우리는 여성의 생식 기관의 정상 및 형질 전환 상피의 연구에 적합한 난소 유행 패드 이식 분석에 대해 설명합니다. 마우스 지방 패드는 큰 조직 조각의 이식을 허용 수술과 이미징을위한 쉽게 접근 할 수 있으며, 뮐러 기원의 조직에 가장 유리한 기본 환경을 제공합니다.
이 논문에서
요약
초록
마우스의 정소성 이식 분석은 세포 재생 및 종양 형질전환 연구에 매우 중요합니다. 난소 표면 및 난관 상피의 정소성 이식을 위한 일반적인 접근법에는 세포의 복강내 및 활액낭내 투여가 포함됩니다. 이러한 방법의 각각의 한계에는 주입된 세포의 위치가 제대로 정의되지 않은 것과 제한된 공간 부피가 포함됩니다. 더욱이, 그들은 이식된 장기의 장기적인 구조적 보존에 적합하지 않습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 세포와 조직 조각을 마우스 지방 패드에 도입하는 것을 기반으로 하는 대체 접근 방식을 개발했습니다. 쥐의 난소 지방 패드는 난소와 자궁관(난관, 나팔관이라고도 함) 바로 근처에 위치하며 이러한 기관의 세포와 조직에 친숙한 미세 환경을 제공합니다. 우리의 접근 방식에서는 형광 표지된 마우스 및 인간 세포와 자궁관 조각을 최소 외상성 등쪽 절개 수술을 사용하여 생착합니다. 이식된 세포와 그 파생물은 40일 이상 난소 지방 패드에 쉽게 위치합니다. 자궁관 전체를 장기간 이식하면 모든 주요 조직 구성 요소를 올바르게 보존할 수 있으며 섬유증 및 염증과 같은 부작용이 발생하지 않습니다. 우리의 접근 방식은 특정 세포 집단의 분화, 재생 및 종양 잠재력과 같은 중요한 생물학적 질문에 답하는 데 고유하게 적용할 수 있어야 합니다. 또한 정상 발달 및 암의 미세환경 요인 연구에 적합해야 합니다.
서론
마우스의 특정 신체 부위에 세포 및 조직의 도입을 포함하는 이식 분석은 조직 재생 및 발암 연구 필수적인 접근을 나타낸다. 동 소성 이식 세포, 즉 네이티브 환경에 자신의 위치는, 성체 줄기 세포의 특성화에 특히 중요하다. 유방 줄기 세포의 존재가 제 1 마우스 선없는 유방 지방 패드에 유선 상피 단편 이식에 의해 제안되었다. 인간화 된 마우스 지방 패드 2에 생착 분석은 인간의 기본 유방 상피 세포의 재생 가능성과 정상적인 발전을 요점을 되풀이하는 데 사용되었다. 또한, 클리어 유방 지방 패드에 별개의 표현형 세포 유형의 직렬 및 제한 희석 유방 이식은 줄기 세포 3-5의자가 재생산 능력과 multilineage 분화를 시험하는 것이 중요했다. combinat에 이식 분석유전 적 혈통을 가진 이온은 유방 발암 5 원산지 셀의 증거를 제공하는 추적. 신장 이식 캡슐은 일반적으로 추정되는 전립선 줄기 세포 (6)의 특성을 테스트하기 위해 사용된다. 정상 및 종양 마우스와 인간의 췌장 organoids의 동 소성 이식은 암의 진행 7 변경 유전자와 경로를 한 것으로 밝혀졌습니다. 네이티브 환경의 중요성도 후 같은 유방 지방 패드, 어깨 지방 패드, 다시 피부 (8)과 같은 다른 위치로 땀샘의 engraftments 다양한 재생의 데모에 의해 지원되고있다.
