미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

각 장기 미세 혈관은 조직 미세 정의 조직 항상성을 유지하고 염증, 투자율, 혈전증과 섬유소 용해 ^{1,2- 규제} 돕는다. ^{5 -} 미세 혈관 내피 세포, 특히 따라서 혈류와 주위 조직과의 계면은 유체 역학적 힘과 순환 사이토 카인 및 호르몬 ^3과 같은 자극에 응답하여 혈관 및 장기의 기능을 조절하는 데 중요한 역할을한다. 내피 세포, 혈액 사이의 상세한 상호 작용을 이해하고, 주변 조직의 미세 혈관 생물학 및 질병 진행의 연구에 중요하다. 생체 내 미세 혈관 구조에 요점을 되풀이하고 ^6,7를 작동하지 않습니다 시험관 도구 제한에 의해 그러나, 이러한 상호 작용을 연구의 진행을 방해하고있다. 결과적으로, 필드 및 치료의 발전은 비용이 많이 들고 시간 -에 크게​​ 의존하고^{10 -} 종종 인간 ^팔의 성공을 번역하는 데 실패 동물 모델을 소비. 생체 내 모델 질환 메커니즘 및 혈관의 기능 연구에 귀중한 반면, 그들은 복잡한 종종 개인 휴대 생화학의 정확한 제어 및 생물 물리학 적 큐 부족하다.

몸 전체 혈관 최적화 관류 및 영양소 전송 동시에 ^{11을 제공하는} 광대 한 모세관 침대와 함께 성숙한 계층 구조를 보유하고있다. 처음에, 초기 개발 ^{12, 13} 중 계층 분기 네트워크 재구성 원시적 총으로 혈관 형성된다. 이러한 프로세스에 관련된 신호들의 많은 웰 ^(14)은 이해되지만 ^{- 16는} 혈관 패턴 ^(15)을 결정하는 방법 등 어려운 남아있다. 차례로, 조직 혈관 망을 설계하기 위해 시험 관내에서이 과정을 recapitulating은 꿀벌이n은 어렵다. 많은 기존의 체외 플랫폼은 두 가지 차원 내피 세포 배양으로, 같은 다세포 근접, 세 가지 차원 내강 구조, 흐름, 그리고 세포 외 기질과 같은 중요한 특성 부족, 혈관을 모델링합니다. 3D 하이드로 겔 튜브 형성 분석 (콜라겐 또는 섬유소) ^17-19 또는 침공 분석 ^{(20, 21)은} 다른 혈관 ^{17, 22} 또는 조직 세포 유형 ⁽²³⁾ 3D와의 상호 작용에서 내피 세포의 기능을 연구하는 데 사용되었다. 그러나 이러한 분석의 루멘은 상호, 혈역학 적 흐름, 적절한 관류 부족 조립. 또한, 이들 관 형성 분석법 ⁽²⁴⁾ 내의 혈관 회귀 성향이 수행 될 수있다 기능 연구의 정도를 제한 장기간 배양 및 성숙을 방지한다. 따라서, 적절하게 모델링 할 수 미세 혈관 네트워크 욕실의 체외 플랫폼을 설계 할 수있는 싹 트는 필요가있다특성 dothelial 장기 배양 할 수있다.

혈관 공학 기법 다양한 혈관 질환 환자의 대체 의료용 또는 바이 영향 선박 년간 나왔다. 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET), 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (의 ePTFE)과 같은 합성 재료로 제조 대경 용기 장기 개통 (평균 95 %의 개통 5 년) ²⁵ 상당한 치료 성공이 있었다. 작은 직경의 합성 이식은 (<6mm) 일반적으로 내막 증식 및 혈소판 ^(26)과 같은 합병증에 직면하지만 ^- 조직이 생체 물질로 만든 작은 직경 이식을 설계 ^(28)는, 상당한 진전 ^{(29, 30)을} 만들었습니다. 이러한 종류의 발전에도 불구하고, 마이크로에 설계 선박의 반칙으로 남아있다. 충분히 미세 혈관을 모델링하기 위해, SUF 복잡한 네트워크 패턴을 생성 할 필요가있다ficient 기계적 강도 및 개방성 실질 세포 및 세포 개조 모두 영양소 투과를 허용하는 매트릭스 조성물을 유지한다.

^{(34) -이} 프로토콜은 조정 가능한 및 제어 미세 환경 ⁽³¹⁾ 설정 생체 내에서 기본을 모방 한 새로운 인공 관류 혈관 네트워크를 제공합니다. 기술 된 방법은 100 μm의 순서에 직경 엔지니어링 미세 혈관을 생성합니다. 엔지니어링 미세 혈관은 내가 하이드로 겔 콜라겐 소프트 타입에 포함 된 미세 유체 채널을 통해 내피 세포를 관류에 의해 제조된다. 이 시스템은 오픈 내강 구조와 패턴 네트워크를 생성 다세포 상호 작용을 복제, 세포 외 기질 성분을 조절하고, 생리 학적으로 관련 혈류 역학적 힘을 적용 할 수있는 능력을 보유하고 있습니다.

