여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.
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방법 논문
Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
자연적 진화는 환경 변화와 같은 유전적 다양성과 작은 개체군 간의 선택을 포함합니다. 적응형 실험실 진화(ALE)는 통제된 조건과 스트레스 요인 하에서 살아있는 유기체를 사용하여 진화를 관찰하는 실험 상황을 말합니다. 따라서 유기체는 인위적으로 진화적 변화를 일으키도록 강요됩니다. 미생물은 환경에서 다양한 스트레스 요인에 노출되며 스트레스를 유발하는 특정 단백질을 조절하여 생존 가능성을 높일 수 있습니다. 자연적으로 발생하는 자발적 돌연변이는 미생물의 생존 가능성에 영향을 미치는 미생물의 게놈에 변화를 일으킵니다. 화학물질 배양에 장기간 노출되면 자발적 돌연변이가 축적되고 가장 적응력이 뛰어난 균주가 우세하게 됩니다. 콜로니 전이(colony transfer) 및 연속 전이(serial transfer) 방법과 비교했을 때, 케모스타트 배양은 가장 많은 수의 세포 분열을 수반하며, 따라서 가장 많은 수의 다양한 집단을 수반합니다. ALE를 위한 화학채취 배양은 더 복잡한 배양 장치를 필요로 하지만, 일단 작업이 시작되면 노동 집약적이지 않습니다. 적응된 균주에 대한 비교 게놈 및 전사체 분석은 스트레스 요인이 스트레스를 극복하는 돌연변이에 어떻게 기여하는지에 대한 진화적 단서를 제공합니다. 현재 논문의 목표는 통제된 실험실 조건에서 미생물의 진화를 가속화하는 것입니다.
서론
미생물이 생존하고 다양한 환경에 적응할 수 있습니다. 심한 스트레스, 적응은 임의의 게놈 변이 이후 긍정적 인 선택 1-3으로 도움이 표현형의 인수를 통해 발생할 수 있습니다. 따라서, 균체는 "적응 진화"이라한다 최적 성장을 위해 대사 또는 규제 네트워크를 변경하여 적용 할 수있다. 이러한 슈퍼 박테리아의 발생 및 강력한 미생물 균주의 발생으로 최근 중요한 미생물 경향은 매우 밀접하게 스트레스 조건에서 진화를 적응 적 관련이 있습니다. 정의 실험실 조건에서, 우리는 분자 진화의 메커니즘을 연구에도 다양한 용도 미생물 진화의 방향을 제어 할 수있다. 그들은 큰 개체군을 유지 빠르게 재생하고, 생성 및 혼을 유지하기 쉽다 : 다세포 유기체 달리 단세포 유기체 이유는 다음 실험실 적응 진화 (ALE)에 적합ogeneous 환경. DNA 시퀀싱 기술과 높은 처리량 기술의 최근 발전과 결합, ALE는 전신 규제 변화로 이어질 게놈의 변화를 직접 관찰 할 수 있습니다. 돌연변이 역학 및 인구의 다양성도 관찰 할 수 있습니다. 유전 공학 전략 ALE 균주 4,5의 분석으로부터 결정될 수있다.
Chemostat 배양 정상 세포를 얻는 발효 공정 6의 생산성을 향상하기 위해 사용하는 ....
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프로토콜
1. 장비 준비
- chemostat 항아리 (150-250 ml)로 또는 유입구를 함유하는 삼각 플라스크 (250 mL) 및 출구 포트를 얻었다. 실리콘 튜브는 10 ~ 100 ㎖ / hr의 유량을 허용하여 포트를 연결합니다. 선택적으로 통기, 공기 출구, 및 온도 조절 물 입구 및 출구 포트를 사용한다.
- 교반 및 온도 제어를 제공하는 chemostat 항아리에 적합한 장치를 취득 (또는 회전 진탕 배양기를 사용).
- 문화를 새로운 배지를 전달하고 수집하기 위해 두 개의 연동 펌프를 얻습니다.
- 매체 출구 포트 및 공기 입구 포트를 포함하는 저장 용기 (10 ~ 20 L)을 얻었다.
- (; L / S (13) 튜브 즉, ID 0.8 mm, 유량 범위 0.06-36 ml / 분) 희석 비율에 적합한 실리콘 튜브를 얻습니다.
2. 중간 준비 및 살균
- 초기 중간
- 0.3 g 포도당, 0.08 g NH 4를 녹여CL, 0.05 g의 NaCl, 0.75 g 나 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.3 g의 KH
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결과
높은 숙시 응력 적응 야생형 E. 대장균 W3110 균주는 D에서 chemostat에서 배양 = 0.1 시간 -1 270일에 대한 (그림 2).
그림 2 : E.의 높은 숙시 네이트 스트레스 적응 대장균을 이용하여 배양 chemostat W3110. 얇은 화살표는 스트레스의 농도가 증가하는 시간을 나타내고, 굵은 화살표는 배양 하였다 보존하는 시간을 나타낸다. 화살표 번호는 스트레스, 나트륨 숙시 네이트 육수화물의 농도를 나타낸다. ALE 동안 바이오 매스의 변화와 스트레스의 농도가 표시됩니다. 그림은 J.에서 수정 된 Biosci. Bioeng
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토론
미생물 때문에 빠른 성장 속도와 유전 적 다양성의 거의 모든 환경에 적응시킬 수있다. 적응 진화 실험은 주어진 조건 하에서 유용 자연 돌연변이를 보유하는 개개의 유기체를 선택하는 방법을 제공하는 설계 조건 하에서 미생물 발전을 가능하게한다.
chemostat 기술은 다음과 같은 이유로 이전 기법보다 인위적 구동 발전을 달성하기위한 더 강력 : (a) 정상 환경 - 전송 기술들은 고체 또는 액체 매질 중 회분식 배양 기반으로하기 때문에, 세포의 환경을 배치하는 동안 변화 문화 chemostat의 환경 스트레스가 정상 상태에서; (b) 더 큰 모집단과 연속 선택 - chemostat의 큰 모집단은 전사 기술의 작은 집단 이상의 유전 적 다양성을 제공한다. 은 ch 연속 선정emostat 기술은 전사 기술 간헐적 선택보다 발전을 달성하기위한 빠른 방법이다. chemostat 문화가 ALE 과정에서 다른 미생물에 의해 오염되지 않는 것이 중요하며, 무균 조건은 chemostat 문화.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
본 연구는 미래창조과학부(지능합성생물학센터 프로그램 2012M3A6A8054887)의 재정 지원을 받았다. 김순 교수는 가톨릭대학교 장학금(2015)의 지원을 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 미니 화학 발효기 | Biotron Inc. | - | 특별 주문으로 제조 |
| 실리콘 튜빙 | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | 튜빙 크기는 희석 속도 및 발효기 용기의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. |
| 저장소 항아리 | Bellco | Media 저장 병 | 20 L |
| 화학 물질 | Sigma-Aldrich | - | 시약 등급 |
| 포도당 | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS 시약 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | , 세포 배양에 적합, ≥ 99.5% |
| NaCl | 시그마-알드리치 | 746398 | ACS 시약, ≥ 99% |
| Na2HPO4· 2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 ACS 시약, ≥ 99% | |
| MgSO<서브>4&미드도트; 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS 시약, ≥ 98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS 시약, ≥ 96% |
| 티아민&미드도트; HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | 시약 등급, ≥ 99% |
| Na2· 석시네이트&미드도트; 6H2O | 시그마-알드리치 | S2378 | 시약플러스, ≥ 99% |
참고문헌
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia ....
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