복강과 난소 점액낭은 일반적으로 여성의 생식 기관 9-12의 상피 세포의 동 소성 이식을위한 장소로 사용된다. 이들 방법은 모두 많은 한계가있다. 세포를 복강 내 주사는 복강 다양한 분야에서 자신의 주입에 이르게함으로써 COM세포의 성장을 모니터링 plicating. 또한, 미세 환경의 변화, 예컨대 혈관, 신경 분포 및 면역 세포의 표현 정도와 같이 복강 다양한 분야에서 매우 중요 할 수있다. 난소 점액낭은 액체의 이하 10 μL의 주입을 허용, 매우 제한된 볼륨이 있습니다. 이로 인해 투여 될 수있는 세포의 양을 제한한다. 또한, 난소 점액낭에 주사 매우 기술적으로 어려울 수 있으며, 절차는 상당한 시간을 필요로한다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 난소 지방 패드의 특성의 장점을 가지고있다. 마우스 난소 지방 패드는 큰 크기를 가지며 난소 및 자궁 관에 인접하고, 수술을 용이하게 접근 할 수있다. 이는 말 영양막 마우스 난소 지방 패드 (13)에 이식 될 수 있다고보고되었다. 그러나 이러한 방법의 상세한 설명은 생략 하였다. 또한이 날 경우보고되지 않았다THOD는 성숙한 세포 및 조직에 적용될 수있다. 여기서는 마우스 및 여성 생식 기관의 인간 세포 이식을위한 신뢰성있는 방법을 설명하고,이 방법은 또한 장기 장기 이식에 적용 할 수 있음을 보여준다.
프로토콜
설명 된 모든 생체 내 작품은 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된다.
난소 지방 패드 시험 법 1. 샘플 준비
- 분리 및 문화 차의 두발 상피 (TE) 세포
- CO에 의해 8 주령 처녀 β - 굴지 - 강화 된 녹색 형광 단백질 (EFGP) 또는 β-액틴 Discosoma 붉은 형광 단백질 (을 DsRed) 마우스에 자궁 경부 전위 다음이 관리 기증자 6- 안락사. 발가락 핀치에 의해 성공적으로 안락사를 확인합니다.
- 흡수 드레이프, 복부 쪽이 위로에 개별 마우스를 놓은 다음 70 % 에탄올로 복부를 닦아냅니다. 신체 중앙선에서 횡 절개함으로써 손가락 끝 위에서 마우스의 머리와 꼬리쪽으로 절개 아래의 피부를 당기로 피부를 연다.
- 무딘 집게를 사용하여 복막을 잡고 체강을 열 미세 가위로 절단을합니다. 조심스럽게 intestin의 코일을 밀어옆으로 전자 및 생식 기관을 찾습니다.
- 미세 집게로 한 자궁 경적을 선택하고 자궁 뿔이 분리 점 이상 0.5 cm를 잘라. 자궁 경적을 누른 상태에서, 결합 자궁 뿔에 부착 조직, 자궁 관 난소와 난소 지방 패드를 멀리 해부하다. 6 ml의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 함께 접시에 해부 생식 기관을 배치합니다. 두 번째 생식 기관을 진행합니다.
- 바이오 안전성 캐비닛에 접시를 전송하고 멸균 PBS 6 ml의 조직을 3 회 씻는다. 바이오 안전성 캐비닛에있는 해부 현미경 작업을 계속합니다. 미세 핀셋 자궁 뿔을 잡아와 자궁 - 난관 접합부에서 절단하여 자궁 관에서 자궁 경적을 분리합니다. 25 G 바늘을 사용하여 난소를 둘러싼 난소 점액낭을 잘라.
주 : 점액낭 난소가 제거 된 후, 박리가 완료되고 개개의 자궁 관의 PBS 용액에 남아있다. - 자장하게 이동3.5 cm 접시에 PBS의 50 μl의 강하 전자 자궁 튜브와 28 게이지 바늘을 사용하여 0.1 mm 조각으로 말하다. 200 μL 소화 버퍼 1 (둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) F12이 (햄) 매체가 300 단위 ml의 -1 콜라게나 100 단위 ml의 -1 히알루로 보충) 및에 전송 5 % CO에서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양 2 배양기.
- 배양 후, 1 ml의 0.25 %의 트립신 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가하고 1 ML의 피펫 팁 (일명 블루 팁) 3 분간 20 배의 도움으로 솔루션을 일시 중지합니다. (햄) 매체는 2 % 소 태아 혈청을 포함하는 5 ml의 + 4 ° C DMEM / F12를 추가합니다.
- ((햄) 매체는 7 밀리그램 ml의 -1 스파 아제 (Dispase) II 10 μg의 ml의 -1 디옥시리보 뉴 클레아 제 I 보충 원심 분리 (600 RCF, 5 분, 실온 (RT))에 의해 조직을 수집하고 1 ML의 소화 버퍼 2 (DMEM의 F12를 추가 DNase의의 I)). 1 ml를 피펫 TI의 도움으로 조직 펠렛을 20 회 일시 중단피.