네트워크 디자인과 무늬 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 1. 미세

1. 웨이퍼 제조는 네트워크 설계의 부정적인 템플릿을 만드는 방법
   1. 임의의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 네트워크 패턴을 만든다. 입구와 출구 사이의 대각선 치수 향후 단계 (2.1.1 참조) 하우징 장치에 유입 및 유출 저장소 사이의 거리와 일치하는지 확인.
      참고 자체가 지정하는 사용자의 특정 연구 목적에 따라 상기 패턴의 설계는 (예를 들어, 패턴을도 1을 참조).
   2. 고해상도 인쇄를 사용하여 네트워크 패턴의 마스크를 생성하거나 상업적 공급자로부터 크롬 포토 마스크를 주문한다. 포토 리소그래피 공정의 상세한 프로토콜은 다른 ³⁵ 가능하다.
   3. 산소 플라즈마 처리와 100 W에서 5 분 동안 8 "실리콘 웨이퍼를 청소한다.
   4. 충분한 네가티브 포토 레지스트을 붓고 (SU-82.5 cm의 직경 형태를 덩어리에 저항하도록 웨이퍼 상에 2,100 작품 잘). 스핀 코터를 사용하여, 100 회전 / 초 램프 500 rpm으로 상기 웨이퍼를 회전하고 10 초 동안 유지한다. 그런 다음 300 회전 / 초와 1,600 rpm으로 진입로 30 초 동안 유지한다. 주 : 속도 및 150 ㎛의 레지스트 두께를 수득 각 실험 조건에 대해 최적화 될 필요가 램프.
   5. 소프트 베이크 7 분 65 ° C에서 웨이퍼, 360 ° C / 시간으로 95 ° C까지 상승하고, 45 분 동안 유지한다. 천천히 핫 플레이트에서 실온으로 냉각. 노출, 크롬 포토 마스크에서 365 nm의 자외선에 노출 제조업체의 추천 (350 엠제이 / 약 150 ㎛의 SU-8 두께 cm ^2)의 트리플 것을 코팅 된 웨이퍼 상에 혈관 패턴을 각인.
      주 : SU-8은 네거티브 형 레지스트이므로, 노광 영역 (패턴 디자인을 제외한 모든) 단계 1.1.7에서 현상 제에 용해 될 것이다.
   6. 하드 베이크 (65)에 노출 된 웨이퍼° 5 분 C하고 천천히 핫 플레이트에 RT로 냉각되도록 한 후, 360 ° C / 시간으로 95 ° C까지 상승하고 25 분 동안 유지한다.
   7. 15 분 노출되지 않은 압축 된 질소 흐름에서 다음 이소 프로필 알코올을 깨끗하고 건조, 저항 씻어 - (10)가 SU-8 개발자의 웨이퍼를 빠져. (원치 않는 박리 및 거품을 찾아)을 SU-8이 잘 웨이퍼 결합 레지스트 보장하기 위해 광학 현미경 하에서 패턴을 검사합니다.
   8. 제조자의 지시 ^(36)에 관한 프로파일로를 이용하여 패턴 피처의 두께를 측정한다. 측정 수집하는 동안, 웨이퍼 상에 패턴 화 된 피쳐의 구조적 일체 성을 손상시킬 접촉 기반 프로파일로 등 네트워크 기능 (즉, 입구 및 출구 도관)에 필수적인 구조 영역을 피한다. 대안 적으로, 모두이 문제를 방지하기 위하여, 비접촉 방식 (즉, 광 프로파일로)를 사용한다.
2. 창콜라겐 성형 용 무늬와 평면 금형의 neration
   참고 : 화학 물질 흄 후드 내에서 실란을 처리합니다.
   1. 표면을 silanization합니다 2 시간 동안 트리클로로 (3,3,3- 트리 플루오) 실란 100 ㎕와 건조기에서 웨이퍼를 놓습니다.
   2. 120 X 120mm 광장 페트리 접시에 실란 화 된 웨이퍼를 전송합니다. 6mm 두께 - (4)를 달성하기 위해, 웨이퍼 위에 : 혼합 및 탈기 PDMS 엘라스토머와 경화제 (1 비율 w / w 10)에 붓는다. 패턴없이 평면 금형을 생성하기 위해 별도의 120 X 120mm 광장 페트리 접시에 추가 PDMS를 따르십시오. 2 시간 동안 65 ° C에서 치료.
   3. 오븐에서 제거하고, PDMS는 실온으로 냉각시킨다. 메스를 사용하여 조심스럽게 SU-8 주위에 사각형을 잘라 천천히 웨이퍼에서 PDMS 몰드를 벗겨. X 30mm 30mm에 자리를 떼어. 플랫 형의 경우, 컷 X 40mm 40mm에 대한 사각형 조각으로 임프린트 패턴없이 PDMS를 치료.

