Method Article

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

DOI:

10.3791/54446

⸱

September 20th, 2016

 ,  , 
1Super-Bacteria Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 2Microbiomics and Immunity Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Bioengineering (KRIBB), 3Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자연적 진화는 환경 변화와 같은 유전적 다양성과 작은 개체군 간의 선택을 포함합니다. 적응형 실험실 진화(ALE)는 통제된 조건과 스트레스 요인 하에서 살아있는 유기체를 사용하여 진화를 관찰하는 실험 상황을 말합니다. 따라서 유기체는 인위적으로 진화적 변화를 일으키도록 강요됩니다. 미생물은 환경에서 다양한 스트레스 요인에 노출되며 스트레스를 유발하는 특정 단백질을 조절하여 생존 가능성을 높일 수 있습니다. 자연적으로 발생하는 자발적 돌연변이는 미생물의 생존 가능성에 영향을 미치는 미생물의 게놈에 변화를 일으킵니다. 화학물질 배양에 장기간 노출되면 자발적 돌연변이가 축적되고 가장 적응력이 뛰어난 균주가 우세하게 됩니다. 콜로니 전이(colony transfer) 및 연속 전이(serial transfer) 방법과 비교했을 때, 케모스타트 배양은 가장 많은 수의 세포 분열을 수반하며, 따라서 가장 많은 수의 다양한 집단을 수반합니다. ALE를 위한 화학채취 배양은 더 복잡한 배양 장치를 필요로 하지만, 일단 작업이 시작되면 노동 집약적이지 않습니다. 적응된 균주에 대한 비교 게놈 및 전사체 분석은 스트레스 요인이 스트레스를 극복하는 돌연변이에 어떻게 기여하는지에 대한 진화적 단서를 제공합니다. 현재 논문의 목표는 통제된 실험실 조건에서 미생물의 진화를 가속화하는 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미생물이 생존하고 다양한 환​​경에 적응할 수 있습니다. 심한 스트레스, 적응은 임의의 게놈 변이 이후 긍정적 인 선택 1-3으로 도움이 표현형의 인수를 통해 발생할 수 있습니다. 따라서, 균체는 "적응 진화"이라한다 최적 성장을 위해 대사 또는 규제 네트워크를 변경하여 적용 할 수있다. 이러한 슈퍼 박테리아의 발생 및 강력한 미생물 균주의 발생으로 최근 중요한 미생물 경향은 매우 밀접하게 스트레스 조건에서 진화를 적응 적 관련이 있습니다. 정의 실험실 조건에서, 우리는 분자 진화의 메커니즘을 연구에도 다양한 용도 미생물 진화의 방향을 제어 할 수있다. 그들은 큰 개체군을 유지 빠르게 재생하고, 생성 및 혼을 유지하기 쉽다 : 다세포 유기​​체 달리 단세포 유기​​체 이유는 다음 실험실 적응 진화 (ALE)에 적합ogeneous 환경. DNA 시퀀싱 기술과 높은 처리량 기술의 최근 발전과 결합, ALE는 전신 규제 변화로 이어질 게놈의 변화를 직접 관찰 할 수 있습니다. 돌연변이 역학 및 인구의 다양성도 관찰 할 수 있습니다. 유전 공학 전략 ALE 균주 4,5의 분석으로부터 결정될 수있다.

