방법 논문

청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

DOI:

10.3791/54425

⸱

2016년 9월 3일

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1)은 현재 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청각 세포주 중 하나입니다. 이 프로토콜은 HEI-OC1 세포를 사용하여 약리학적 약물의 세포독성 효과와 내이 단백질의 기능적 특성을 조사하는 방법을 설명합니다.

초록

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HEI-OC1은 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청각 세포주 중 하나입니다. 원래 이독성 약물 스크리닝을 위한 체외 시스템으로 제안된 이 세포는 약물 활성화 세포사멸 경로, 자가포식, 노화, 세포 보호 메커니즘, 염증 반응, 세포 분화, 약리학적 약물의 유전 및 후성유전학적 효과, 저산소증의 영향, 산화 및 소포체 스트레스, 분자 채널 및 수용체의 발현을 조사하는 데 사용되었습니다. 달팽이관 유모 세포의 몇 가지 중요한 표지자 중에서도 HEI-OC1 세포는 외부 유모 세포의 패러다임 운동 단백질인 프레스틴을 내인성으로 발현합니다. 따라서 이 중요한 청각 단백질의 새로운 기능적 측면을 밝히는 데 매우 유용할 수 있습니다. HEI-OC1 세포는 매우 견고하며, 이들의 배양은 일반적으로 큰 합병증을 일으키지 않습니다. 그러나 스트렙토마이신이나 기타 항생제를 함유한 일반적인 항균 칵테일의 사용을 피하고, 세포 증식을 자극하기 위해 33°C에서 배양하고, 세포 분화를 유발하기 위해 39°C에서 배양하는 것과 같은 몇 가지 특별한 조건이 필요합니다. 여기에서는 HEI-OC1 세포를 배양하는 방법과 세포 증식, 생존력, 사멸, 자가포식 및 노화와 같은 일반적인 분석에서 HEI-OC1 세포를 사용하는 방법, 패치 클램프 및 비선형 커패시턴스 측정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

서론

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코르티 1의 하우스 귀 연구소 - 오르간은 (HEI-OC1) 세포를 형질 전환 마우스 1, 2의 청각 기관에서 파생됩니다. 33 ° C / 10 % CO 2 (허용 조건)에서이 형질 전환 마우스에서 어떤 세포의 배양은 역 분화 가속 확산을 트리거하는 불멸화 유전자의 발현을 유도; 39 ° C / 5 % CO 2 이상의 HEI-OC1, 세포사 2,3의 경우에, 증식, 분화를 감소하고 (비 허가 조건) 리드 세포 이동.

HEI-OC1 세포를 복제하고, 10 년 전을 통해 우리의 실험실에있어서, 초기 연구는 특정 같은 prestin, 마이 오신 7A, Atoh1, BDNF, calbindin 및 칼 모듈 린 등의 인공 와우 유모 세포의 마커뿐만 아니라, 지원의 마커를 표현하는 지적했다 넥신 (26) 및 섬유 모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 등이 세포. 따라서, 평 OC1이 commo을 나타낼 수 있음을 시사되었다코르티 2의 기관의 감각과지지 세포 n 개의 전구. 페니실린과 같은 비 ototoxic 간주 약물, 2,3하지 않았다 동안 병렬 연구는 이러한 세포에서 카스파 제 -3 활성화 유도 시스플라틴 (cisplatin), 겐타 마이신과 스트렙토 마이신과 같은 ototoxic 약물을 원형 강력한 증거를 제공했다. 따라서,이 세포주는이 독성과 가능성이 독성하거나 새로운 pharmacological 약물 otoprotective 특성 선별 과정에도 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 시험 관내 시스템이 제안되었다. HEI-OC1 세포는 지난 10 년에 출판 이상의 백오십 연구에 사용 된 것으로 추정된다.