2. 주택 장치

1. Fabricat톱 이온 및 아래쪽 주택 조각
   1. 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)를 사용하여 용기 하우징 (PMMA)를 제작한다. , 제작 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 밀링 기능을 갖춘 표준 기계 공장에서 부품을 주문합니다. 상단과 하단 부분의 개략적 인 그림 1을 참조하십시오.
   2. 모서리에 위치 된 장치의 상부에 1mm의 깊이와 장치의 아래쪽 두 콜라겐 주입 포트 (4mm 직경)에 잘 20mm X 20mm를 포함하는 상부 하우징 부재 (도 1D)을 설계 광장 아니라 6mm 직경 개의 입구 및 출구 저장조 및 상기 장치의 네 귀퉁이에 네 개의 나사 구멍 (3 mm 직경).
      주 : 추가 구멍은 처리 목적 부재의 주변부에 가공 될 수있다.
   3. 주변 25mm × 25 mm의 중앙에 사각형 구멍을 포함하는 하부 하우징 부분 (그림 1E)을 디자인 (크기 15mm X 15mm)0.25 mm의 깊이와 선반. 드릴 4-40 나사 4 나사 구멍. 하단의 나사 구멍을 확인하고 상단 부분은 미래의 조립 단계에서 함께 정렬됩니다.

3. 미세 혈관 디바이스 제조

1. 재료의 준비
   1. 씻고 핀셋 두 세트, 스테인레스 강 주걱 작은 평면 스크류 드라이버 스테인리스 나사 몇몇 스테인레스 스틸 앵커 핀 압력솥. 용기의 제조를 위해, 또한 미세 패턴 PDMS 몰드를 오토 클레이브 평면 사각형, 커버 글라스 (22 × 22 ㎜) 및면 조각 PDMS.
   2. 다음 두 번 조직 문화 후드에서 멸균 된 물로 씻어, 적어도 1 시간 동안 표백제의 PMMA 주택 조각을 소독 및 멸균 조직 문화 요리 건조 공기 (150mm X 25mm)로 할 수 있습니다.
2. 무균 폴리에틸렌 이민 - 글루 타르 알데히드 (PEI - GA) 코팅
   1. 살균 건조 PMMA 조각의 내부 우물을 치료약 1 분 동안 플라즈마. 내부 웰 10 분의 PMMA 조각합니다 (20mm 사각형 잘의 상단과 하단에 25mm 사각 선반)에 1 % 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 추가합니다. 무균 H ₂ O로 씻어 조직 문화 후드에서 건조 할 수 있습니다.
      주 : 플라즈마 처리에 필요한 시간은 사용되는 장치에 따라 가변 - PEI는 용이하게 친수성 ​​표면을 나타내는 확산한다. 그렇지 않은 경우, 추가적인 플라즈마 처리가 필요할 수있다.
   2. PEI 30 분간 PMMA 조각의 표면 처리에 0.1 % 글루 타르 알데히드 (GA)를 적용한다. 멸균 수로 두 번 세척하여 건조 할 수 있습니다.
      주 : 향후 단계 콜라겐은 콜라겐 글루 타르 알데히드 가교를 통해 코팅 된 표면에 부착된다. 이것은 나중에 조립 공정 중에 상기 장치 배양 기간 동안 장치 내의 장소에 겔을 고정 할 수 있습니다.
3. 콜라겐 젤 준비
   1. 1 % 콜라겐 - 0.6 %를 사용하여 용기를 제조솔루션을 제공합니다. 수산화 나트륨 (NaOH) 10 배 미디어 보충 (M199), 및 세포 배양 미디어 - (쥐에서 분리 된 ³⁷ 테일 1.5 %)이 내가 원액을 콜라겐 유형을 혼합, 선박 제작을위한 0.75 % 콜라겐을 확인하십시오. 얼음에 모든 솔루션을 보관하십시오.
   2. V의 _{ƒinal 필요} 겔 최종 부피 인 다음의 식에 의하여 콜라겐의 양을 결정한다 (일반적으로, 디바이스 당 콜라겐 1 ㎖ 충분하다) V _{스톡 콜라겐 필요} 스톡 콜라겐의 양이고, C _{스톡 콜라겐} 농도는 재고 콜라겐 및 C _{ƒinal 콜라겐} 용기 내의 콜라겐의 바람직한 농도이다.
      
