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방법 논문

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

2016년 9월 9일

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

초록

시험관 플랫폼에서, 내피 세포 및 혈관 생물학은 주로 2D 내피 세포 배양으로 제한됩니다 공부 폴리머 또는 유리 기반의 기판과 하이드로 겔 기반 관 형성 분석과 챔버 흐름. 이러한 분석은, 유익한 동안, 혈관 기능 조절에 중요​​한 역할을 루멘 형상, 적절한 세포 외 기질 및 다세포 근접, 요점을 되풀이하지 않습니다. 이 논문은 100 ㎛의 정도의 직경을 갖는 엔지니어링 혈관을 생성하는 사출 성형 방법을 설명한다. 미세 혈관은 내가 하이드로 겔 콜라겐 기본 유형에 포함 미세 유체 채널 내피 세포를 파종하여 제조된다. 형성 채널 이전에 콜라겐 매트릭스 내에 실질 세포를 통합함으로써, 특정 조직의 미세 환경을 모델링하고 공부하실 수 있습니다. 유체 역학적 특성 및 미디어 조성물의 추가 변조 원하는 미세 환경 내에서 복잡한 혈관 기능을 제어 할 수 있습니다.이 플랫폼은 혈관 주위 세포 모집, 혈액 내피 세포의 상호 작용, 흐름 응답 및 조직 미세 혈관의 상호 작용 연구를 위해 수 있습니다. 엔지니어링 미세 혈관은 혈관 틈새 시장의 개별 구성 요소의 영향을 분리 할 수​​있는 기능을 제공하고 정확하게 건강과 질병에 모두 혈관 생물학을 연구하기 위해 화학적, 기계적, 생물학적 특성을 제어 할 수 있습니다.

서론

각 장기 미세 혈관은 조직 미세 정의 조직 항상성을 유지하고 염증, 투자율, 혈전증과 섬유소 용해 1,2- 규제 돕는다. 5 - 미세 혈관 내피 세포, 특히 따라서 혈류와 주위 조직과의 계면은 유체 역학적 힘과 순환 사이토 카인 및 호르몬 3과 같은 자극에 응답하여 혈관 및 장기의 기능을 조절하는 데 중요한 역할을한다. 내피 세포, 혈액 사이의 상세한 상호 작용을 이해하고, 주변 조직의 미세 혈관 생물학 및 질병 진행의 연구에 중요하다. 생체 내 미세 혈관 구조에 요점을 되풀이하고 6,7를 작동하지 않습니다 시험관 도구 제한에 의해 그러나, 이러한 상호 작용을 연구의 진행을 방해하고있다. 결과적으로, 필드 및 치료의 발전은 비용이 많이 들고 시간 -에 크게​​ 의존하고10 - 종종 인간 팔의 성공을 번역하는 데 실패 동물 모델을 소비. 생체 내 모델 질환 메커니즘 및 혈관의 기능 연구에 귀중한 반면, 그들은 복잡한 종종 개인 휴대 생화학의 정확한 제어 및 생물 물리학 적 큐 부족하다.

몸 전체 혈관 최적화 관류 및 영양소 전송 동시에 11을 제공하는 광대 한 모세관 침대와 함께 성숙한 계층 구조를 보유하고있다. 처음에, 초기 개발 12, 13 중 계층 분기 네트워크 재구성 원시적 총으로 혈관 형성된다. 이러한 프로세스에 관련된 신호들의 많은 웰 (14)은 이해되지만 - 16는 혈관 패턴 (15)을 결정하는 방법 등 어려운 남아있다. 차례로, 조직 혈관 망을 설계하기 위해 시험 관내에서이 과정을 recapitulating은 꿀벌이n은 어렵다. 많은 기존의 체외 플랫폼은 두 가지 차원 내피 세포 배양으로, 같은 다세포 근접, 세 가지 차원 내강 구조, 흐름, 그리고 세포 외 기질과 같은 중요한 특성 부족, 혈관을 모델링합니다. 3D 하이드로 겔 튜브 형성 분석 (콜라겐 또는 섬유소) 17-19 또는 침공 분석 (20, 21)은 다른 혈관 17, 22 또는 조직 세포 유형 (23) 3D와의 상호 작용에서 내피 세포의 기능을 연구하는 데 사용되었다. 그러나 이러한 분석의 루멘은 상호, 혈역학 적 흐름, 적절한 관류 부족 조립. 또한, 이들 관 형성 분석법 (24) 내의 혈관 회귀 성향이 수행 될 수있다 기능 연구의 정도를 제한 장기간 배양 및 성숙을 방지한다. 따라서, 적절하게 모델링 할 수 미세 혈관 네트워크 욕실의 체외 플랫폼을 설계 할 수있는 싹 트는 필요가있다특성 dothelial 장기 배양 할 수있다.

