에탄올로 오염을 제거합니다.
   4. 집게와 지느러미 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개를합니다.
   5. 지느러미 마우스 피부 (약 1.5 × 4cm)의 큰 영역을 해부하다.
   6. 필터 종이에 피부 진피 쪽을 평평하게하고, 샘플의 전후방 방향을 기록하십시오.
   7. 트라이PBS에서 새로 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액으로 가득 15 ML 튜브에서 m 필터 해부 피부 주위에 종이, 장소.
   8. 4 ℃에서 냉장고에 밤새 실온에서 1 시간 동안 고정하거나.
   9. 15 ML 튜브에 PBS에 세척 피부 2 × 5 분.
      참고 : 다음 (1.1.10 - 1.1.12)을 조직의 장기 저장을위한 선택적인 단계입니다.
   10. 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ㎖의 튜브에 에탄올 (25 %, 50 % 70 %)의 농도가 증가하여 PBS에서 해부 피부 탈수.
   11. 더 사용할 때까지 4 ° C에서 15 ML 튜브에 PBS에서 70 % 에탄올 탈수 피부를 저장합니다.
   12. 4시간 지우기 전에 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ml의 튜브에서 에탄올 (70 %, 50 %, 25 %, 0 %)의 농도가 감소함에 따라 PBS에서 피부 조직을 재수.
2. 마우스 피부 조직 검사를 지우기
   1. 3.85 g의 요소와 3.85 g의 N, N, N을 용해하여 CUBIC1 클리어 솔루션을 준비 ', N'70 °의 C - (60)에 설정된 히터 증류수 5.38 ㎖ 중의은 - 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민. 뜨거운 교반기를 사용합니다.
   2. 이 분명하고, 실온으로 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다.
   3. 대략적인 크기 0.2 × 0.5 cm의 생검에 날카로운 면도날와 마우스의 피부를 잘라, 그리고 15 ML 튜브에 CUBIC1 클리어 솔루션 5ml에 잠수함. 모낭의 시각화를 최적화하기 위해, 생검의 긴면이 샘플의 안테 - 후방 방향을 따라 절단되어 있는지 확인합니다.
   4. 37 ° C에서 하이브리드 오븐에서 회전하는 플랫폼에 배치합니다.
   5. 7 일 후 청산 솔루션을 변경합니다. 사용하기 전에 신선한 CUBIC1 솔루션을 준비합니다.
   6. 7 일 후 조직의 투명성을 확인합니다. 필요한 경우 조직이 완전히 투명해질 때까지, CUBIC1 청산 용액에 조직 검사를 둡니다.
   7. 피부 조직 검사가 투명하면,CUBIC1 솔루션을 제거하고 37 ℃에서 6 시간 동안 조직 4 번 씻어 1 × PBS의 4를 가하여.
   8. 37 ℃에서 4 시간 동안 15 ml의 관에서 PBS에 V 크로즈 / w 20 %의 피부 조직을 세척 하였다.
   9. -80 ° C 형 냉장고에 하룻밤 15 ML 튜브 매체 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 장착의 조직을 고정.
      참고 :이 단계는 다음 단계에서 항체 침투를 위해 조직 검사의 투과성을 증가 할 것이다.

2. 면역 형광 염색법

1. 3 시간 - 2 실온에 1.2.9에서 조직) 해동.
2. 실온에서 8 시간 동안 PBS 5 ㎖로 15 ML 튜브에 세척 조직의 OCT 화합물을 제거합니다.
3. 37 년 쉐이커에 3 일 PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X100) 100 : 2 ML 튜브로 전송 생검, 모두 1 희석, 1 ml의 토끼 방지 Keratin14 또는 토끼 항 사료된다 항체의 조직을 품어 C 오븐 °.
4. 15 ㎖의 관,로 전송 생검차 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST 5ml에 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다.
5. 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 삼일 PBST 100과 부화 : 2 ML 튜브로 전송 생검 1, 희석 차 항체 Alexa594 1 ml의 항 - 토끼를 추가합니다.
6. 15 ML 튜브로 전송 생검, 그리고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST의 5 ㎖에서 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다.
7. 2 ML 튜브로 전송 생검 추가, 1 ml의 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 핵 Counterstain과 용액 (1 : 1,000) PBST와 37 ° C 오븐에 통에 밤새 품어.
8. DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 조직을 6 시간 동안 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST 1 ㎖​​를 추가합니다.
   참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.