- 5 ml의 무 혈청 완전한 마우스 난관 상피 세포 성장 매체 (M-TE-GM, 표 1)를 추가합니다.
- 원심 분리하여 세포 (600 RCF, 5 분, RT)을 수집합니다. 일시 중지 및 혈구로 세포를 계산, 1 ml의 M-TE-GM을 추가합니다. 종자 1 × 10 5 24 웰 낮은 부착 판에 웰 당 1 ml의 세포 4 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 M-TE-GM에 품어.
- 매일 매체를 변경합니다.
- β - 액틴 EGFP 또는 β-액틴을 DsRed 쥐에서 배양 차 서스펜션 TE 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 24도 낮은 부착 판에서 TE 서스펜션 문화를 수집합니다. 1 ml의 0.25 % 트립신 - EDTA와 원심 분리기 (600 RCF, 5 분, RT) 및 일시 중단 세포 펠릿. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 5 ㎖의 DMEM / F12 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 (햄) 배지를 첨가함으로써 트립신 활성을 멈춘다. 원심 분리 (600 RCF, 5 분, RT)에 의해 세포 알약을 수집합니다.
- 세척 세포 펠렛을 두 번 차가운 PBS (4 ° C)의 4 ㎖로, 세포 펠렛 당 1 ml의 PBS를 추가하고 일시 중지합니다. 혈구에 의해 세포를 계산 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 전송할 수 있습니다. 얼음에서 작업, 10 ㎕의 PBS에 1 × 10 5 세포를 추가 한 후 10 μl의 기저막 행렬을 추가합니다. 일시 중지 및 동물의 방에 얼음 운반 할 것.
참고 : 무균 조건 하에서 바이오 안전성 캐비닛에있는 모든 해부 및 조직 문화 작업을 수행합니다.
- 불멸화 된 인간 세포주의 제조
- 별도로 성장 렌티 바이러스-EGFP 및 -mCherry 표시 인간의 불후의 난소 표면 상피 세포 lineHIO118 80까지 - 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10cm 요리에 90 % 포화 상태.
- 10 ml의 PBS로 두 번 설거지, 접시 당 1 ml의 0.25 %의 트립신 - EDTA를 추가하고 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 10 ㎖의 DMEM / F12 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 (햄) 배지를 첨가하여 반응을 정지. 수집원심 분리하여 세포 펠렛 (600 RCF, 5 분, RT).
- 세척 세포 펠렛을 두 번 차가운 PBS (4 ° C) 10 ㎖로, 세포 펠렛 당 1 ml의 PBS를 추가하고 일시 중지합니다. 혈구에 의해 세포를 계산 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 전송할 수 있습니다.
- 얼음에서 작업, 1.0 × 10 6 렌티 - mCherry 표시 셀 + 1.0 × 10 6 렌티-EGFP 10 μl의 PBS로 세포를 표지에 추가합니다. 10 μl의 기저막 행렬을 추가합니다. 일시 중지 및 동물의 방에 얼음 운반 할 것.
- 자궁 튜브의 제조
- 1.1.1-1.1.5 단계에 설명 된대로 6에서 PBS에서 8 주 이전 처녀 β - 액틴을 DsRed 마우스 개별 자궁 튜브를 해부하다. 해부 현미경 PBS의 200 μL 드롭으로 하나의 자궁 튜브를 전송합니다. 부드럽게 mesosalpinx, 자궁 관의 세그먼트를 지원하는 폭 넓은 인대의 일부를 제거하여 핀셋, 28 게이지 주사 바늘의 도움으로 자궁 관 풀다. (2)의 드롭 단일 uncoiled 자궁 튜브를 배치00 μl의 얼음처럼 차가운 PBS받는 사람의 난소 지방 패드가 노출 이식을받을 준비가 될 때까지.
2. 난소 지방 패드 이식
참고 : 각 동물 수술 사이에 악기를 소독. 준비하고 사전에 모든 장비를 배치. 이 비장를 방지로 오른쪽 난소 지방 패드 등의 이식이 우선이다. 그러나받는 사람은 모두 난소 지방 패드에 이식을 가질 수있다.