Chemostat 배양 정상 세포를 얻는 발효 공정 6의 생산성을 향상하기 위해 사용하는 방법이다. 신선한 배지를 첨가하고, 배양액의 처리 (후자는 중간 및 바이오 매스를 포함한다) 중에 수확된다. 장기 배양 chemostat 그러나 배양 정상 생산성을 변경하여 배양 (도 1a) 중 자발적인 돌연변이 및 선택의 축적을 초래한다. 다양한 선택 압력 (스트레스)에서 돌연변이의 축적이 향상된다. 장기 응력 점진적 증가 chemostat는 반복 액체 매질에서 고체 배지 및 시리얼 전송 (에서 온도, pH, 삼투압, 영양 결핍, 산화, 독성 최종 제품 등 식민지 전송으로 지정된 스트레스에 반대 돌연변이의 연속 선택을 제공합니다 배치 배양)도 연구 진화 미생물 (도 1B 및 1C)을 수득 할 수있다. chemostat 배양 복잡한 방법이 필요하지만, 다이버 시티 풀 (복제 인구 크기의 수) 콜로니 전송과 시리얼 전송 기술에 의해 얻어진 것보다 높다. 각각의 세포에 안정 스트레스 노출과는 chemostat 문화 (정상 상태) 일괄 문화 기반 기술에 비해 ALE의 다른 혜택입니다 동안 세포 상태의 변화를 감소. 높은 숙시 네이트 조건에 적용 대장균의 스트레스 유발 ALE는이 문서에서 소개된다.

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그림 1 : 적응 형 실험실 진화의 방법 (A) Chemostat;. (B) 시리얼 전송하는 단계; (C) 식민지 전송. 상단 그림은 ALE에 대한 방법의 개념을 설명하고, 아래 그림은 ALE 동안 성장 세포의 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 장비 준비

  1. chemostat 항아리 (150-250 ml)로 또는 유입구를 함유하는 삼각 플라스크 (250 mL) 및 출구 포트를 얻었다. 실리콘 튜브는 10 ~ 100 ㎖ / hr의 유량을 허용하여 포트를 연결합니다. 선택적으로 통기, 공기 출구, 및 온도 조절 물 입구 및 출구 포트를 사용한다.
  2. 교반 및 온도 제어를 제공하는 chemostat 항아리에 적합한 장치를 취득 (또는 회전 진탕 배양기를 사용).
  3. 문화를 새로운 배지를 전달하고 수집하기 위해 두 개의 연동 펌프를 얻습니다.
  4. 매체 출구 포트 및 공기 입구 포트를 포함하는 저장 용기 (10 ~ 20 L)을 얻었다.
  5. (; L / S (13) 튜브 즉, ID 0.8 mm, 유량 범위 0.06-36 ml / 분) 희석 비율에 적합한 실리콘 튜브를 얻습니다.

2. 중간 준비 및 살균

  1. 초기 중간
    1. 0.3 g 포도당, 0.08 g NH 4를 녹여CL, 0.05 g의 NaCl, 0.75 g 나 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.3 g의 KH 2 PO 4 90 ml의 증류수 chemostat 항아리 (DW).
    2. 클램프를 사용하여 튜브와 함께 chemostat 항아리를 밀봉합니다. 통풍구를 밀봉하지 마십시오.
    3. 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브에서 chemostat 항아리 소독. 살균 한 후, 실온에서 chemostat 항아리를 저장합니다.
    4. 녹인 0.02 g 황산 · 7H 2 O, 0.01 g의 CaCl2를, 10 ml의 DW (용액 A) 0.1 mg의 티아민.
    5. 주사기 및 미리 멸균 주사기 필터 (0.45 ㎛의 세공 필터)를 사용하여 용액 A 필터.
    6. A는 chemostat 항아리에 여과하는 솔루션을 추가합니다.
  2. 스트레스 중간
    1. 30g 글루코스 8g NH 4 CL, 5g의 NaCl, 75g이 나 HPO 4 · 용해 2H 2 O, 30g의 KH 2 PO 4, 300g 나트륨 숙시 네이트 수화물 (NA 2 · 숙신산 · 6H <서브> 2 O; 저수지 항아리에 9.9 L DW에서이 실험에 사용 된 스트레스).
    2. 클램프를 사용하여 튜브와 함께 저장 항아리를 밀봉합니다. 통풍구를 밀봉하지 마십시오.
    3. 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브 저류 용기 살균. 멸균 후, 실온에서 보관 용기.
    4. 2g 황산 4 · 7H 2 O, 1g의 염화칼슘 2, 100 ㎖ DW (용액 A) 10 mg을 티아민을 녹인다.
    5. 주사기 및 미리 멸균 주사기 필터 (0.45 ㎛의 세공 필터)와 필터 A 액.
    6. A는 저장 항아리에 여과하는 솔루션을 추가합니다.
    7. 무균는 저장 항아리에 살균 실리콘 튜브를 연결하고 연동 펌프를 연결합니다.
  3. 스트레스가 높은 중간
    1. 2.2 절에서와 같이 매체를 준비하지만, 스트레스의 큰 농도 (즉, 숙시 네이트 적응에 3~5g / L 이상).
      참고 :이 프로토콜은 스트레스 일에 적응입니다AT는 매체를 통해 전달 될 수있다. 온도, 교반이나 조명과 같은 물리적 스트레스의 경우, 배양이 적절하게 설계되어야한다.