혈관 공학 기법 다양한 혈관 질환 환자의 대체 의료용 또는 바이 영향 선박 년간 나왔다. 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET), 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (의 ePTFE)과 같은 합성 재료로 제조 대경 용기 장기 개통 (평균 95 %의 개통 5 년) 25 상당한 치료 성공이 있었다. 작은 직경의 합성 이식은 (<6mm) 일반적으로 내막 증식 및 혈소판 (26)과 같은 합병증에 직면하지만 - 조직이 생체 물질로 만든 작은 직경 이식을 설계 (28)는, 상당한 진전 (29, 30)을 만들었습니다. 이러한 종류의 발전에도 불구하고, 마이크로에 설계 선박의 반칙으로 남아있다. 충분히 미세 혈관을 모델링하기 위해, SUF 복잡한 네트워크 패턴을 생성 할 필요가있다ficient 기계적 강도 및 개방성 실질 세포 및 세포 개조 모두 영양소 투과를 허용하는 매트릭스 조성물을 유지한다.

(34) -이 프로토콜은 조정 가능한 및 제어 미세 환경 (31) 설정 생체 내에서 기본을 모방 한 새로운 인공 관류 혈관 네트워크를 제공합니다. 기술 된 방법은 100 μm의 순서에 직경 엔지니어링 미세 혈관을 생성합니다. 엔지니어링 미세 혈관은 내가 하이드로 겔 콜라겐 소프트 타입에 포함 된 미세 유체 채널을 통해 내피 세포를 관류에 의해 제조된다. 이 시스템은 오픈 내강 구조와 패턴 네트워크를 생성 다세포 상호 작용을 복제, 세포 외 기질 성분을 조절하고, 생리 학적으로 관련 혈류 역학적 힘을 적용 할 수있는 능력을 보유하고 있습니다.