   3. 새로운 30 ML 원뿔 튜브에 재고 콜라겐의 적절한 볼륨을 전송하기 위해 1 ML의 주사기를 사용합니다. 중화 수산화 나트륨 _(NaOH를 V)의 볼륨을 결정, M199 10 배 매체 보충(V _{10 X),} 세포 배양 배지 (V _{1 X)} 다음과 15 ML 원뿔 관에서 별도로 혼합과 같습니다 :
      
   4. 중화 시약 분주 콜라겐 (V _{1 X} V _{(10) X, V의 NaOH)의} 혼합물을 추가하고 균일 한 겔을 얻을 때까지 부드럽게 솔루션을 혼합 작은 주걱을 사용합니다. 천천히 그리고 부드럽게 교반하여 거품을 도입하지 마십시오.
   5. - (천만 세포 / mL를 예를 들어, 0.5)가 중화 시약과 혼합 한 후 콜라겐 용액에 셀을 추가하고, 세포가 균일하게 분산 될 때까지 교반을 계속하여 원하는 농도로 기질에 세포를 포함한다.
   6. 세포가 첨가되는 경우, 다음 식, V _세포에 의해 결정된 바와 같이, 추가의 부피를 수용 세포 배양액의 양을 조절 _</ 서브> 세포 현탁액의 필요한 양이며, C _{ƒinal 세포 밀도는} 용기 내의 원하는 셀 밀도, C _{현탁액 셀 밀도} 원액 세포의 밀도이다.
      