다른 약물의 잠재적 프로 - 세포 사멸 효과를보고하는 것은,이 세포주를 포함하는 대부분의 연구의 중요한 목표 이었지만, 자식 작용 및 노화와 같은 다른 중요한 세포 공정은 단지 HEI-OC1 세포 4-7 조사하기 시작했다. 나는NA는 우리의 실험실 (8)의 최근 연구는, 우리는 자주 병원에서 사용되는 다른 약물 약물에 의해 유도 된 세포 죽음, 생존, 증식, 노화와 자식 작용에 대한 데이터의 포괄적 인 세트를 수집하는 HEI-OC1 세포를 사용했다. 또한 동일한 처리를 수신하는 HEK-293 (인간 배아 신장 세포)와 헬라에서 해당 (인간 상피 세포)와 HEI-OC1 세포의 응답의 일부를 비교 하​​였다. 우리의 결과는 HEI-OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 특징적인 방식으로 각각의 약물에 반응 것으로 나타났다. 또한 실험 결과의 정확한 해석은 하나 이상의 기술 8과 평행 연구를 수행 할 필요하다고 그 연구에서 강조 하였다.

다른 연구에서는 prestin의 기능적 응답하여, 인공 모발 외부 셀 모터 단백질 (OHCs) 9를 평가 HEI-OC1 세포의 사용을 검토 입니다. 우리는 허용 (P-HEI-OC1) 및 비 - 배양 HEI-OC1 셀 내의 prestin 발현 패턴뿐만 아니라 비선형 커패시턴스 (NLC) 및 전체 셀 패치 클램프 실험을 유동 세포 계측법 및 공 초점 레이저 주사 현미경 연구보고 허용 (NP-HEI-OC1) 조건. 우리의 결과는 표기된 NP-HEI-OC1 세포에서 시간 의존적으로 총 prestin 발현 세포막 파악 증가 모두. 흥미롭게도 또한 발견 총 세포 발현에 상당한 변화없이 세포질로 세포막에서 전좌 나 + K + ATPase의 감소와 상관 관계가 NP-HEI-OC1 세포의 세포막에 prestin 지역화 증가. 또, P-HEI-OC1 세포는 강력한 NLC는 세포막에 존재 prestin 분자의 밀도가 증가 할 때 감소 된 운동 기능을 prestin하는 관련 있다고 설명했다. 요컨대, 이러​​한 결과는 강하게 HEI-OC의 유용성을 지원1 세포는 청각 단백질을 조사합니다.

이 비디오 기사에서 우리는 어떻게 약물 유발 세포 독성 및 방법의 메커니즘 / S를 평가하는 방법은 세포 독성 연구에 대한 (P-HEI-OC1) 허용 조건에서 성장 세포를 사용하는 것이 편리하다 왜 문화 HEI-OC1 세포에 설명 전기 생리 연구를 수행하기 위해 (예를 들어, 패치 클램프, 비선형 커패시턴스 (NLC))는 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사한다.

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프로토콜

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1. 세포 배양

주 : 모든 세포 배양 프로토콜 적절한 세포 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다 (: 실험실 편람, 볼륨 I 10 참조 용으로 세포 생물학의 제 3 장을 참조). HEI-OC1 세포는 적절한 부착 및 성장에 대한 세포 배양 접시의 추가 코팅 또는 치료를 필요로하지 않는다. 아주 중요한 : 세포 배양을 위해 유리 접시를 사용하지 않는; 표현형 및 약리학 적 약물로 세포의 생물학적 반응은 (게시되지 않은 G Kalinec & F Kalinec)을 변경한다; 기존의 플라스틱 세포 배양 요리 (재료 / 장비의 표 참조)을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 무균 기술에 특별한주의를 지불하지만, HEI-OC1 세포와 항생제 (예를 들어, 암피실린 또는 스트렙토 마이신)를 사용하지 않습니다. 필요한 경우 인 HeLa 및 HEK-293 세포 HEI OC1-8, 다른 세포주 수와 이전 시험에서 대조군으로 사용되었지만, 암포 테리 신 B를 사용이 목적을 위해 허용합니다.