3. 초기 재배

  1. 야생형 E.의 단일 식민지의 예방 초기 배지 4 mL를 함유하는 15 ㎖의 시험관에 대장균.
  2. 37 ° C에서 12 시간, 220 rpm으로의 진탕 배양기에서 테스트 튜브를 품어.
  3. 무균 전송 chemostat 항아리에 예비 배양 1 ㎖.
  4. 6 시간 동안 37 ° C에서, 폭기 (공기 50 ml / 분)와 교반 (200 rpm으로)에 대해 제공하는 chemostat 항아리를 품어.

4. 스트레스 적응

  1. 무균는 chemostat 항아리에 펌프 실리콘 튜브의 끝을 연결합니다.
  2. 배출 펌프 (10 ㎖ / 시간 이상)을 시작하고 문화를 수집합니다.
    참고 : 문화는 일반적으로 4-8 시간 초기 배양 한 후, 지수 상에 있어야합니다.
  3. 장출구 관에서 문화의 광학 밀도 (600 nm의) 에크.
  4. 입구 펌프 (0.1 시간-1의 희석 비율에 해당하는 10 ㎖ / 시간 등)를 시작합니다.
  5. 매 24 시간을 튜브 콘센트에서 600 nm에서 문화의 광학 밀도를 확인합니다.
  6. 96 시간 (9.6 배 매출) 이상에 대한 chemostat을 운영하고 있습니다. 광학 농도가 안정되면, 높은 스트레스 매체를 함유하는 저장 용기를 교환한다. 광학 밀도가 0.2보다 낮 으면, 6 시간에 대한 공급 흡입 펌프를 멈춘다. 입구 펌프를 다시 시작하고 광학 밀도가 0.2 이상인지 확인합니다.
  7. 점차 높은 스트레스 농도를 함유하는 저장조로 변경하여 스트레스의 농도를 증가시킨다.
  8. 이 이정표에 도달 할 때마다 적응 문화의 샘플을 채취 (예를 들어, 100g / L 숙시 네이트 스트레스에 적응 주) 더 게놈 분석 및 저장.
  9. 샘플 수납하는 멸균 80 % 글리세롤 soluti 함께 배양 시료 (0.5 ml)에 혼합상 (0.5 ml)에 용해시키고 -80 ℃에서 보관.
    주 : 상기 미생물은 ALE 과정에서 스트레스를 저하시키는 능력을 취득하는 경우, 발효 용기에서 스트레스 농도는 신선한 저장조와 동일하지 않다.