- 동계 마우스 또는 일차 전지의받는 등 심한 결합 된 면역 결핍 (SCID / NCR) 마우스를 사용합니다. 인간의 세포와 같은 HIO118 세포를 사용 놋 / SCID / 감마 (NSG) 마우스 나 SCID 마우스하십시오.
- 0.15 ml / 10 g 체중의 투여 량 2,2,2- Tribromoethanol 단일 복강 내 주사로받는 마우스를 마취. 동물 후드, 가열 패드에있는 동물을 놓고 페달 반사 (발가락 핀치)의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 그동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용동물 마취입니다. 수술 - 후 통증 치료 4 밀리그램 / g 체중의 투여 량에서 진통 케토 프로 펜과 동물의 피하에 주입한다.
참고 : 다른 방법으로 마취에 대한 이소 플루 란을 사용합니다. 유도 챔버에 놓고, 동물 0.8-1.5 L / 분, 2-3 %로 이소 플루 란 기화기에 산소 유량계를 조정한다. 챔버에서 마취 동물을 제거 후 수술을 시작, 마스크에서 이소 플루 란을 흡입 및 0.4-0.8 L / 분 1.5 %로 이소 플루 란 기화기에 산소 유량계을 설정할 수 있습니다. - # 40 가위로 수술 영역을 면도; , 영역에서 두 배의 외과 영역 모발 제거 70 % 에탄올 다음 포비돈 요오드 세 살균 수술과 면도 된 피부를 준비하고 멸균 드레이프 커버.
- 바이오 안전성 캐비닛에있는 해부 현미경으로 동물을 이동합니다. 직접 난소 지방 패드 위의 dorsomedial 위치에 절개하여 생식 기관을 노출.
참고 : 치명타iCal의 단계 : 정확한 피부 절개는 상처 치유를 촉진은 메스의 사용 단계 2.4 권장합니다. - 사용 무딘 미세 집게는 신경 및 주요 혈관의 손상을 최소화 조심스럽게 중간 선으로 절개를 통해 난소 지방 패드를 당깁니다.
중요한 단계 : 출혈이 발생하면, 수술을 중단하고 다른 숙주 동물에게 이식을 고려한다. - 28 게이지 경 바늘의 도움으로 해부 현미경의 제어하에 난소 지방 패드로 2-4mm 깊은 절개, 난소 위 3-4mm합니다.
중요한 단계 : 절개 만 지방 패드의 절반을 통과 있는지 확인; 바닥면까지 줄곧 천공하여 누설을 야기한다. 신속하고이 단계 후 지체없이 진행합니다. - 세포 이식의 경우, 세포 기저막 매트릭스 혼합물을 10 내지 20 μL의 주사기 (30 게이지 니들)을 채우고 지방 패드에 주입 절개. 자궁 관 이식의 경우, 자궁 관 재치를 데리러시간 미세 집게와 10 위 - 20 μl의 기저막 행렬은 얼음에 보관. 0.1 / 20 μl를 사용 XL (3 mm 정도 단축) 필터 팁 조직 및 기저막 매트릭스 정지를 픽업하여 지방 패드 절개로 해제를 졸업했다.
- 기저막 행렬이 응고 다시 복막에 생식 기관을 배치하는 5 분 정도 기다립니다. 이 수술 봉합의 stiches와 두 개의 작은 상처 클립이나 수술 봉합사로 피부와 근육을 닫습니다.
- 반복 제어 될 것 동물의 콘트라 측면 지방 패드에 PBS-기저막 매트릭스 혼합물을 이식 2.4-2.8 단계를 반복합니다.
중요한 단계 : 열 손실은 마취 된 쥐의 급격한 때문에 수술 후, 가열 패드에 동물을 배치합니다. - 동물 네이티브 장에 가열 패드에 복구하고 마취에서 완전히 깨어 때까지 동물을 관찰 할 수 있습니다. 이 sterna을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오리터로 누워. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
- 수술 후 케이지에 음식을 건조뿐만 아니라 케이지 내부에 미리 젖은 음식 펠렛의 소수를 놓습니다. 다음 몇 일 동안 필요한 경우 수술 후 진통제를 적용하고 매일 상처를 검사합니다. 창상 감염이 발생하는 경우 승인 된 동물 프로토콜에 따라 항생제를 적용합니다. 상처가 완전히 폐쇄되면 수술 후 상처 클립 10 일 제거합니다.