  1. 냉동 HEI-OC1 세포의 소생
    참고 맥리는 13,14 vascularis에서이 프로토콜은, 동일한 유전자 도입 11,12 코르티 기관에서의 이러한 OC-K3, 우리 실험실에서 개발 된 마우스 및 SV-K1에서 다른 세포주와 함께 사용될 수있다.
    1. 액체 N 2에서 냉동 보관 HEI-OC1 세포의 병을 제거하고 37 ℃의 물을 욕조에 넣습니다. 바이알의 하반부 잠수함과 얼음의 소량 만이 병에 남아 때까지 해동 할 수있다. 70 % 알코올로 유리 병의 외부를 닦습니다.
    2. (둘 베코 변형 이글 배지와 같은 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 천천히 전체 부피 (~ 1.5 × 105 세포 / ㎖)을 적가 방식으로, 바이알로부터 세포를 피펫 및 배달 DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충.
    3. t를 버리고, 5 분간 300-500 XG에서 튜브를 원심 분리하여 DMSO를 제거그 상층 액을 다시 현탁 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 9 ml의 세포. 매질과 반대로, 튜브의 바닥을 터치 피펫의 팁 서너 번 피펫에서 부유 세포의 광속 환류 덩어리 또는 세포를 해리하는 시트.
    4. 100mm 직경의 비 처리 플라스틱 세포 배양 접시에서 배양 배지에 현탁하고 세포의 총 부피를 놓는다.
    5. 10 % CO 2 (허용 조건)와 33 ° C에서 세포를 품어.
  2. HEI-OC1 세포의 계대
    주 : 합류하기 전 (~ 80 %) 세포가 죽어 배양을 방지하기 위해 정지하고 계대 배양하게한다. 이 프로토콜은 또한 맥리에서 13, 14을 vascularis, 코르티 11, 12, 및 SV-K1의 기관에서 이러한 OC-K3와 같은 형질 전환 마우스에서 우리 실험실에서 개발 된 다른 세포주, 사용할 수 있습니다.
    1. PBS 2 ㎖로 세포를 오래된 매체를 제거하고 씻는다.
    2. 표면적이 25cm 당 1 mL로하여, 0.25 % 트립신 용액으로 세포 단층을 커버. 세포의 40 % 이상이 분리되어야 다음 단계로 이동한다. 필요한 경우, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하고, "때리고 또는 탭"나머지 부착 세포를 분리 부드럽게 문화 요리를.
      참고 : 세포 사망에이를 수 있습니다 오랜 기간 동안 트립신으로주의; 충분한 및 전송 된 셀 것 계획된 연구 부족.하지
    3. 1.1.3에 설명 된 절차에 따라, 세포를 재현 탁하고, 15 ml의 원추형 튜브에 옮긴다.
    4. 300-500 XG에서 5 분 동안 원심 분리, 배지를 버리고 새로운 성장 배지로 세포를 수집하고, 적어도 네 개의 100mm 직경의 세포 배양 접시 그들을 시드. 접시 당 셀의 수는 회수 된 세포의 양에 의존 할 것이다. 10 % CO 2 (P-HEI-OC1)와 33 ° C에서 세포를 품어을 위해 필요한 다시 여러 번 분할계획된 실험이나 새로운 주식을 생성.
    5. 재고 준비를 들어, 250-550 ml의 세포 배양 플라스크으로 100mm 직경의 요리를 교체; 실험을 위해, 작은 접시 또는 멀티 웰 플레이트보다 적합 할 수있다.
    6. 그들이 도달 할 때까지 차별화를 들어, ~ 허용 조건에서 80 %의 합류를 HEI-OC1 세포를 배양; 다음 2 ~ 3 주 동안 5 % CO 2 (NP-HEI-OC1)를 39 ° C로 요리를 이동합니다.
      참고 : 세포가 점진적으로 확산 죽어 중지됩니다. 죽은 세포를 제거하기 위해 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 세포가 실험에 사용할 수 없습니다 일반적으로 4 ~ 주 후, 세포의 원래의 수에 따라. 세포가 NP 조건에서 배치로 분화 빨리 시작되지만 모든 셀은 동일한 속도로 분화. 중요한 것은 정성을 제공, (그림 4를 대표 결과를 참조) 분화 과정에서 발현 및 막 지역화 증가 prestin분화의 정도를 정량적으로 표시.