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프로토콜

네트워크 디자인과 무늬 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 1. 미세

  1. 웨이퍼 제조는 네트워크 설계의 부정적인 템플릿을 만드는 방법
    1. 임의의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 네트워크 패턴을 만든다. 입구와 출구 사이의 대각선 치수 향후 단계 (2.1.1 참조) 하우징 장치에 유입 및 유출 저장소 사이의 거리와 일치하는지 확인.
      참고 자체가 지정하는 사용자의 특정 연구 목적에 따라 상기 패턴의 설계는 (예를 들어, 패턴을도 1을 참조).
    2. 고해상도 인쇄를 사용하여 네트워크 패턴의 마스크를 생성하거나 상업적 공급자로부터 크롬 포토 마스크를 주문한다. 포토 리소그래피 공정의 상세한 프로토콜은 다른 35 가능하다.
    3. 산소 플라즈마 처리와 100 W에서 5 분 동안 8 "실리콘 웨이퍼를 청소한다.
    4. 충분한 네가티브 포토 레지스트을 붓고 (SU-82.5 cm의 직경 형태를 덩어리에 저항하도록 웨이퍼 상에 2,100 작품 잘). 스핀 코터를 사용하여, 100 회전 / 초 램프 500 rpm으로 상기 웨이퍼를 회전하고 10 초 동안 유지한다. 그런 다음 300 회전 / 초와 1,600 rpm으로 진입로 30 초 동안 유지한다. 주 : 속도 및 150 ㎛의 레지스트 두께를 수득 각 실험 조건에 대해 최적화 될 필요가 램프.
    5. 소프트 베이크 7 분 65 ° C에서 웨이퍼, 360 ° C / 시간으로 95 ° C까지 상승하고, 45 분 동안 유지한다. 천천히 핫 플레이트에서 실온으로 냉각. 노출, 크롬 포토 마스크에서 365 nm의 자외선에 노출 제조업체의 추천 (350 엠제이 / 약 150 ㎛의 SU-8 두께 cm 2)의 트리플 것을 코팅 된 웨이퍼 상에 혈관 패턴을 각인.
      주 : SU-8은 네거티브 형 레지스트이므로, 노광 영역 (패턴 디자인을 제외한 모든) 단계 1.1.7에서 현상 제에 용해 될 것이다.
    6. 하드 베이크 (65)에 노출 된 웨이퍼° 5 분 C하고 천천히 핫 플레이트에 RT로 냉각되도록 한 후, 360 ° C / 시간으로 95 ° C까지 상승하고 25 분 동안 유지한다.
    7. 15 분 노출되지 않은 압축 된 질소 흐름에서 다음 이소 프로필 알코올을 깨끗하고 건조, 저항 씻어 - (10)가 SU-8 개발자의 웨이퍼를 빠져. (원치 않는 박리 및 거품을 찾아)을 SU-8이 잘 웨이퍼 결합 레지스트 보장하기 위해 광학 현미경 하에서 패턴을 검사합니다.
    8. 제조자의 지시 (36)에 관한 프로파일로를 이용하여 패턴 피처의 두께를 측정한다. 측정 수집하는 동안, 웨이퍼 상에 패턴 화 된 피쳐의 구조적 일체 성을 손상시킬 접촉 기반 프로파일로 등 네트워크 기능 (즉, 입구 및 출구 도관)에 필수적인 구조 영역을 피한다. 대안 적으로, 모두이 문제를 방지하기 위하여, 비접촉 방식 (즉, 광 프로파일로)를 사용한다.
  2. 창콜라겐 성형 용 무늬와 평면 금형의 neration
    참고 : 화학 물질 흄 후드 내에서 실란을 처리합니다.
    1. 표면을 silanization합니다 2 시간 동안 트리클로로 (3,3,3- 트리 플루오) 실란 100 ㎕와 건조기에서 웨이퍼를 놓습니다.
    2. 120 X 120mm 광장 페트리 접시에 실란 화 된 웨이퍼를 전송합니다. 6mm 두께 - (4)를 달성하기 위해, 웨이퍼 위에 : 혼합 및 탈기 PDMS 엘라스토머와 경화제 (1 비율 w / w 10)에 붓는다. 패턴없이 평면 금형을 생성하기 위해 별도의 120 X 120mm 광장 페트리 접시에 추가 PDMS를 따르십시오. 2 시간 동안 65 ° C에서 치료.
    3. 오븐에서 제거하고, PDMS는 실온으로 냉각시킨다. 메스를 사용하여 조심스럽게 SU-8 주위에 사각형을 잘라 천천히 웨이퍼에서 PDMS 몰드를 벗겨. X 30mm 30mm에 자리를 떼어. 플랫 형의 경우, 컷 X 40mm 40mm에 대한 사각형 조각으로 임프린트 패턴없이 PDMS를 치료.

2. 주택 장치

  1. Fabricat톱 이온 및 아래쪽 주택 조각
    1. 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)를 사용하여 용기 하우징 (PMMA)를 제작한다. , 제작 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 밀링 기능을 갖춘 표준 기계 공장에서 부품을 주문합니다. 상단과 하단 부분의 개략적 인 그림 1을 참조하십시오.
    2. 모서리에 위치 된 장치의 상부에 1mm의 깊이와 장치의 아래쪽 두 콜라겐 주입 포트 (4mm 직경)에 잘 20mm X 20mm를 포함하는 상부 하우징 부재 (도 1D)을 설계 광장 아니라 6mm 직경 개의 입구 및 출구 저장조 및 상기 장치의 네 귀퉁이에 네 개의 나사 구멍 (3 mm 직경).
      주 : 추가 구멍은 처리 목적 부재의 주변부에 가공 될 수있다.
    3. 주변 25mm × 25 mm의 중앙에 사각형 구멍을 포함하는 하부 하우징 부분 (그림 1E)을 디자인 (크기 15mm X 15mm)0.25 mm의 깊이와 선반. 드릴 4-40 나사 4 나사 구멍. 하단의 나사 구멍을 확인하고 상단 부분은 미래의 조립 단계에서 함께 정렬됩니다.