3. 조직학 및 이미지 인식
- 이식 수집 및 보존
- 4 ml의 10 배 PBS 10 ml의 16 % 파라 포름 알데히드 용액으로 26 ML의 DDH 2 O를 혼합하여 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 제조 하였다.
- 하나의 블록에 접목 난소 난소 지방 패드, 자궁 관, 1.1.1-1.1.4 단계에 설명 된대로 0.5 cm의 자궁을 해부하다. 즉시 2 ml의 4 % 파라 포름 알데히드에 배치하고 실온에서 2 시간 동안 고정한다. 동일한 동물로부터 비 접목 해부대조군으로서 PBS-기저막 매트릭스 혼합물을 이식 반대측 난소 지방 패드 시스템 (단계 2.9 참조). 수정과 동일한 방식으로 처리.
- 정착 세척 후 5 분 동안 PBS로 3 회 조직 및 4 ℃에서 PBS에서 밤새 배양한다.
- 난소 지방 패드의 전체 마운트 이미징 3.2.1 단계로 진행합니다.
참고 : 이미지 수집 조직이 얼 수 후 (3.3.1) 또는 파라핀 포함 (3.3.2)에 대한 처리. 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당의 하룻밤 배양 냉동 조직의 품질을 향상시킵니다.
- 이미지 획득
- 형광 첨부 컬러 카메라와 플랜 갖춘 4 배 목적 및 실체와 에피 형광 부착 고화질 컬러 카메라 장착 PBS 가득 요리 거꾸로 현미경을 사용하여 화상 난소 지방 패드 시스템 - 온 탑재 장소 아포 1xWD70, ED 계획 1.5xWD45 목표.
- 조직학
- 수행원전체 마운트 이미지 수집 (3.2.1) 실험 영화와 집게를 사용하는 2 × 1cm의 조각에 냉동 조직 표본에 대한 매체를 포함하는 200 ~ 500 ㎕를 드롭 배치, 드롭에 조직을 전송합니다. 하나의 가장자리에 필름을 들고 1.8 ml의 극저온 유리 병에 조직 매체 드롭을 전송합니다. 유리 병을 닫고 액체 질소에 뛰어 들다. -80 ° C에서 냉동 조직을 저장합니다.
- 또한, 표준 파라핀 삽입 진행합니다. 각 단계에 대한 조직 부피의 20 ~ 40 볼륨을 사용합니다.
- 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번 65 % 에탄올에 담가 조직.
- 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분 동안 한 번에 70 % 에탄올에 조직을 담가. 이 단계에서 샘플 RT에서 개월 동안 저장 될 수있다.
- 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번 90 % 에탄올에 담가 조직.
- 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번, 95 % 에탄올에 담가 조직.
- 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분 동안 두 번 무수 에탄올 (200 증거)에 조직을 담가. <리> 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분간 클로로포름에 두 번 조직을 담가.
- 58 ° C에서 부드럽게 흔들어 30 분간 파라핀에 한 번 조직을 담가.
- 58 ° C에서 부드럽게 흔들면서 12 시간 동안 파라핀에 한 번 조직을 담가.
- 58 ° C에서 3 시간 동안 파라핀에 한 번 조직을 담가.
- 금속 조직학 금형에 조직을 배치하고 58 ° C 파라핀와 금형을 입력합니다. 파라핀의 상단에 플라스틱 조직학 카세트를 추가하고 4 ℃로 파라핀을 냉각. RT에서 파라핀 조직 블록 및 저장의 압축을 풉니 다.
참고 : 파라핀의 온도가 면역 조직 화학 염색에 적합한 조직의 최적의 보전을 위해 58 ° C를 초과하지 않아야한다.
- 또한, 표본 처리 젤과 파라핀 포함]를 준비합니다.
- PBS를 대기음 및 70 % 에탄올로 전체 마운트 조직을 전송합니다. 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. 수조에서 예열 시험편을 60 ℃로 겔을 처리하는 단계를 포함한다.
- PipettE 실험실 필름 늘어선 페트리 접시 위에 시료 처리 겔 200 μL. 사용하여 미세 해부 집게는 시편 처리 겔 드롭에 전체 마운트 조직 시스템을 전송합니다.