4. 콜라겐 주입 - 탑 원피스
   1. 100mm X 20mm 요리의 미세 패턴 PDMS 몰드를 놓습니다. 1 분 동안 PDMS 몰드 청소 플라즈마.
   2. 금형의 광장 저수지는 입구와 출구 저수지 바로 아래에 있음 (- 점선 그림 1D 참조) 그래서 PDMS 몰드의 상단에 상단 PMMA 조각을 맞 춥니 다. 입구에 스테인리스 다월 핀을 배치하고, 패턴의 저장조로부터 명백한 접속을 유지하기 위해 상부 PMMA 편에 저장 구멍 출구.
   3. 0.6 ml의 콜라겐 - ~ 0.5를 추출하기 위해 1 ML의 주사기를 사용합니다. 기포가 주사기에 남아 있는지 확인합니다.
   4. 리터 아래로 눌러ightly 상단 하우징에 핀셋으로 상단 부분과 PDMS 몰드 사이의 플러시 접촉을 보장합니다. 상단 PMMA의 조각에 주입 포트를 통해 서서히 콜라겐을 주입한다. 그 콜라겐 패턴 위의 20mm X 20mm 도메인에 채우고 밖으로 누출되지 않습니다 확인합니다.
   5. 다웰 핀 싸움이 치열하지 않고 음식을 닫고 30 분 동안 37 ° C 배양기에서 겔 할 수 있습니다.
5. 콜라겐 주입 - 아래 조각
   1. 바닥 부분의 중앙에 22 X 22mm 유리 커버 슬립을 놓습니다. 유리 슬라이드에 균등하게 ~ 0.25 ml의 콜라겐을 분배하기 위해 1 ML의 주사기를 사용합니다. 부드럽게 PDMS는 PMMA에 평평하고 더 갇힌 기포가없는 보장 콜라겐을 통해 PDMS를 평면 사각형을 낮 춥니 다. 30 분 동안 37 ° C에서 겔 할 수 있습니다.
6. 장치 조립
   1. 겔화 후, PDMS (약 1 ml)에 둘러싸 하단 부분에 평면 PDMS 조각 주위에 충분한 PBS를 추가합니다. 모든 전자를 제거하는 핀셋을 사용하여xcess의 가장자리 주위에 콜라겐, 천천히은 PDMS 조각을 벗겨. 수분을 유지하는 콜라겐의 상단에 더 PBS를 추가합니다.
   2. 상단 부분을 준비하려면, 상단 PMMA 조각을 픽업하여 PDMS 금형 상단에 오도록를 뒤집어 핀셋을 사용합니다. 신속, 인터페이스에 PBS 몇 방울을 추가하고 단단히 맨 PMMA 조각에서 PDMS 몰드를 제거합니다.
   3. 조심스럽게 핀셋의 다른 쌍을 사용하여 PMMA 하우징의 다른 측면에서 스테인레스 스틸 앵커 핀을 제거합니다. 미세 패턴 콜라겐에 PBS의 더 몇 방울을 추가합니다. 콜라겐이 아래로 향하도록 PMMA 위에 조각을 뒤집어 코너 구멍에 나사 4 개를 배치합니다.
   4. 조심스럽게 바닥 부분의 모서리 구멍에 나사를 맞추고, 하단 부분의 상단에 상단 부분을 배치합니다. 이 두 가지가 서로에 대해 슬라이드하는 것을 허용하지 않습니다. 부드러운 터치를 사용하여 나사를 조 스크루 드라이버를 사용합니다. 너무 세게 조이지 마십시오.
   5. PBS를가 PMMA 표면을 둘러싸는 기음 작은 PI 배치상기 장치의 하나의 에지의 아래면 ECE. 피펫을 사용하여, 저수지에서 모든 PBS를 제거하고 세포 배양 배지로 교체합니다. 장치가 적어도 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 함께 겔 할 수 있습니다.
7. 셀 시드
   1. 37 ° C에서 내피 성장 미디어 문화 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) (CO _2, O ₂₎ 컨 플루 ^38. 가능하면, 유로 4와 7 사이에 사용합니다.
   2. PBS 6 ml의 배양 플라스크를 세척하고 세포를 해리하여 37 ℃에서 2 ml의 0.05 % 트립신 가산함으로써 내피 세포를 Trypsinize. 초점 유착의 대부분은 분리하고 세포가 반올림 될 때까지 (- 3 분이 일반적으로 약 2 소요) 트립신에 세포를 남겨주세요. 소 태아 혈청 (FBS)를 함유하는 내피 세포 성장 배지 4㎖를 첨가함으로써 트립신의 반응을 정지. 세포가 플라스크에서 분리되어 있는지 확인하고 수집하기 위해 미디어를 여러 번에 플라스크를 씻어원뿔 튜브한다.
   3. 혈구를 사용하여 세포를 세어 mL의 천만 세포의 밀도로 재현 탁들을. 입구와 출구 저수지에서 모든 세포 배양 용지를 제거합니다. 200 ㎕의 젤 로딩 팁을 사용하여, 유입구 저장소의 중앙에 세포 현탁액 10 μL를 추가한다. 세포를 즉시 네트워크 코트 네트워크로 유입되기 시작한다.
   4. 두 저수지에 동일하게 200 μL 미디어를 추가 할 수 세포를 연결하고 적어도 1 시간 동안 네트워크 내에서 확산.
8. 장치 문화
   1. 문화 입구 저수지 세포 배양액 200 μL와 출구 저장조 50 μL를 추가하여 네트워크를 통해 중력 중심 흐름 장치. 문화의이 방법, 내피 세포 생존 능력을 유지하기 위해 매일 12 시간 미디어를 교체합니다.
      주 : 연속 유동 배양 조건이 바람직한 경우 (일정 전단 응력을 유지 출구 등으로 미디어를 수집)는 SYR인게 펌프 대신 중력 구동 배양에 사용될 수있다.
   2. 적어도 24 시간 씨앗을 품고 내피 세포가 지속적인 흐름을 적용하기 전에 연결하고 안정화 할 수 있습니다. 연속 흐름 설치에 앞서, 중력 중심의 유동 조건을 갖는 장치를 유지한다.
      참고 : 응용 흐름에 대한 미디어 조건이 중력 중심의 문화 다릅니다. 미디어에 같은 덱스 트란 플라즈마 확장의 추가는 설계 미세 혈관을 안정화와 지속적인 관류 ^39시 혈관 붕괴를 방지 할 수 있습니다.
   3. 연속 흐름 설정에 미디어를 만드는 최적의 선박 문화 내피 세포 성장 매체에서 3.5 % 덱스 트란 (70 kDa의)을 용해합니다. 무균 기술을 사용하여, 3.5 % 덱스 트란과 내피 성장 미디어 10 ml의 주사기를 입력합니다.
   4. 납땜 인두를 사용하여 배양 접시의 측벽에있는 구멍을 용융 흐름 멸균 배양 접시를 준비한다.
   5. 루어 잠금 커플 링 (여성, 1/16 "ID)에 12"실리콘 호스 (1/32 "ID)를 부착하고, 1 /다른 쪽 끝 튜브의 세그먼트 (16)은 "1 직선 튜브에 튜브 커넥터". 세그먼트 1/4 "1의 자유 단에 (바늘 허브에서 분리) 20G 무딘 바늘을"넣습니다. 또한 (하우징 입구에 설치하여야한다). 다음 단계에서, 더 긴 튜브가 제조 된 접시에 통과되며 (3)에 부착 된 관 대 관 90 ° 엘보 커넥터 접합에 연결된 배관의 3 '세그먼트를 준비 20 G 바늘을 통해 "세그먼트. 출구 배관은 자유 단부 대신 루어 로크 커플 링, 흡입 호스를 반영한​​다. 사용하기 전에 모든 세그먼트를 압력솥.
   6. 준비된 접시 구멍 멸균 입구 및 출구 배관 스레드. . 내부 20 G 바늘 3 "세그먼트를 연결 미디어 채워진 주사기 루어 잠금 커플 링을 부착하고 높은 유량으로 설정 주사기 펌프를 사용하여 튜브를 통해 미디어를 관류. 튜브 또는 커넥터에 기포가 없는지 확인, 이 같은 용기에 흐름을 방해합니다.
   7. 는 C를 삽입onnector 주택 입구에 공동. 원하는 유량 주사기 펌프를 설정하고 재관류를 시작한다.
      주 : 용기 형상과인가 전단 응력의 실험 조건에 따라이 조정될 수있다. 100㎛의 직경 채널 3 μL의 유량 / 분 잘 작동한다.
   8. 원하는 경우, 미디어의 500 μl를 함유하는 살균 5 ㎖ 폴리스틸렌 둥근 바닥 튜브에 삽입 준비 출구 배관으로 관류 액을 모은다.
      주 : 매체 소량의 흐름을 차단할 수있는 기포 형성을 방지하기 위해 수집 튜브에 첨가한다.
   9. 유속에 따라 주사기는 24 내지 36 시간 후 재충전 될 필요가있다. 이는 하우징의 입구로부터 커넥터를 제거한 주사기를 대체 미디어 몇 분 동안 고 유량으로 관류 할 수 있도록함으로써 이루어진다. 이 순서는 거품이 튜브에 소개되지 않도록합니다. 문화에 대해 원하는 유량 펌프를 재설정 주택 입구에 커넥터를 삽입하고인큐베이터로 돌아갑니다.