3. 미세 혈관 디바이스 제조

  1. 재료의 준비
    1. 씻고 핀셋 두 세트, 스테인레스 강 주걱 작은 평면 스크류 드라이버 스테인리스 나사 몇몇 스테인레스 스틸 앵커 핀 압력솥. 용기의 제조를 위해, 또한 미세 패턴 PDMS 몰드를 오토 클레이브 평면 사각형, 커버 글라스 (22 × 22 ㎜) 및면 조각 PDMS.
    2. 다음 두 번 조직 문화 후드에서 멸균 된 물로 씻어, 적어도 1 시간 동안 표백제의 PMMA 주택 조각을 소독 및 멸균 조직 문화 요리 건조 공기 (150mm X 25mm)로 할 수 있습니다.
  2. 무균 폴리에틸렌 이민 - 글루 타르 알데히드 (PEI - GA) 코팅
    1. 살균 건조 PMMA 조각의 내부 우물을 치료약 1 분 동안 플라즈마. 내부 웰 10 분의 PMMA 조각합니다 (20mm 사각형 잘의 상단과 하단에 25mm 사각 선반)에 1 % 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 추가합니다. 무균 H 2 O로 씻어 조직 문화 후드에서 건조 할 수 있습니다.
      주 : 플라즈마 처리에 필요한 시간은 사용되는 장치에 따라 가변 - PEI는 용이하게 친수성 ​​표면을 나타내는 확산한다. 그렇지 않은 경우, 추가적인 플라즈마 처리가 필요할 수있다.
    2. PEI 30 분간 PMMA 조각의 표면 처리에 0.1 % 글루 타르 알데히드 (GA)를 적용한다. 멸균 수로 두 번 세척하여 건조 할 수 있습니다.
      주 : 향후 단계 콜라겐은 콜라겐 글루 타르 알데히드 가교를 통해 코팅 된 표면에 부착된다. 이것은 나중에 조립 공정 중에 상기 장치 배양 기간 동안 장치 내의 장소에 겔을 고정 할 수 있습니다.
  3. 콜라겐 젤 준비
    1. 1 % 콜라겐 - 0.6 %를 사용하여 용기를 제조솔루션을 제공합니다. 수산화 나트륨 (NaOH) 10 배 미디어 보충 (M199), 및 세포 배양 미디어 - (쥐에서 분리 된 37 테일 1.5 %)이 내가 원액을 콜라겐 유형을 혼합, 선박 제작을위한 0.75 % 콜라겐을 확인하십시오. 얼음에 모든 솔루션을 보관하십시오.
    2. V의 ƒinal 필요 겔 최종 부피 인 다음의 식에 의하여 콜라겐의 양을 결정한다 (일반적으로, 디바이스 당 콜라겐 1 ㎖ 충분하다) V 스톡 콜라겐 필요 스톡 콜라겐의 양이고, C 스톡 콜라겐 농도는 재고 콜라겐 및 C ƒinal 콜라겐 용기 내의 콜라겐의 바람직한 농도이다.
      figure-protocol-1
    3. 새로운 30 ML 원뿔 튜브에 재고 콜라겐의 적절한 볼륨을 전송하기 위해 1 ML의 주사기를 사용합니다. 중화 수산화 나트륨 (NaOH를 V)의 볼륨을 결정, M199 10 배 매체 보충(V 10 X), 세포 배양 배지 (V 1 X) 다음과 15 ML 원뿔 관에서 별도로 혼합과 같습니다 :
      figure-protocol-2
    4. 중화 시약 분주 콜라겐 (V 1 X V (10) X, V의 NaOH)의 혼합물을 추가하고 균일 한 겔을 얻을 때까지 부드럽게 솔루션을 혼합 작은 주걱을 사용합니다. 천천히 그리고 부드럽게 교반하여 거품을 도입하지 마십시오.
    5. - (천만 세포 / mL를 예를 들어, 0.5)가 중화 시약과 혼합 한 후 콜라겐 용액에 셀을 추가하고, 세포가 균일하게 분산 될 때까지 교반을 계속하여 원하는 농도로 기질에 세포를 포함한다.
    6. 세포가 첨가되는 경우, 다음 식, V 세포에 의해 결정된 바와 같이, 추가의 부피를 수용 세포 배양액의 양을 조절 </ 서브> 세포 현탁액의 필요한 양이며, C ƒinal 세포 밀도는 용기 내의 원하는 셀 밀도, C 현탁액 셀 밀도 원액 세포의 밀도이다.
      figure-protocol-3
