이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.
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이 논문에서
요약
초록
시험관 플랫폼에서, 내피 세포 및 혈관 생물학은 주로 2D 내피 세포 배양으로 제한됩니다 공부 폴리머 또는 유리 기반의 기판과 하이드로 겔 기반 관 형성 분석과 챔버 흐름. 이러한 분석은, 유익한 동안, 혈관 기능 조절에 중요한 역할을 루멘 형상, 적절한 세포 외 기질 및 다세포 근접, 요점을 되풀이하지 않습니다. 이 논문은 100 ㎛의 정도의 직경을 갖는 엔지니어링 혈관을 생성하는 사출 성형 방법을 설명한다. 미세 혈관은 내가 하이드로 겔 콜라겐 기본 유형에 포함 미세 유체 채널 내피 세포를 파종하여 제조된다. 형성 채널 이전에 콜라겐 매트릭스 내에 실질 세포를 통합함으로써, 특정 조직의 미세 환경을 모델링하고 공부하실 수 있습니다. 유체 역학적 특성 및 미디어 조성물의 추가 변조 원하는 미세 환경 내에서 복잡한 혈관 기능을 제어 할 수 있습니다.이 플랫폼은 혈관 주위 세포 모집, 혈액 내피 세포의 상호 작용, 흐름 응답 및 조직 미세 혈관의 상호 작용 연구를 위해 수 있습니다. 엔지니어링 미세 혈관은 혈관 틈새 시장의 개별 구성 요소의 영향을 분리 할 수있는 기능을 제공하고 정확하게 건강과 질병에 모두 혈관 생물학을 연구하기 위해 화학적, 기계적, 생물학적 특성을 제어 할 수 있습니다.
서론
각 장기 미세 혈관은 조직 미세 정의 조직 항상성을 유지하고 염증, 투자율, 혈전증과 섬유소 용해 1,2- 규제 돕는다. 5 - 미세 혈관 내피 세포, 특히 따라서 혈류와 주위 조직과의 계면은 유체 역학적 힘과 순환 사이토 카인 및 호르몬 3과 같은 자극에 응답하여 혈관 및 장기의 기능을 조절하는 데 중요한 역할을한다. 내피 세포, 혈액 사이의 상세한 상호 작용을 이해하고, 주변 조직의 미세 혈관 생물학 및 질병 진행의 연구에 중요하다. 생체 내 미세 혈관 구조에 요점을 되풀이하고 6,7를 작동하지 않습니다 시험관 도구 제한에 의해 그러나, 이러한 상호 작용을 연구의 진행을 방해하고있다. 결과적으로, 필드 및 치료의 발전은 비용이 많이 들고 시간 -에 크게 의존하고10 - 종종 인간 팔의 성공을 번역하는 데 실패 동물 모델을 소비. 생체 내 모델 질환 메커니즘 및 혈관의 기능 연구에 귀중한 반면, 그들은 복잡한 종종 개인 휴대 생화학의 정확한 제어 및 생물 물리학 적 큐 부족하다.
몸 전체 혈관 최적화 관류 및 영양소....
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프로토콜
네트워크 디자인과 무늬 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 1. 미세
- 웨이퍼 제조는 네트워크 설계의 부정적인 템플릿을 만드는 방법
- 임의의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 네트워크 패턴을 만든다. 입구와 출구 사이의 대각선 치수 향후 단계 (2.1.1 참조) 하우징 장치에 유입 및 유출 저장소 사이의 거리와 일치하는지 확인.
참고 자체가 지정하는 사용자의 특정 연구 목적에 따라 상기 패턴의 설계는 (예를 들어, 패턴을도 1을 참조). - 고해상도 인쇄를 사용하여 네트워크 패턴의 마스크를 생성하거나 상업적 공급자로부터 크롬 포토 마스크를 주문한다. 포토 리소그래피 공정의 상세한 프로토콜은 다른 35 가능하다.
- 산소 플라즈마 처리와 100 W에서 5 분 동안 8 "실리콘 웨이퍼를 청소한다.
- 충분한 네가티브 포토 레지스트을 붓고 (SU-82.5 cm의 직경 형태를 덩어리에 저항하도록 웨이퍼 상에 2,100 작품 잘). 스핀 코터를 사용하여, 100 회전 / 초 램프 500 rpm으로 상기 웨이퍼를 회전하고 10 초 동안 유지한다. 그런 다음 300 회전 / 초와 1,600 rpm으로 진입로 30 초 동안 유....
- 임의의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 네트워크 패턴을 만든다. 입구와 출구 사이의 대각선 치수 향후 단계 (2.1.1 참조) 하우징 장치에 유입 및 유출 저장소 사이의 거리와 일치하는지 확인.