4. 장치 분석

1. 투수 분석
   1. 반응계에 용기의 투과율을 시각화하는 40 kDa의 FITC 덱스 트란을 사용한다. 공 초점 현미경에 용기 하우징을 놓고 용기면에 초점을 맞 춥니 다. 4X 배율 25 msec의 노출 시간의 입구 및 이미지 5 μM 40 kDa의 FITC 덱스 트란을 추가하고, 10 분 동안 초당 1 프레임에서.
   2. 청 등에 의해 발표 된 모델을 기초로 콜라겐 (μm의 / 초)으로 용기 벽에 걸쳐 덱스 트란의 투과성을 측정하는 분석 코드 화상 시리즈를 분석한다. 알. ^31.
2. 면역 염색 및 공 촛점 이미징 분석
   1. 혈관 문제를 해결하려면, PBS 세 번 (세척 당 20 분) 관류 20 분, 세척의 입구를 통해 3.7 %의 포름 알데히드 관류. 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트리톤 X-100 PE 블록과 결합 특이성 항체1 시간 동안 네트워크를 통해 rfused. 4 ° C에서 하룻밤 일차 항체 솔루션을 관류하고 PBS로 3 회 세척한다. 1 차 항체 용액을 관류 - 2 시간과 동일하게하여 PBS로 다시 세척 하였다.
   2. 1 ㎛의 Z-단계와 공 초점 현미경을 사용하여 현장에서 미세 혈관의 면역 형광 이미지를 가져 가라. 이미지 4 배, 10 배, 또는 20 배의 배율에서 미세 혈관.
      참고 : 10 배와 20 배 확대 된 이미지 등등 신장, 접합 형성, 셀룰러 세부 사항을 제공 할 것입니다 동안 4 배의 배율은 글로벌 네트워크 구조 정보를 제공합니다.
   3. Z 돌기 (이미지 / 스택 / Z 프로젝트), 크로스 섹션 (이미지 / 스택 / 직교 뷰) 및 3D 재구성 (이미지 / 스택 / 3D 프로젝트)와 ImageJ에를 사용하여 이미지 스택을 분석합니다.
3. 주사 전자 현미경 영상
   1. 전자 현미경 분석을 위해, 졸 Karnovsky의 절반 강도 관류하여 반응계에서 해결의 ution 하룻밤 (0.2 M cacodylate 버퍼에 2 % 파라 포름 알데히드 / 2.5 %의 글루 타르 알데히드). 용기를 분해 조심스럽게 두 가지를 구분합니다. 가장자리를 잘라 내고 완전히 몇 일 동안 정착 용액에 담그지.
   2. (2 분마다)를 20 분 동안 25 % 글루 타르 알데하이드에서 용기의 두께의 상부를 담그고 PBS로 3 회 헹군다. 50 %, 70 %, 85 % (2 분마다) 100 % 에탄올 (5 분마다)에 두 개의 세척의 시리얼 에탄올 세척 탈수.
   3. 제조자의 프로토콜 ⁽⁴⁰⁾ 다음 임계점 건조해서 상기 탈수 분석을위한 샘플을 준비한다. 금 - 팔라듐 (7 ㎚) 코트를 용기 스퍼터 5 kV의 스폿 사이즈 (3)의 가속 전압과 주사 전자 현미경으로 분석한다.