  4. 콜라겐 주입 - 탑 원피스
    1. 100mm X 20mm 요리의 미세 패턴 PDMS 몰드를 놓습니다. 1 분 동안 PDMS 몰드 청소 플라즈마.
    2. 금형의 광장 저수지는 입구와 출구 저수지 바로 아래에 있음 (- 점선 그림 1D 참조) 그래서 PDMS 몰드의 상단에 상단 PMMA 조각을 맞 춥니 다. 입구에 스테인리스 다월 핀을 배치하고, 패턴의 저장조로부터 명백한 접속을 유지하기 위해 상부 PMMA 편에 저장 구멍 출구.
    3. 0.6 ml의 콜라겐 - ~ 0.5를 추출하기 위해 1 ML의 주사기를 사용합니다. 기포가 주사기에 남아 있는지 확인합니다.
    4. 리터 아래로 눌러ightly 상단 하우징에 핀셋으로 상단 부분과 PDMS 몰드 사이의 플러시 접촉을 보장합니다. 상단 PMMA의 조각에 주입 포트를 통해 서서히 콜라겐을 주입한다. 그 콜라겐 패턴 위의 20mm X 20mm 도메인에 채우고 밖으로 누출되지 않습니다 확인합니다.
    5. 다웰 핀 싸움이 치열하지 않고 음식을 닫고 30 분 동안 37 ° C 배양기에서 겔 할 수 있습니다.
  5. 콜라겐 주입 - 아래 조각
    1. 바닥 부분의 중앙에 22 X 22mm 유리 커버 슬립을 놓습니다. 유리 슬라이드에 균등하게 ~ 0.25 ml의 콜라겐을 분배하기 위해 1 ML의 주사기를 사용합니다. 부드럽게 PDMS는 PMMA에 평평하고 더 갇힌 기포가없는 보장 콜라겐을 통해 PDMS를 평면 사각형을 낮 춥니 다. 30 분 동안 37 ° C에서 겔 할 수 있습니다.
  6. 장치 조립
    1. 겔화 후, PDMS (약 1 ml)에 둘러싸 하단 부분에 평면 PDMS 조각 주위에 충분한 PBS를 추가합니다. 모든 전자를 제거하는 핀셋을 사용하여xcess의 가장자리 주위에 콜라겐, 천천히은 PDMS 조각을 벗겨. 수분을 유지하는 콜라겐의 상단에 더 PBS를 추가합니다.
    2. 상단 부분을 준비하려면, 상단 PMMA 조각을 픽업하여 PDMS 금형 상단에 오도록를 뒤집어 핀셋을 사용합니다. 신속, 인터페이스에 PBS 몇 방울을 추가하고 단단히 맨 PMMA 조각에서 PDMS 몰드를 제거합니다.
    3. 조심스럽게 핀셋의 다른 쌍을 사용하여 PMMA 하우징의 다른 측면에서 스테인레스 스틸 앵커 핀을 제거합니다. 미세 패턴 콜라겐에 PBS의 더 몇 방울을 추가합니다. 콜라겐이 아래로 향하도록 PMMA 위에 조각을 뒤집어 코너 구멍에 나사 4 개를 배치합니다.
    4. 조심스럽게 바닥 부분의 모서리 구멍에 나사를 맞추고, 하단 부분의 상단에 상단 부분을 배치합니다. 이 두 가지가 서로에 대해 슬라이드하는 것을 허용하지 않습니다. 부드러운 터치를 사용하여 나사를 조 스크루 드라이버를 사용합니다. 너무 세게 조이지 마십시오.
    5. PBS를가 PMMA 표면을 둘러싸는 기음 작은 PI 배치상기 장치의 하나의 에지의 아래면 ECE. 피펫을 사용하여, 저수지에서 모든 PBS를 제거하고 세포 배양 배지로 교체합니다. 장치가 적어도 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 함께 겔 할 수 있습니다.
  7. 셀 시드
    1. 37 ° C에서 내피 성장 미디어 문화 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) (CO 2, O 2) 컨 플루 38. 가능하면, 유로 4와 7 사이에 사용합니다.
    2. PBS 6 ml의 배양 플라스크를 세척하고 세포를 해리하여 37 ℃에서 2 ml의 0.05 % 트립신 가산함으로써 내피 세포를 Trypsinize. 초점 유착의 대부분은 분리하고 세포가 반올림 될 때까지 (- 3 분이 일반적으로 약 2 소요) 트립신에 세포를 남겨주세요. 소 태아 혈청 (FBS)를 함유하는 내피 세포 성장 배지 4㎖를 첨가함으로써 트립신의 반응을 정지. 세포가 플라스크에서 분리되어 있는지 확인하고 수집하기 위해 미디어를 여러 번에 플라스크를 씻어원뿔 튜브한다.