스트레스 적응 변형 5. 단일 콜로니 분리

  1. 한천 평판 배지 (1.6 % 한천) 같은 스트레스를 함유 매체의 동일한 농도를 준비합니다.
  2. chemostat에서 출구 배양 (0.1 ㎖) 플레이트, 16 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
  3. 멸균 된 이쑤시개를 이용하여 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고, 동일한 스트레스를 함유하는 15 ㎖의 시험관에 상기 chemostat와 동일한 중간 농도 그들을 접종하고, 6 시간 동안 배양한다.
  4. 전사 배지 50 ㎖를 포함하는 250 ㎖의 삼각 플라스크에 배양액 1 ㎖. 수확 배양액 0.5ml를 각 1 시간, 600 nm에서의 OD를 측정한다. 적응 strai의 성장 속도를 비교하여스트레스 요인 특정 야생형 균주의 것과 N.

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Results

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높은 숙시 응력 적응 야생형 E. 대장균 W3110 균주는 D에서 chemostat에서 배양 = 0.1 시간 -1 270일에 대한 (그림 2).

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그림 2 : E.의 높은 숙시 네이트 스트레스 적응 대장균을 이용하여 배양 chemostat W3110. 얇은 화살표는 스트레스의 농도가 증가하는 시간을 나타내고, 굵은 화살표는 배양 하였다 보존하는 시간을 나타낸다. 화살표 번호는 스트레스, 나트륨 숙시 네이트 육수화물의 농도를 나타낸다. ALE 동안 바이오 매스의 변화와 스트레스의 농도가 표시됩니다. 그림은 J.에서 수정 된 Biosci. Bioeng ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미생물 때문에 빠른 성장 속도와 유전 적 다양성의 거의 모든 환경에 적응시킬 수있다. 적응 진화 실험은 주어진 조건 하에서 유용 자연 돌연변이를 보유하는 개개의 유기체를 선택하는 방법을 제공하는 설계 조건 하에서 미생물 발전을 가능하게한다.

chemostat 기술은 다음과 같은 이유로 이전 기법보다 인위적 구동 발전을 달성하기위한 더 강력 : (a) 정상 환경 - 전송 기술들은 고체 또는 액체 매질 중 회분식 배양 기반으로하기 때문에, 세포의 환경을 배치하는 동안 변화 문화 chemostat의 환경 스트레스가 정상 상태에서; (b) 더 큰 모집단과 연속 선택 - chemostat의 큰 모집단은 전사 기술의 작은 집단 이상의 유전 적 다양성을 제공한다. 은 ch 연속 선정emostat 기술은 전사 기술 간헐적 선택보다 발전을 달성하기위한 빠른 방법이다. chemostat 문화가 ALE 과정에서 다른 미생물에 의해 오염되지 않는 것이 중요하며, 무균 조건은 chemostat 문화...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 미래창조과학부(지능합성생물학센터 프로그램 2012M3A6A8054887)의 재정 지원을 받았다. 김순 교수는 가톨릭대학교 장학금(2015)의 지원을 받았다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
미니 화학 발효기Biotron Inc.-특별 주문으로 제조
실리콘 튜빙Cole-ParmerMasterflex L/S 13튜빙 크기는 희석 속도 및 발효기 용기의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
저장소 항아리BellcoMedia 저장 병20 L
화학 물질Sigma-Aldrich-시약 등급
포도당Sigma-AldrichG5767ACS 시약
NH4ClSigma-AldrichA9434, 세포 배양에 적합, ≥ 99.5%
NaCl시그마-알드리치746398ACS 시약, ≥ 99%
Na2HPO4· 2H2OSigma-Aldrich427298.5-101%
KH2PO4Sigma-Aldrich795488 ACS 시약, ≥ 99%
MgSO<서브>4&미드도트; 7H2OSigma-Aldrich230391ACS 시약, ≥ 98%
CaCl2Sigma-Aldrich793639ACS 시약, ≥ 96%
티아민&미드도트; HClSigma-AldrichT4625시약 등급, ≥ 99%
Na2· 석시네이트&미드도트; 6H2O시그마-알드리치S2378시약플러스, ≥ 99%
된 분자 생물학용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
  2. Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476(2014).
  3. Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
  4. Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
  5. Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15(2014).
  6. Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
  7. Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
  8. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
  9. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  10. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
  11. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).

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