조작 된 선박 플랫폼은 내가 매트릭스 천연 콜라겐 유형에 내장 된 기능성 미세 혈관을 생성하고 체외에서 세포 생물 물리학 및 생화학 적 환경의 꽉 제어 할 수 있습니다. 설계 미세 혈관을 제조하기 위해, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를이)가 특허 루멘과 합류 내피 세포를 형성하기 위해 부착 콜라겐 포함 된 미세 유체 네트워크를 통해 관류한다. 도 1A-C에 도시 된 바와 같이, 용기의 형상은 특별히 유량 비틀림에 관한 질문에 응답하도록 설계 될 수 있고, 그 중에서도, 각 분기. 미세 혈관을 통한 유량을 조절하는 내피 세포의 전단 응력 응답에 대한 통찰력을 제공한다. 이전 제조 초점 직경 50㎛의 작게 그러나 어떤 경우에는 최대 500 ㎛, 미세 혈관 또는 주로 100 ㎛의 크기 범위에 선박왔다 SUCC왔다essfully 만들어 배양 하였다. 장기 개통의 예는 무게 중심의 흐름 (그림 2A) 및 연속인가 흐름 (그림 2B)에서 배양 미세 혈관의 생존뿐만 아니라 표시됩니다. 조작 된 미세 혈관의 생체 -like 특성은 여러 가지 방법으로 설명 될 수있다. 여러가지 내피 기능 장벽 기능 (도 3a), 세포 - 세포 상호 작용 및 신호 (도 3b), 및 혈관 재 형성 (도 3C)를 포함하여, 이러한 플랫폼을 사용하여 측정 할 수있다. 이러한 미세 혈관의 중요한 특징은 생물학적으로 중요한 방식으로 염증 자극에 반응하는 능력이다. 이 가장 비 활성화 된 내피가 대기 인 그림 4A-C의 전혈 (그림 4B)과의 상호 작용을 통해 입증되고 활성화 된 내피는 혈전 형성 (그림 4C)를 유도한다. 디의 내피 세포를 배양하여이 플랫폼에서 기원 ffering, 상이한 공급원으로부터의 내피 세포 간의 기능적 이질성을 이해할 수있다.도 5A-C는 두 개의 다른 인간 줄기 세포 유래 내피 세포 유형이 이질성의 일례를 도시하는 때 배양 미세 혈관 시스템 디스플레이 완전히 다른 표현형 41. 흐름 프로파일, 셀 조성 및 배양 조건을 조정하여 설계, 미세 혈관은 건강과 질병 모두에서 미세 혈관 내피 세포 생물학을 연구하기 위해 시험 관내에서 강력한 도구 제공한다.

도 1은 네트워크의 개략도 설계 및 혈관 네트워크 형상은 특히 상이한 흐름 패턴을 생성하도록 설계 될 수있다. 마이크로 채널 제조 프로토콜. A. 예를 들어, 분기 설계는 FL 감소 것같은 용기 (31). B 내의 내피 세포에 다양한 전단 응력의 ​​지역에서 결과 중심 부근 유동 비율 (3 × 3 격자의 8 배 감소). 고도의 지형 그리드는 이전 디자인으로하지만 더 큰 총과 같은 원칙을 따른다. 1,000 Pa의 압력 손실이 네트워크를 통해인가되는 경우,이 디자인으로 500 초 (10)로부터 전단 속도 감소의 결과로 유량이 50 배 감소의 효과가 -1 관찰 될 수있다 (32). C. 더 복잡한 설계 같은 날카로운 모서리가 구불 구불 한 네트워크로 (32)는 종종 병적 인 상황 (42)에서 발생하는 층류 흐름 중단에 내피 반응에 대한 질문에 대답 할 수 있습니다. 마이크로 제조하는 동안 세 가지 단계가있다 150㎛의 D. -. 이러한 패턴에서 만든 미세 혈관 (100)의 직경을 가질 것이다. 우선, 지그 하우징의 상부는 PDM 위에 배치S 입구 및 출구가 정렬되도록 패터닝 네트워크 금형. 콜라겐 I은 주입 포트를 통해 밀폐 공간 (흑색 화살표)로 주입된다. 통상적으로, 0.75 % 콜라겐 I 혼합물의 제조에 사용된다. 성공적인 미세 혈관 제조 콜라겐 E. 박층 커버 슬립 위에 바닥 부분에 첨가된다. 그러나, 이하의 0.6 %는 전형적으로 충분한 기계적 강도 및 채널 붕괴 결과, 최저 0.6 % 콜라겐 달성하고, 평탄화 할 수있다 37 ° C에서 겔화 후 다른 PDMS 조각. F.으로, 곰팡이가 제거 된 PDMS와 상부 및 하부 하우징 지그는 네트워크를 둘러싸 함께 나사 결합되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