- 시험편 가공 겔 플러그 실온에서 고화, 4 ° C에서 10 분 동안 플러그를 고체화 할 수있다.
- 조직 검사 폼 패드 사이에 끼워 조직학 조직 카세트에서 시료 처리 겔 포함 된 조직을 놓습니다. 단계 3.3.2-3.3.2.10과 파라핀에 포함.
참고 : 시료 처리 젤 삽입 손실을 방지하고 작은 깨지기 쉬운 조직 샘플을 보존 할 수 있습니다.
참고 : 냉동 또는 파라핀 삽입에 의해 보존 된 조직이 면역 조직 화학 염색 14, 15에 적합하다.
결과
세포 및 조직 실험을 정확하게 해부 현미경 (도 1) 하의 난소 지방 패드로 이식 될 수있다. 예는 보편적으로 EGFP (그림 2A) 또는을 DsRed (그림 2B) 및 HIO118 16, 17 세포가 mCherry와 EGFP 렌티 바이러스로 표지 인간의 불후의 난소 표면 상피 세포 (- F 그림 2C)를 발현하는 마우스에서 파생 된 기본 마우스 난관 상피 세포를 포함한다. 이 접근법은 또한 마우스 자궁 관 (도 3)와 같은 기관 장기 이식에 적용 할 수있다. 면역 조직 화학 염색에 따르면, 모두 섬모 (FOXJ1 긍정적 14)과 분비 (PAX8 양성 15) 세포 이식 조직 (그림 3D 및 E)의 난관 상피 세포에서 유지됩니다.
그림 1 :. 이식 (화살표)의 난소 지방 패드 이식 (A) 노출 영역입니다. (B) 절개 28 G 바늘 (화살표)에 의해 이루어진다. 피펫 팁 (화살표)에 의해 (C) UT / 지하 막 매트릭스 혼합 생착. (D) UT 접목 (화살표, 밝은 빨강, β - 액틴을 DsRed 마우스의 UT). FP, 지방 패드; 오븐, 난소; UT, 자궁 관. 스케일 바 = 2 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 이식 마우스 차 두발 상피 세포와 인간의 감지 불멸화 된 난소 표면 상피 세포 (A, B) 아웃 기본 마우스 난관 상피 세포 팔일 동계 마우스에 이식 후 (A, 녹색) 및 β - 액틴을 DsRed (B, 레드) β - 굴지-EGFP 마우스의 (화살표)의 성장. (C, D)는 십일 NSG 생쥐에 이식 후 렌티-EGFP (녹색) 또는 렌티 - mCherry (빨간색) 중 표지 혼합 HIO118 세포 (화살표)의 Engraftments. (D) (C, 화살표)에서 확대 영역입니다. (E, F) 이식은 SCID 마우스 (화살표)에 D, 사십삼일 C에서와 같은 세포의 이식 후 개발했다. AD, F, 형광; E, 시야, FP, 지방 패드; 오븐, 난소; UT, 자궁 관. (A, B, DF) 스케일 바 = 500 μm의; (C) 스케일 바 = 1600 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 자궁 관 이식의 특성. (A) β - 액틴을 DsRed 마우스 육일 난소 지방 패드로 이식 후의 전체 자궁 관 (화살표) (화살표, 밝은 빨강). (B) (A)에 도시 이식과 지방 패드의 형광등 동결 절편. 레드,을 DsRed; 청, 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 핵으로 대조. (C) 자궁 관 이식 (화살표) NSG받는 사람 마우스 (화살표)에 이식 후 사십일. 파라핀 섹션. 올바른 모든 원칙 자궁 관 구성 요소의 보존 및 이식 관련 섬유화와 염증의 부족을합니다. 헤 마톡 실린과 에오신 염색. (D, E) 감지 난관 상피 세포 마커 짝 박스 유전자 8 (PAX8) 및 Forkhead 상자 J1의 (FOXJ1, 갈색 핵 색상, 화살촉)에 도시 이식 (화살표)의 세포 ( C). Immunoperoxidase 시스템. 메틸 녹색으로 대조. FP, 지방 패드; 오븐, 난소; UT, 자궁 관. (A) 스케일 바 = 1000 μm의; (B) 스케일 바 = 200 μm의; (CE) 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 1 배 DMEM F12 (햄) 매체 |
| L 글루타민 | 2 밀리미터 |
| 나트륨 pruvate | 1 ㎜ |
| 표피 성장 인자 | 10 NG ml의 -1 |
| 염기성 섬유 아세포 성장 인자 -2 | 10 NG ml의 -1 |
| 하이드로 코르티손 | 500 NG ml의 -1 |
| 인슐린 | 5 μg의 ml의 -1 |
| 트라nsferrin | 5 μg의 ml의 -1 |
| 아 셀렌 산 나트륨 | 5 NG ml의 -1 |
| 소 알부민 | 0.10 % |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | 100 단위 ml의 -1 / 100 μg의 ml의 -1 |
| 최소 필수 중간 독수리 (MEM) 비 필수 아미노산 | 0.1 mM의 |
| 베타 - 머 캅토 에탄올 | 10-4 M |
표 1 :. 마우스 두발 Epithelim 성장 매체 (M-TE-GM) 구성 요소의 왼쪽 열에 표시는 1 배 DMEM의 F12 표시된 농도 (햄의) 중간, 오른쪽 열에에 용해시킨다. 최종 배지 조성물은 무료 혈청입니다.