3. 나일 레드 염색

1. 1m의 최종 농도로 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 나일 레드 분말을 용해g / ㎖
2. 1 μg / ML의 최종 농도는 1 ㎖의 PBS로 1 μL 나일 적색 용액을 추가한다.
3. 해동이 실온에 1.2.9에서 조직) - 3 시간 및 상온에서 8 시간 동안 5 ㎖ PBS로 세척한다.
4. 2 ML 튜브에 조직 검사를 전송하고, 실온에서 2.5 시간 동안 1 ml의 나일 레드 염색 용액에 조직을 잠수함.
5. 실온에서 30 분 동안 1 ml를 PBST로 4 회 2 ㎖의 튜브 피부 생검을 씻는다.
6. 상기 2 ㎖의 튜브에서 PBST 용액을 제거 DAPI 핵으로 대조 용액 (1 : 1000) 1 ㎖를 추가 PBST로 실온에서 밤새 배양한다.
7. DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 실온에서 6 시간 동안 피부 조직을 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST의 1ml를 추가합니다.
   참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.

4. 이미지

1. (50)를 포함하는 CUBIC2 클리어 솔루션을 준비% 슈 크로즈, 25 % (w / v)의 요소, 10 % (/ V w) (w / v)의 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol 및 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100.
2. 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 진탕 기에서 2 ㎖의 튜브에 1 ㎖의 용액 CUBIC2 피부 조직을 인큐베이션. 이 단계에서는 조직의 굴절률을 고르게한다.
3. 조직의 선명도를 확인합니다. 이 클리어되면, 유리 커버 슬립 상에 그 긴 변에 전체 피부 생검 (0.2 × 0.5 cm)에 위치, 모낭의 길이 방향이 커버 슬립의 표면에 평행 같은 것을 (# 1 24 X 60mm)
   참고 : 선택 단계 : 항체 염색 생검은 약 7 일 동안 CUBIC2 용액에 저장 될 수있다. 나일 레드 염색 생검은 최대 1 일 동안 CUBIC2 솔루션에 저장 될 수 있으며, 가능한 한 빨리 군데해야합니다.
4. 영상 실을 준비합니다 (그림 1)
   (F를, 파란색 압정 반죽 또는 유사한을 재생하고,이 된 커버 (24 × 50 ㎜) : 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품은 다음과 같습니다 참고igure의 1A).
   1. 블루 압정의 두 개의 얇은 스트립 (직경 약 1mm × 2 ㎝)와 두 개의 커버 슬립 (그림 1B)를 준비합니다.
   2. 피부 생검 (그림 1C)를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 파란색 압정 스트립을 놓습니다. 4.4.3)
   3. CUBIC2 솔루션의 드롭 (그림 1C)의 커버 슬립에 스트립 사이에 피부 조직 검사를 놓습니다.
   4. 두 번째 커버 슬립 (그림 1D)와 피부 생검을 커버.
5. 공 초점 현미경의 무대에 탑재 된 피부 조직 검사와 영상 챔버를 놓고 빛 경로로 조직을 이동합니다.
6. 형광 염색 관심 지역을 식별하는 수은 또는 할로겐 광원 및 표준 표면 형광 필터 (예 DAPI / GFP / CY3 / CY5)를 이용하여 시료를 검사한다.
7. (a 10X 및 20X 대물 렌즈 (NA 0.75) 및 표준 촛점 형광 이미징 기술을 사용하여 예를 들어., DA로 주목 화상 영역PI 염색 샘플은 405 nm의 레이저와 조명과 425 사이의 형광 신호 수집 - 475 nm의, 그리고 알렉사 플 루어 594 또는 나일 레드 묻은 시료와 561 nm의 레이저와 조명과 570 사이의 형광 신호 수집 -) 620 nm의.
8. 현미경 Z 스택 화상 획득 소프트웨어를 이용하여 관심있는 각각의 영역의 영상 Z-스택을 생성한다 (예., 후술하는 바와 같이 소프트웨어 4.13 NIS 촬상 소자를 사용하여).
   1. 최적의 레이저 파워와 PMT HV를 확인 / 오프셋 설정은 샘플 형광을 수집하기 위해 선정되었다.
   2. "취득 제어"에서 "ND 취득"도구 모음을 엽니 다.
   3. (다른 모든 탭이 선택 해제되어 있는지 확인합니다) "Z 시리즈 설정"탭을 선택합니다.
   4. 라이브 스캔하는 동안, 샘플의 상단에 초점을 맞추고 "최고"버튼을 누릅니다.
   5. 샘플의 바닥에 집중하고 "바닥"버튼을 누릅니다.
   6. 입력 필수 단계 크기 (누르거나 최적화 된 스텝 크기 버튼).
   7. 사전SS 버튼 "지금 실행".
   8. 개별 티파니 이미지 스택과 같은 결과 Z-스택 (이미지 Z-스택 당 1 형광 색소)을 저장합니다.
9. 3D 분석 소프트웨어를 사용하여 관심의 3 차원 볼륨 영역을 재구성 화상 Z-스택을 사용 (예., 후술 Imaris x64의 7.2.3를 사용하여).
   1. 분석 소프트웨어를 시작합니다.
   2. 선택 3D 볼륨 생성을위한 도구 모음에 버튼을 "능가".
   3. 열기 최초의 컬러 이미지 Z 스택 (예., DAPI).
   4. 추가 색상 채널, 형광 색소 당 하나의 채널을 추가하려면 '채널을 추가'도구를 사용합니다. 따라서 DAPI와 알렉사 플 루어 594 형광 색소를 모두 포함하는 샘플은 두 개의 채널이 필요합니다.
   5. 위의 4.7에서의 결정에 따라, (XYZ)을 올바른 픽셀 (복셀) 크기를 설정하려면 "이미지 속성"도구를 사용합니다.
   6. 필요에 따라 채널의 색상을 변경하려면 "디스플레이 조정"도구를 사용하여 (예를 들어, 파란색에 DAPI 채널을 설정 알렉사 플 루어 빨간색으로 594 채널).
   7. 포에이미지 창에서 3D 볼륨을 sition, 필요에 따라 클릭하고 드래그 볼륨으로 컴퓨터 마우스를 사용합니다.
   8. 3D 영상의 스크린 샷을 생성하기 위해 도구 모음에서 "스냅 샷"도구를 사용합니다.
   9. 3D 샘플 회전의 영화를 생성하는 도구 모음에서 "애니메이션"도구를 사용합니다.