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결과
조작 된 선박 플랫폼은 내가 매트릭스 천연 콜라겐 유형에 내장 된 기능성 미세 혈관을 생성하고 체외에서 세포 생물 물리학 및 생화학 적 환경의 꽉 제어 할 수 있습니다. 설계 미세 혈관을 제조하기 위해, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를이)가 특허 루멘과 합류 내피 세포를 형성하기 위해 부착 콜라겐 포함 된 미세 유체 네트워크를 통해 관류한다. 도 1A-C에 도시 된 바와 같이, 용기의 형상은 특별히 유량 비틀림에 관한 질문에 응답하도록 설계 될 수 있고, 그 중에서도, 각 분기. 미세 혈관을 통한 유량을 조절하는 내피 세포의 전단 응력 응답에 대한 통찰력을 제공한다. 이전 제조 초점 직경 50㎛의 작게 그러나 어떤 경우에는 최대 500 ㎛, 미세 혈관 또는 주로 100 ㎛의 크기 범위에 선박왔다 SUCC왔다essfully 만들어 배양 하였다. 장기 개통의 예는 무게 중심의 흐름 (그림 2A)
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토론
엔지니어링 미세 혈관은 내강 형상, 유체 역학적 힘, 멀티 세포의 상호 작용 등의 생리 학적 특성이 존재하고 조정할 수있는 시험 관내 모델이다. 플랫폼이 유형은 모델 및 생체 외 배양 조건은 당해 미세의 것과 일치 할 수있는 다양한 상황에 내피 거동을 연구 할 수있는 기능을 제공하는 것을 강력하다. 예를 들어, 혈관 내피 세포와 같은 프로세스를 구동하는기구는, 다른 기관 등의 질병 상태 및 44와 같은 다른 병리학 적 상태에 다르게 발생하는 것으로 알려져있다. 이 때문에, 평면 내피 세포 배양 일관 6 불충분 이러한 필드는 비용과 시간이 소요 동물 모델에 크게 의존하고있다.
동물 모델은 정보 및 생물학 연구의 진행에 필수적인하면서, 항상 병원에 잘 번역하지 않습니다.이것은 크게 특히 9,45를 자극에 대한 반응에 관한, 쥐와 인간 생물학의 차이에 기인하고있다. 동물 모델에서 수집 한 정.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
저자는 줄기 세포 및 재생 의학뿐만 아니라 워싱턴 대학에서 워싱턴 나노 제조 시설에 대한 연구소의 린과 마이크 가비 이미징 연구실을 인정하고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국립 연구소의 재정 지원을 인정 (YZ에) DP2DK102258을 부여하고, 교육과 (MAR에) T32HL007312 (SSK 및 MAR에) T32EB001650을 부여합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow 플라즈마 시스템 | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 스핀 코터 | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 개발자 | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8 "실리콘 | 웨이퍼 World Inc. | ||
| 테이블탑 마이크로 패턴 생성기 | 하이델베르크 악기 | μ PG 101 | 포토마스크 생성용 |
| 핫플레이트 | VWR | 97042-646 | |
| 이프로필 알코올 | 아반터 성능 재료 | 9088 | |
| 페트리 접시(120 x 120mm, 정사각형) | 시그마-알드리치 | Z617679 | |
| 트리클로로(3,3,3-트리플루오로프로필)실란 | , 시그마-알드리치 | MKBG3805V | |
| 폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머 베이스 및 경화제 | Dow Corning | Sylgard 184 | 10:1 (w/w) |
| 진공 건조기 | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | 일렉트로 테크닉 제품, Inc. | BD-20 | PMMA 장치 및 PDMS 금형의 플라즈마 처리를 위한 휴대용 장치 |
| 납땜 인두 | 웰러 | WTCPS | |
| 스테인레스 스틸 트러스 헤드 슬롯 머신 스크류 | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| 스테인레스 스틸 다월 핀 | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| 핀셋 | Miltex | 24-572 | 유사한 핀셋을 사용할 수 있습니다 |
| 주걱(마이크로 스푼)전자 | 현미경 서비스 | 62410-01 | |
| 스크류 드라이버 | 모든 일자 드라이버를 사용할 수 있습니다, 오토클레이브 | ||
| 유리 커버슬립(22 x 22mm)Fisher | Scientific | 12-542B | |
| 표백제 | 클로록스 | 4460030966 | |
| 페트리 접시(150 x 25mm) | 코닝 | 430599 | |
| 페트리 접시(100 x 20mm) | Corning | 2909 | |
| 면, 1cm x 3cm 조각 | 오토클레이브 | ||
| 폴리에틸렌이민(PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 세포 배양 등급 물에 1%로 희석 |
| 글루타르알데히드 | Sigma-Aldrich | G6257 | 세포 배양 등급 물에 |
| 0.1%로 희석멸균 H2O | 오토클레이브 DI H2O | ||
| 유형 I 콜라겐, 0.1% 아세트산 | Rajan et. al. 2006 (ref #37)에 설명된 대로 쥐 꼬리에서 분리 | ||
| ml 주사기 | BD | 309659 | |
| 10 ml 주사기 | BD | 309604 | |
| 15 ml 원추형 튜브 | Corning | 352097 | |
| 30 ml 원뿔형 튜브 | Corning | 352098 | |
| M199 10x 미디어 | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1 N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | 세포 배양 등급 물에서 1 N으로 희석 |
| HUVECs | Lonza | ||
| 내피 성장 매체 | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Leuconostoc spp.의 덱스트란 (70 kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 혈구계 | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| 젤 로딩 팁 | VWR | 37001-152 | |
| 18 G 블런트 필 니들 | BD | 305180 | |
| 20G 스테인레스 스틸 디스펜싱 바늘 | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32" ID, 3/32" OD 실리콘 튜빙 | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" 튜브-튜브 커플링 | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° 엘보 커넥터, 튜브 대 튜브 | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| 루어 록 커플 링 (암, 1/16 "ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| 플라스틱 집게, 턱 그립 포함 | 전자 현미경 서비스 | 72971 | |
| 이중 주사기 펌프 | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC 결합 항-폰 윌레브랜드 팩터 항체 | Abcam | ab8822 | 1:100 작동 희석 |
| 염소 항-토끼 568 보조 항체 | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 작동 희석 |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | |
| DMSO 나트륨 카코딜레이트 | Sigma-Aldrich | C0250 | 0.2 M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40 kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| 추가 배양 시약 | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | 저분자 GSK-3 억제제 |
| 인간 재조합 VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| 인간 재조합 bFGF | Peprotech | AF-100-18B |
참고문헌
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.
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