House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1)은 현재 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청각 세포주 중 하나입니다. 이 프로토콜은 HEI-OC1 세포를 사용하여 약리학적 약물의 세포독성 효과와 내이 단백질의 기능적 특성을 조사하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
HEI-OC1은 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청각 세포주 중 하나입니다. 원래 이독성 약물 스크리닝을 위한 체외 시스템으로 제안된 이 세포는 약물 활성화 세포사멸 경로, 자가포식, 노화, 세포 보호 메커니즘, 염증 반응, 세포 분화, 약리학적 약물의 유전 및 후성유전학적 효과, 저산소증의 영향, 산화 및 소포체 스트레스, 분자 채널 및 수용체의 발현을 조사하는 데 사용되었습니다. 달팽이관 유모 세포의 몇 가지 중요한 표지자 중에서도 HEI-OC1 세포는 외부 유모 세포의 패러다임 운동 단백질인 프레스틴을 내인성으로 발현합니다. 따라서 이 중요한 청각 단백질의 새로운 기능적 측면을 밝히는 데 매우 유용할 수 있습니다. HEI-OC1 세포는 매우 견고하며, 이들의 배양은 일반적으로 큰 합병증을 일으키지 않습니다. 그러나 스트렙토마이신이나 기타 항생제를 함유한 일반적인 항균 칵테일의 사용을 피하고, 세포 증식을 자극하기 위해 33°C에서 배양하고, 세포 분화를 유발하기 위해 39°C에서 배양하는 것과 같은 몇 가지 특별한 조건이 필요합니다. 여기에서는 HEI-OC1 세포를 배양하는 방법과 세포 증식, 생존력, 사멸, 자가포식 및 노화와 같은 일반적인 분석에서 HEI-OC1 세포를 사용하는 방법, 패치 클램프 및 비선형 커패시턴스 측정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.
서론
코르티 1의 하우스 귀 연구소 - 오르간은 (HEI-OC1) 세포를 형질 전환 마우스 1, 2의 청각 기관에서 파생됩니다. 33 ° C / 10 % CO 2 (허용 조건)에서이 형질 전환 마우스에서 어떤 세포의 배양은 역 분화 가속 확산을 트리거하는 불멸화 유전자의 발현을 유도; 39 ° C / 5 % CO 2 이상의 HEI-OC1, 세포사 2,3의 경우에, 증식, 분화를 감소하고 (비 허가 조건) 리드 세포 이동.
HEI-OC1 세포를 복제하고, 10 년 전을 통해 우리의 실험실에있어서, 초기 연구는 특정 같은 prestin, 마이 오신 7A, Atoh1, BDNF, calbindin 및 칼 모듈 린 등의 인공 와우 유모 세포의 마커뿐만 아니라, 지원의 마커를 표현하는 지적했다 넥신 (26) 및 섬유 모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 등이 세포. 따라서, 평 OC1이 commo을 나타낼 수 있음을 시사되었다코르티 2의 기관의 감각과지지 세포 n 개의 전구. 페니실린과 같은 비 ototoxic 간주 약물, 2,3하지 않았다 동안 병렬 연구는 이러한 세포에서 카스파 제 -3 활성화 유도 시스플라틴 (....
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프로토콜
1. 세포 배양
주 : 모든 세포 배양 프로토콜 적절한 세포 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다 (: 실험실 편람, 볼륨 I 10 참조 용으로 세포 생물학의 제 3 장을 참조). HEI-OC1 세포는 적절한 부착 및 성장에 대한 세포 배양 접시의 추가 코팅 또는 치료를 필요로하지 않는다. 아주 중요한 : 세포 배양을 위해 유리 접시를 사용하지 않는; 표현형 및 약리학 적 약물로 세포의 생물학적 반응은 (게시되지 않은 G Kalinec & F Kalinec)을 변경한다; 기존의 플라스틱 세포 배양 요리 (재료 / 장비의 표 참조)을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 무균 기술에 특별한주의를 지불하지만, HEI-OC1 세포와 항생제 (예를 들어, 암피실린 또는 스트렙토 마이신)를 사용하지 않습니다. 필요한 경우 인 HeLa 및 HEK-293 세포 HEI OC1-8, 다른 세포주 수와 이전 시험에서 대조군으로 사용되었지만, 암포 테리 신 B를 사용이 목적을 위해 허용합니다.