Results

성인 야생형 마우스의 전체 두께 등의 피부 생검은 기저 각질 세포 마커 Keratin14 (K14)를 결합하는 항체로 염색, 명확하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 2, 영화 1)으로 대조 하였다.

DAPI 양성 핵 샘플 (도 2A, C)에 걸쳐 볼 수 있었고, K14 염색 배타적 interfollicular 표피의 하나의 셀 두께의 기초 층에 표시이고, 피지선 (검은 색 별표)의 외주 루트 칼집을 개략적 모낭은 모발 이차 세균 (도 2B, C)에서, 앞서 ^{구 출판.} K14 염색 강도는 interfollicular 표피 원위 모낭 및 보조 헤어 세균 (흰색 별표)에 높고, 그리고 모낭 (도 2c에 니어)의 팽창 영역에서 상대적으로 낮았다. 진피 유두 명확하게 visibl도했다DAPI 라벨을 통해 전자 <...

Discussion

피부 개발 및 항상성 제어 규제기구는 가장 일반적으로 피부 형태학, 세포 집단 또는 단백질 발현의 제한된 하락 가능 항체와 조직 절편의 조직 학적 염색 또는 표지를 사용하여 2 차원으로 연구된다. 다수의 방법은 표피 전체 마운트 ^10-13의 3 차원 단일 세포 해상도 세포 단백질의 공간적 조직의 시각화를 개선하기 위해 개발되었다. 이들 중 일부는 특히 그러나 털이 피부를 사용하여 기술적 도전 진피에서 표피의 분리를 포함하고, 종종 모낭 조직 손상 및 파손을 초래한다. 또한, 배아 개발 및 조직의 항상성 동안 그들 사이에 발생하는 세포와 분자의 상호 작용을 연구 표피와 진피 손상의 분리.

'플랫 마운트 방식은'다른 방법입니다 전체 두께 마우스피부 절개 및 면역 염색, 면역 후 신호 ^(14)를 유지하면서 벤질 벤조 에이트 및 벤질 알콜 (BBBA)을 이용하여 정화된다. 이 방법은 진피, 표피의 기술적 도전 분리를 필요로하지 않...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6418
에탄올 96% (비변성)	Chem-supply	UN1170
나일 레드	시그마-알드리치	72485-100MG
4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)	로슈	10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940
폴리에틸렌 글리콜 mono-p-isooctylphenyl ether	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
최적 절단 온도 (OCT) 화합물	Tissue-Tek	4583
항케라틴14 항체	Covance	PRB-155P
항-Ki67 항체	Abcam	ab16667
당나귀 안티-토끼 Alexa 594	Life Technologies	A21207
디메틸설폭사이드	Sigma-Aldrich	D2650
우레아	머크 밀리포어	66612
2,2&프라임;,2&프라임; '-니트릴로트리탄올	Merck Millipore	137002
컨포칼 현미경	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - 컨포칼 현미경
cruZer6 페이스 트리머	Braun	Braun cruZer6 페이스
아지드나트륨	시그마-알드리치