2. 약물 세포 독성 연구

참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 (그림 1을 대표 결과를 참조)을 권장합니다.

  1. 세포 생존율 (MTT 분석)
    1. 1.2에 기술 된 절차에 따라 P-HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다.
    2. 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
    3. 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 제조 업체의 프로토콜 다음 MTT 분석을 수행합니다. 대개이 분석을위한 프로토콜은 다음과 같은 단계를 가지고 :
      1. 각 웰에 MTT 시약의 10 μl를 추가합니다.
      2. 보라색 ​​염료가 보일 때까지 2 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 각 웰에 MTT 세제 시약 100 μl를 추가합니다. 판을 흔들지 마십시오.
      3. 접시를 덮고 37 ℃에서 2 시간 4의 어둠 속에서 그것을 둡니다.
      4. 블랭크 (단독 성장 배지)을 포함하여, 각 웰에 570 nm에서 흡광도를 측정하기위한 마이크로 플레이트 리더를 사용. 생존율 100 %의 대조군 세포의 평균 OD를 사용하여 데이터를 정규화한다.
  2. 카스파 3/7 활성화 분석
    참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다.
    1. 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다.
    2. WH에 세포를 시드(100 μL 아니라 당) 96 웰 플레이트를 ITE 벽으로, 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
    3. 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 각 제조 업체의 프로토콜 다음 카스파 분석을 수행합니다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고
      1. , 시약을 준비들을 잘 혼합하고 실온에 평형 수 있습니다.
      2. 배양기에서 세포를 제거하고, 플레이트를 실온으로 평형을 허용한다.
      3. 같은 피펫 팁 다른 샘플을 포함 우물을 터치하지 않음으로써 교차 오염되지 않도록주의하면서 각 웰에 시약의 표시 금액을 추가합니다.
      4. 접시를 덮고 300 ~ 500 rpm으로 접시 통을 사용하여 30 초 동안 혼합한다.
      5. 적어도 30 분 동안 실온에서 플레이트를 인큐베이션. Determin경험적으로 최적의 잠복기를 전자. 실내 온도가 온도 변동이 발광 판독에 영향을 미칠 것이기 때문에, 항온 배양기를 사용하여 변동하는 경우.
      6. 물론 각각의 발광을 측정하고 카스파 제 활성화의 100 %로 대조군 세포의 평균 발광을 사용하여 값을 정상화.
  3. 세포 분열 (증식)
    1. 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다.
    2. 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 허용 조건에서 하룻밤 배양 한 다음 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
    3. 처리 1 시간 후에는, 각각의 웰에 제조 100X BrdU의 1 μL를 추가 (5- 브로 모 -2'- deoxyuri) 솔루션을 식사, 33 ° C에서 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
    4. 12, 24, 48 시간 후, 해당 판에서 기존 매체를 제거하고 PBS 잘 한 번 각을 씻는다.
    5. 제조사의 프로토콜에 따르는 세포 증식 분석을 수행한다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고
      1. / 정착 포함 제조자의 프로토콜에 표시된 변성 용액을 세척 완충액, 일차 항체 검출 용액 이차 항체 검출 용액 및 BrdU의 솔루션 시약을 준비한다.
      2. 제조자의 프로토콜에 명시된 양으로, 각 웰에 고정 / 변성 용액을 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 플레이트를 유지한다.
      3. 고정 / 변성 용액을 제거하고 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도 차 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다.
      4. 기본 개미와 솔루션을 제거ibody, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척 한 다음 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도에서 차 항체를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 이차 항체와 함께 플레이트를 유지한다.
      5. 보조 항체 솔루션을 제거 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 기판을 추가합니다. 실온에서 10 분간 배양 한 후, 정지 액을 합한다. 주의 : 색상의 변화를 제어; 용액이 매우 어두운지면, 10 분의 표준 현상 시간 전에 반응을 정지.