> 제어 흐름 정보와 교양 그림 2. 미세 혈관. A. HUVECs를 중력 중심의 흐름에서 배양 미세 혈관에 시드와 B는 3 μL / min의 속도로 연속적인 흐름을 적용했다. 이 효과를 구동하는 정확한 메커니즘은 명확하지 않지만인가 기류 하에서 배양 최선 접합 형성을 향상 루멘 내의 물리적 압력을가함으로써 미세 콜라겐 계 미세 혈관을 안정화시키기 위해 도시 된 미디어 3.5 % 덱스 트란을 첨가하여 달성 39 . 미세 혈관은 내피 세포 접합 단백질 CD31 또는 분화 (31) (빨간색)와 폰 빌레 브란트 인자의 클러스터에 대한 염색 (VWF) 과립 (녹색). A ', B는'. 두 조건에서, HUVECs를이 세포 - 세포 접합 및 VWF의 내피 세포 마커를 표현 과립. A ", B"는. 직교 뷰는 특허와 문화 6 일 후에 둥근 루멘을 보여줍니다.arge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 내피 기능의 연구 3. 엔지니어링 미세 혈관. 를했다. 내피 장벽 기능은 FITC (형광 이소 티오 시아 네이트)의 재관류 후 평가 네트워크 (위)와 벌크 콜라겐 (아래)으로의 확산 이후의 측정을 통해 덱스 트란을 π 공역 할 수 있습니다. 사용자 지정 코드를 사용하여, 재관류의 동영상은 FITC 덱스 트란의 투과 계수 K (μm의 / 초)을 결정하기 위해 시간에 따른 프레임 내의 관심 영역에 걸쳐 픽셀 강도를 플롯 분석 될 수있다. 실험실로 이전 출판물이 설계 혈관의 투과성이 체외 포유 동물 선박 31,43. B의 비교는 것을 증명하고있다. periv와 내피 세포 상호 작용ascular 또는지지 세포를 콜라겐 매트릭스의 세포 조성물을 변조함으로써이 플랫폼으로 분석 될 수있다. 평활근 세포는 혈관 주위 콜라겐 내에 삽입 될 때 다음,이 세포 - 세포 상호 작용의 예를 볼 수있다. 배양 14 일 후, 평활근 세포는 내피 세포와 연관 (녹색 알파 평활근 액틴 (αSMA) 스테인드)과 용기 벽을 따라 프로세스를 확장하고, 직교 돌기 (31)와 같이 같은 혈관 주위 세포를 작용한다. 패널 A 및 B에 도시 된 이미지는 이전의 발행 (31). C에서 재현된다. 혈관 발아 및 혈관 리모델링 자극을 포함하는 배양 배지를 수정하여 설계된 미세 혈관에서 평가 될 수있다. 혈관 신생 자극없이 HUVEC를 최소화 발아 (왼쪽) 표시; 혈관 신생 자극 (GSK-3, 20 NG / ㎖ 혈관 내피 성장 인자 1 μM 소분자 억제제, 20 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포와 촉진제하향식 계획과 직교 뷰 (오른쪽)에서와 같이 인자 WTH), HUVECs를 쉽게 매트릭스에 새싹. 새싹의 길이와 수는 ImageJ에 소프트웨어 (41)와 쉽게 정량화 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 혈액 내피 세포의 상호 작용. 설계된 미세 혈관이 대기하고 염증 자극에 적절하게 반응한다. A.가 수정되지 않은 입구 근처 촬영 HUVEC 배양 용기 강한 CD31의 접합부 염색 (적색)과 라운드 오픈 루멘을 보여줍니다. A '. 직교 루멘의 뷰가 표시됩니다. B.를 CD41a 표지 혈소판 (녹색)으로 전체 혈액을 구연산 때와 마찬가지로 대기 용기를 관류하고, 최소한의 광고내피에 혈소판 (녹색)의 hesion이 관찰된다. C를. 이러한 매체에 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA 50 NG / ㎖), 큰 혈전의 형성 전혈 결과 관류 같은 염증성 자극에 공개 될 채널 내 (녹색 CD41a는 표지) 및 혈관 벽 (31)에 백혈구 (라벨 CD45의 +, 흰색)의 부착. 여기에 본 이미지는 이전 간행물 (31)로부터 재생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

인간 줄기 세포 유래의 EC-. 추가적인 내피 세포 소스 생성도 5는 미세 혈관 설계된 미세 혈관을 생성하기 위해 사용될 수있다. 올해 초, Palpant 등. 알은. 그 두 가지 아형 오 시연F 인간 배아 줄기 세포 유래 혈관 내피 세포 분화 과정이 Wnt / β 카테닌 신호를 조작함으로써 얻어 질 수있다 : hemogenic 내피 세포 및 내막과 같은 내피 세포 (HAND1 높은 hemogenic 전위의 발현 특징) (식에 의해 부분적으로 특징으로하는 NFATC1 및 GATA4) 41. A의 3D 용기 플랫폼 시드 배양은 hemogenic되는 EC는 일부 혈관 발아를 받아야합니다. B.는 그러나, 심 내막 같은되는 EC는 아마도에 대한 응답으로, 기능적인 차이를 제안, 더 많은 혈관과 철새이다 (이 작품은 이전의 출판물 (41)에 자세히 제시)되는 EC의 두 하위 유형 사이에 흐른다. 두 종류의 세포가 CD31 단백질 접합부 (적색) 및 일부 VWF (녹색)을 표현한다. 두 직교 뷰 특허 루멘을 도시한다. C.이 용기 내의 내막 형상의 EC의 주사 전자 현미경 이미지가 혈관 신생 새싹 도시 본내강 측면에서. 패널 A와 B에 제시된 이미지 Palpant 등의 재현이다. 등. (41). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 아무것도 없어.