토론
우리는 상피 세포와 조직의 정확한 전달 및 검출을 허용 난소 지방 패드 이식 분석을 설립했다. 난소 지방 패드 분석 이식 절차는 적은 기술적으로 도전 intrabursal 주입 10-12보다 더 균일하고 복강 내 주입 구에 비해 이식 된 세포의 정확한 위치 수 있습니다. 또한, 웰 등 자궁 관으로 전체 기관의 장기 이식에 적합하다.
중요한 것은, 난소 지방 패드는 여성의 생식 시스템의 상피 세포에 대한 친숙한 미세 환경을 제공합니다. 그것은 재생 및 악성 변환하는 동안 인간 및 마우스 난소 및 난관 상피 세포의 분자 및 세포 특성의 연구에 특히 적합해야한다. 다른 장기 달리, 몇몇 연구는 암 연구의 상피에서 식별 및 줄기 세포의 특성에 초점을 맞추었다eproductive 기관 18, 19. 많은 암이 성체 줄기 세포 (20)로부터 발생한 것으로 생각되기 때문에 이러한 연구는 특히 중요하다. 상피 성 난소 암의 또 세포의 기원은 18 매우 논쟁의 여지가 남아있다. 상피 난소 암은 난소 암의 대부분을 차지, 미국 (21)에서 여성의 모든 암 관련 사망 중 5 위입니다. 기존의 이식 기술 9-12에 비해 여러 가지 장점을 가진 소성을 분석의 따라서 개발은 크게이 분야의 연구를 촉진해야한다.
난소 지방 패드의 표면 위치를 감안할 때, 작은 동물 이미징 시스템은 강한 형광 발광 생물 기자로 표지 engraftments에 후속하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 비선형 현미경 22 침습적 고해상도 라이브 영상 분석을 확립하는 것이 가능해야한다. 난소 지방 패드는 또한 기관 배양에서 유지 될 수 있도록함으로써,밀접 세포 조직 및 세포 외 기질을 recapitulating 조건 하에서 정상 및 종양 상피 조직의 3 차원 배양을 보내고. 앞으로의 연구는 이러한 유망한 가능성을 해결해야합니다.
몇몇 중요한 단계가 고려되어야한다. 가열 패드를 제공하고 수술 중 따뜻한 설치류 유지 크게 생존율을 향상시킨다. 지방 패드를 취급 상품의 불임이 접목 시스템이 멸균 유지되도록합니다. 우리의 경험, 이식의 성장 지연에 상당한 출혈이 결과에서. 중요한 것은, 지방 패드의 절개를 정확하게해야한다 지방 패드를 찢어 또는 출혈의 원인 통해 천공 때문이다. 응고제는 필요에 출혈을 멈추게하는 데 사용되어야한다. 개발하지 engraftments 경우, 분사 셀의 높은 농도를 고려해야한다. 첫 번째 성공의 outgrowths는 이식 후 일주 일찍 관찰하고 가장 눈에 띄는 것이어야한다 engraftments 할 수있다시술 후 한 달. 이식의 경우, 큰 직경 (23-25 G)와 바늘 (직경 10 ㎛ 이상)을 큰 셀 밀림을 방지 할 수있다. 그러나, 이러한 바늘은 지방 패드에 더 외상 할 수 있고, 그 사용이 사전에 시험해야한다. 실험을 위해 우리는 6 ~ 8 주 이전 기증자와받는 사람 마우스를 사용하고 있습니다. 두 목적을 위해 이하의 이상 마우스를 사용할 수있다. 그러나, 주입 된 세포의 수는 조절 될 필요가있다. 이하 도너 난소 지방 패드의 작은 크기도 고려 될 필요가있을 것이다.