      6. 정지 솔루션을 추가 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
  4. 세포 독성
    참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다.
    1. 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어.
    2. 치료 끝에PBS로 세포를 세 번 세척하고, 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25cm 당 1 ml의 분리를 사용.
    3. 분리 후, 수집하고 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠릿, 상층 액을 제거하고 세포 독성 분석에 포함 된 시약으로 어둠 속에서 15 분 동안 세포를 염색.
    4. 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 라이브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다.
  5. 노화
    1. 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어.
    2. 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 알려져 Debacq-Chainiaux 외. (15) 또는 다른 방법에 의해 기재된 프로토콜 유세포하여 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 양성 세포의 수를 결정한다. 유동 세포 계수를위한 간단한 프로토콜은 다음이다 :
        <리> 실험 치료 끝에, PBS로 세포를 세 번 세척하고 허가 조건에서 1 시간 동안 세포 배양 배지에 100 nM의 Bafilomycin A1 그들을 부화.
      1. ~ 33 μM의 최종 농도 C12FDG을 추가하고 1-2 시간 동안 세포를 배양 계속합니다.
      2. 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25 cm2로 당 한 용액을 사용하여 수확 PBS로 두 번 세포를 씻어, 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여이를 펠릿.
      3. 얼음 - 냉각 PBS로 세포를 재현 탁하고 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유세포 포지티브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다.
  6. 자식 작용
    1. HEI-OC1 셀 제어 결핍 1.2에 기재된 절차를 수행하여 (48 시간 동안 혈청을 박탈) 표준 프로토콜 다음 웨스턴 블롯 그들을 처리 모은다. 일반적으로 웨스턴 블롯을위한 프로토콜은 다음과 같은 일이분기 EPS :
      1. 1.0 × 105 세포 / ml의 농도로 6 웰 플레이트에 시드 HEI-OC1 세포. 24 및 / 또는 48 시간 후, 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다.
      2. 를 Lyse와 TNESV 버퍼 (1 % NP40, 50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 100 mM의 NaCl을, 2mM의 EDTA, 1 mM의 나 3 VO 4) 얼음에 5 분간 프로테아제 억제제 칵테일과 1 ㎜ PMSF 200 μL.
      3. (각 웰의 바닥을 긁어) 세포를 모으고 4 ℃에서 5 분 동안 16,800 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮긴다.
      4. 상청액을 수집하고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화.
      5. 단백질을 변성 5 분 동안 5 배 로딩 버퍼와 각 샘플에 1 mM의 DTT과 종기를 추가합니다.
      6. 4-12 %의 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 샘​​플을 실행하고 PVDF 막에 전송할 수 있습니다.
      7. 실온에서 60 분 동안 트윈 20 0.1 %와 TBS-T에서 5 % 무 지방 건조 우유와 세포막을 차단합니다.
      8. 주 개미와 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어ibodies.
      9. 다음 날, TBS-T로 광범위하게 막을 세척하고, 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1 : 1,500)에 접합 보조 IgG 항체와 함께 품어 1 시간 동안.
      10. 강화 된 화학 발광 (ECL) 감지 시스템과 면역 반응을 감지합니다. 표준 : (10 %의 무 지방 건조 우유, TBS-T에서 000 일) GAPDH를 사용하여 단백질의 발현 수준을 정상화.
    2. 웨스턴 블롯에서의 발현을 조사하는 적어도 그러한 Beclin-1과 같은 LC3B 자식 작용의 두 가지 지표 (통상적으로 1 : 2.5 %의 BSA와 TBS-T 1000 희석). GAPDH 또는 액틴 등의 단백질 발현의 제어를 찾을 것을 잊지 마십시오.
    3. 이러한 공개 도메인 NIH 이미지 또는 ImageJ에 (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)와 같은 디지털 오 스캐너 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 농도계 관심있는 단백질의 발현을 평가한다.