- 냉동 HEI-OC1 세포의 소생
참고 맥리는 13,14 vascularis에서이 프로토콜은, 동일한 유전자 도입 11,12 코르티 기관에서의 이러한....
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결과
최근 출판물의 몇에서 우리는 몇 가지 일반적으로 사용되는 약물 약물 HEI-OC1 세포의 반응을 평가뿐만 아니라 prestin 기능 8,9을 조사하기위한 연구의 포괄적 인 세트를보고했다. 이 연구에서 우리는 이전 섹션에 설명 된 모든 프로토콜을 사용했다.
이들 이전 연구의 결과들 중 하나는 HEI-OC1 세포가 비 - 허용 조건에서 배양하는 것이 있었다 (39 ° C / 10 % CO 2 = NP-HEI-OC1)가 세포 생존 능력에 매우 크게 감소하고 똑같이 현저한 증가를 보였다 세포 죽음, 허가 조건에서 배양 된 세포에 대해서 (33 ° C / 10 % CO 2 = P-HEI-OC1) (도 1). 따라서, 어떤 세포 독성 연구는 배양 조건의 영향에서 식별 약물 효과에 상.......
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토론
이 보고서에서 우리는 어떻게 문화 HEI-OC1 세포에 대해 설명하고 약물 유발 세포 독성의 메커니즘을 평가하기 위해 그들을 사용하고 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사. 기술적 방법은, 그러나, 다른 연구에 쉽게 적응 될 정도로 일반적이다.
여기에 설명 된 모든 프로토콜은 잘 확립 된 세포 배양 기술 (10)의 올바른 사용을 필요로한다. 그냥 다른 세포주와 마찬가지로, HEI-OC1 세포와 함께 작업하는 인증 된 생물 안전 캐비닛, 냉장 원심 분리기, 물 목욕, 세포 배양 검사에 대해 하나의 반전 현미경 및 계산 셀에 대한 제대로 갖추고 세포 배양 설비를 필요로 hemocytometric 기술을 사용하는 경우. 고유 한 요구 사항은, 그러나, NP-HEI-OC1 세포 39 ° C / 5 % CO 2에서 P-HEI-OC1 세포를 33 ° C / 10 % CO 2에서 두 가습 인큐베이터, 한.......
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공개 사항
저자는 기존 또는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금 R01-DC010146 및 R01-DC010397의 지원을 받았습니다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HEI-OC1 셀 | 모든 분석 키트, 장비 | ||
| Class II 생물 안전 작업대 | : The Baker Company | Sterilgard III | 및 |
| 냉장 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS에 |
| 도립 현미경 | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES 및 기타 유사한 |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | 제품만 사용할 수 있습니다. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| 세포 인큐베이터 2개, 33°C에 1개; C/10% CO2 및 39°C에 다른 사람; C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| 세포 배양 접시, PS, 100 mm x 20 mm, 통풍구 포함 | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| 세포 배양 접시, PS, 60 mm x 15 mm, 통풍구 포함 | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar 조직 배양 플라스크 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar 조직 배양 플라스크 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest 조직 배양 플레이트, 96 웰, 뚜껑이 있는 평평한 바닥 | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-웰 화이트, 투명 바닥 | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브와 캡 Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브와 캡-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | 라이프 테크놀로지 | 10010-023 | |
| 둘베코 의 변형된 독수리' s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 없음 레드 | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| 트립신, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT 세포 증식 분석 키트 | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 분석 키트 | 키트 Promega | G8091 | |
| BrdU 세포 증식 분석 키트 | Cell Signaling | 6813 | |
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참고문헌
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....
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