어떤 방법과 마찬가지로, 마우스 난소 지방 패드 이식 분석의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 동계 면역 능력이 쥐가 쥐의 기본 세포 / 조직에 사용할 수 있지만, 우리의 기술은 NSG 인간 물질의 이식 SCID 마우스가 필요합니다. 이는 인간 상피 세포의 성장을 지원하기 위해 지방 패드를 인간화 가능 쉽다. 그러나, 우리는 아직이 방법을 테스트하지 않았습니다. 젊은 철의 사용남성은 낮은 사육 비용을 이끌 수있다; 그러나, 성숙한 처녀 암컷 마우스 (8 세 ~ 10 주)함으로써 더 큰 표본의 이식을 허용, 더 큰 지방 패드가 있습니다. 마지막으로, 실험실 직원은 절차의 신속하고 성공적인 실행을 보장하기 위해 동물 수술 훈련을해야합니다.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 인간의 세포 HIO118를 제공하기 위해, 박사 앤드류 K. 윈, 캔자스 의료 센터의 대학에게 감사의 말씀을 전합니다. (; T028095 NYSTEM) 모자 건강 및 AFN에 인간 개발 (P50HD076210)의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 및 NYSTEM (C028125, C024174과의 보조금이 연구는 뉴욕 줄기 세포 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 T028095), 건강 / 국립 암 연구소 (CA182413)와 아인에 난소 암 연구 기금 (327516)의 국립 연구소.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 25 게이지 바늘 | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 게이지 바늘 (바늘이 부착된 피하 주사기) | Kendall | 30339 | 부품 번호: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| 기저막 매트릭스 (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed 마우스 | 잭슨 연구소 | 6051 | B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP 마우스 | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| 소 알부민 | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| 클로로포름 | VWR | EM-CX1058-1 | |
| 콜라겐분해효소/히알루로니다아제 | 줄기세포 Technologies | 7912 | |
| 극저온 바이알 | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| 동결 조직 표본용 임베딩 배지(O. C. T.) | 사쿠라 파인텍 | 4583 | |
| 표피 성장 인자 | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| 에탄올 200 증거 | Koptec | V1001 | 은 70%를 준비합니다. |
| 태아 소 세럼 | Sigma | F4135 | |
| 필터 팁 0.1-10/20 &마이크로; l XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 항체 | eBioscience | E10109-1632 | 1:1,000 농도에서 사용(마스킹 없음) |
| 하이드로코르티손 | Sigma | H0135 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
| 실험실 필름(Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-글루타민 | 코닝 | 25-005-Cl | |
| 인슐린-트랜스퍼린-아셀렌산나트륨 | 시그마-알드리치 | I884 | |
| 이소플루란, 250ml | 산타크루즈 동물 건강 | sc-363629Rx | |
| 저부착 플레이트 24-웰 | Costar | 3473 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Corning | 25-025-Cl | |
| 금속 조직학 금형 | 전자 현미경 과학 | 62527-22 | |
| 현미경, 반전 | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| 현미경, 스테레오 | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma(NSG) 마우스 | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| 파라포름알데히드 16% 용액 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 파라핀(Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 항체 | Proteintech | 10336-1-AP | 농도 1:1,000(마스킹 해제 없음) |
| PBS(인산염 완충 식염수) | 코닝 | 21-030-CV | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Corning | 30-002-Cl | |
| 중증 복합 면역결핍증(SCID/NCr) 마우스, BALB/C 배경) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| 소듐 피루베이트 | Corning | 25-000-Cl | |
| 검체 처리 젤(HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| 자당 | 시그마 -알드리치 | S0389 | |
| 트립신 -EDTA, 25 % | 코닝 | 25-053-CL |
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