HEI-OC1 세포 3. 전기 생리학 실험

  1. 수확 세포
    참고 : 사용 세포가 50 % -80 %의 포화 상태에서 100mm 직경 배양 접시에 성장합니다. 트립신, Accutase하는 cetic 산 (PBS-EDTA)를 ETRA thylene D iamine t uffered의 알린 + 전자 나 효소가없는 솔루션, 또는 P hosphate-는 gigaseals의 수와 질에 심각한 영향없이 세포를 해제 사용할 수있다 . 그러나 어떤 경우에는, 트립신 처리 세포가 더 약해한다. 이러한 경우에, 세포는 실험을 시작하기 전에 약 30 분 동안 회복 할 수있다.
    1. 10 ml의 칼슘없이 PBS 2 + Mg를 2 +로 두 번 세포를 씻으십시오.
    2. 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 분 동안 요리를 같은 비 효소 세포 분리 솔루션으로 효소가없는 분리기 용액 2 ㎖를 추가하고 품어.
    3. 세포의 분리를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 필요한 경우, 이동 CELL 배양 접시 더 세포를 분리하지만 가볍게 할.
      참고 : 접시를 흔들지 마십시오.
    4. DMEM + 10 % FBS 10 ML을 추가하고 부드럽게 및 10 ml의 피펫 다섯 번 아래로 세포를 피펫.
    5. 현미경으로 세포 봐. 셀> 80 %가 이미 (싱글)을 분리하는 경우, 더 피펫 팅이 필요하지 않습니다. 세포 클러스터 여전히 경우 80 % 이상의 세포가 하나가 될 때까지, 부드럽게 피펫 팅을 반복한다.
    6. 100 XG에 2 분, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 정지 세포의 ~ 10 ml에 배치하고 상층 액을 버린다.
    7. 세포를 재현 탁하기 - 외부 기록 솔루션 ~ 200 μl를 사용 (증류수로 310 mOsm 라이 보 비츠의 L-15 배지는 305로 조정). 셀의 광 제어 부드러운 막 가장자리 많은 단일 라운드 셀을 표시해야합니다.
  2. 패치 클램프 및 NLC 측정
    1. 패치 클램프와를 사용하여 전압 의존 비선형 용량의 측정 (NLC)을 수행dequate 증폭기 및 소프트웨어뿐만 아니라 표준 전기 생리 학적 방법. 내부 (intrapipette) 용액 사용 150 밀리미터의 KCl, 1 ㎜의 MgCl 2, 0.1 mM의 EGTA, 2 mM의 ATP-마그네슘으로서, 0.1 mM의 GTP-나트륨, 10 mM의 HEPES; 트리스와 7.2로 산도를 조정합니다.
    2. 현미경, 라운드 부드러운 막 가장자리 하나, 건강한 셀을 선택합니다. 세포 표면에 유리 피펫의 끝을 첨부하여 막 저항을 확인한다. 이는 1 ~ 2 ㎛, 피펫 팁의 내경 (ID)에 대응하는 약 3-6 수 MΩ이어야한다.
    3. 조심스럽게 세포의 세포막에 대한 마이크로 피펫 팁을 누른 다음 흡입을 적용합니다. 100 기가 옴 (기가 시일) - 세포막의 일부 (10)의 순서로 전기 저항을 발생 피펫으로 흡입한다.
    4. 흡입 펄스와 세포막을 파괴하여 전체 셀 조건을 확립한다.
    5. 제어 9로, 같은 HEK-293과 같은 prestin을 표현하지 않는 세포를 사용하여.
      참고 : 현재 응답은 5 kHz에서 필터링해야하고, 수정 잔류 직렬 저항의 효과를했다. 모든 데이터 수집 및 분석은 가장 일반적으로 로크 증폭기가 포함 된 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 용량 함수는 막 전압 16 비선형 전하 관한 두 상태 볼츠만 함수의 1 차 도함수에 장착 될 수있다.

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결과

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최근 출판물의 몇에서 우리는 몇 가지 일반적으로 사용되는 약물 약물 HEI-OC1 세포의 반응을 평가뿐만 아니라 prestin 기능 8,9을 조사하기위한 연구의 포괄적 인 세트를보고했다. 이 연구에서 우리는 이전 섹션에 설명 된 모든 프로토콜을 사용했다.

이들 이전 연구의 결과들 중 하나는 HEI-OC1 세포가 비 - 허용 조건에서 배양하는 것이 있었다 (39 ° C / 10 % CO 2 = NP-HEI-OC1)가 세포 생존 능력에 매우 크게 감소하고 똑같이 현저한 증가를 보였다 세포 죽음, 허가 조건에서 배양 된 세포에 대해서 (33 ° C / 10 % CO 2 = P-HEI-OC1) (도 1). 따라서, 어떤 세포 독성 연구는 배양 조건의 영향에서 식별 약물 효과에 상...

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토론

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이 보고서에서 우리는 어떻게 문화 HEI-OC1 세포에 대해 설명하고 약물 유발 세포 독성의 메커니즘을 평가하기 위해 그들을 사용하고 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사. 기술적 방법은, 그러나, 다른 연구에 쉽게 적응 될 정도로 일반적이다.

여기에 설명 된 모든 프로토콜은 잘 확립 된 세포 배양 기술 (10)의 올바른 사용을 필요로한다. 그냥 다른 세포주와 마찬가지로, HEI-OC1 세포와 함께 작업하는 인증 된 생물 안전 캐비닛, 냉장 원심 분리기, 물 목욕, 세포 배양 검사에 대해 하나의 반전 현미경 및 계산 셀에 대한 제대로 갖추고 세포 배양 설비를 필요로 hemocytometric 기술을 사용하는 경우. 고유 한 요구 사항은, 그러나, NP-HEI-OC1 세포 39 ° C / 5 % CO 2에서 P-HEI-OC1 세포를 33 ° C / 10 % CO 2에서 두 가습 인큐베이터, 한...

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공개 사항

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저자는 기존 또는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 NIH 보조금 R01-DC010146 및 R01-DC010397의 지원을 받았습니다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HEI-OC1 셀모든 분석 키트, 장비 
Class II 생물 안전 작업대: The Baker CompanySterilgard III및
냉장 원심분리기Eppendorf5810RPREVIOUS 2 COLUMNS에
도립 현미경ZeissAxiovert 25EXAMPLES 및 기타 유사한
WaterbathStovallHWB115제품만 사용할 수 있습니다.
Cell counterNexcelomCellometer Auto T4
세포 인큐베이터 2개, 33°C에 1개; C/10% CO2 및 39°C에 다른 사람; C/5% CO2Forma Scientific3110
세포 배양 접시, PS, 100 mm x 20 mm, 통풍구 포함Greinier Bio-One664-160
세포 배양 접시, PS,  60 mm x 15 mm, 통풍구 포함 Greiner Bio-One628160
Cellstar 조직 배양 플라스크  250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar 조직 배양  플라스크 550 mlGreiner Bio-One660-175
  6 웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest 조직 배양 플레이트, 96 웰, 뚜껑이 있는 평평한 바닥Becton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-웰 화이트, 투명 바닥Greiner Bio-One655098
50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브와 캡 CellstarsBecton Dickinson 352070
15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브와 캡-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7.4 (1x) 라이프 테크놀로지10010-023
둘베코 의 변형된 독수리' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
소 태아 혈청 (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 없음 레드Gibco/Invitrogen21083-027
트립신, 0.25% Life Technologies25200-056
TACS MTT 세포 증식 분석 키트Trevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 분석 키트 키트 Promega  G8091 
BrdU 세포 증식 분석 키트 Cell Signaling6813
비효소 세포 해리 용액 Sigma-AldrichC5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega  G8741 
FACSAriaIII 기기 BD 바이오사이언스  FACSAriaIII, 488 nm 여기(블루 레이저)
가 있는 디지털 블롯 스캐너,LI-CORC-DiGit
전기영동 및 블로팅 유닛HoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader, Soft Max Pro 5.2 소프트웨어가 포함된Molecular DevicesSpectraMax 5
패치 클램프 증폭기HEKAEPC-10
Puller for preparation용 패치 전극Sutter InstrumentsP-97
, 표시된 회사는 스 , , , , , ,

참고문헌

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