    3. 혈구를 사용하여 세포를 세어 mL의 천만 세포의 밀도로 재현 탁들을. 입구와 출구 저수지에서 모든 세포 배양 용지를 제거합니다. 200 ㎕의 젤 로딩 팁을 사용하여, 유입구 저장소의 중앙에 세포 현탁액 10 μL를 추가한다. 세포를 즉시 네트워크 코트 네트워크로 유입되기 시작한다.
    4. 두 저수지에 동일하게 200 μL 미디어를 추가 할 수 세포를 연결하고 적어도 1 시간 동안 네트워크 내에서 확산.
  8. 장치 문화
    1. 문화 입구 저수지 세포 배양액 200 μL와 출구 저장조 50 μL를 추가하여 네트워크를 통해 중력 중심 흐름 장치. 문화의이 방법, 내피 세포 생존 능력을 유지하기 위해 매일 12 시간 미디어를 교체합니다.
      주 : 연속 유동 배양 조건이 바람직한 경우 (일정 전단 응력을 유지 출구 등으로 미디어를 수집)는 SYR인게 펌프 대신 중력 구동 배양에 사용될 수있다.
    2. 적어도 24 시간 씨앗을 품고 내피 세포가 지속적인 흐름을 적용하기 전에 연결하고 안정화 할 수 있습니다. 연속 흐름 설치에 앞서, 중력 중심의 유동 조건을 갖는 장치를 유지한다.
      참고 : 응용 흐름에 대한 미디어 조건이 중력 중심의 문화 다릅니다. 미디어에 같은 덱스 트란 플라즈마 확장의 추가는 설계 미세 혈관을 안정화와 지속적인 관류 39시 혈관 붕괴를 방지 할 수 있습니다.
    3. 연속 흐름 설정에 미디어를 만드는 최적의 선박 문화 내피 세포 성장 매체에서 3.5 % 덱스 트란 (70 kDa의)을 용해합니다. 무균 기술을 사용하여, 3.5 % 덱스 트란과 내피 성장 미디어 10 ml의 주사기를 입력합니다.
    4. 납땜 인두를 사용하여 배양 접시의 측벽에있는 구멍을 용융 흐름 멸균 배양 접시를 준비한다.
    5. 루어 잠금 커플 링 (여성, 1/16 "ID)에 12"실리콘 호스 (1/32 "ID)를 부착하고, 1 /다른 쪽 끝 튜브의 세그먼트 (16)은 "1 직선 튜브에 튜브 커넥터". 세그먼트 1/4 "1의 자유 단에 (바늘 허브에서 분리) 20G 무딘 바늘을"넣습니다. 또한 (하우징 입구에 설치하여야한다). 다음 단계에서, 더 긴 튜브가 제조 된 접시에 통과되며 (3)에 부착 된 관 대 관 90 ° 엘보 커넥터 접합에 연결된 배관의 3 '세그먼트를 준비 20 G 바늘을 통해 "세그먼트. 출구 배관은 자유 단부 대신 루어 로크 커플 링, 흡입 호스를 반영한​​다. 사용하기 전에 모든 세그먼트를 압력솥.
    6. 준비된 접시 구멍 멸균 입구 및 출구 배관 스레드. . 내부 20 G 바늘 3 "세그먼트를 연결 미디어 채워진 주사기 루어 잠금 커플 링을 부착하고 높은 유량으로 설정 주사기 펌프를 사용하여 튜브를 통해 미디어를 관류. 튜브 또는 커넥터에 기포가 없는지 확인, 이 같은 용기에 흐름을 방해합니다.
    7. 는 C를 삽입onnector 주택 입구에 공동. 원하는 유량 주사기 펌프를 설정하고 재관류를 시작한다.
      주 : 용기 형상과인가 전단 응력의 실험 조건에 따라이 조정될 수있다. 100㎛의 직경 채널 3 μL의 유량 / 분 잘 작동한다.
    8. 원하는 경우, 미디어의 500 μl를 함유하는 살균 5 ㎖ 폴리스틸렌 둥근 바닥 튜브에 삽입 준비 출구 배관으로 관류 액을 모은다.
      주 : 매체 소량의 흐름을 차단할 수있는 기포 형성을 방지하기 위해 수집 튜브에 첨가한다.
    9. 유속에 따라 주사기는 24 내지 36 시간 후 재충전 될 필요가있다. 이는 하우징의 입구로부터 커넥터를 제거한 주사기를 대체 미디어 몇 분 동안 고 유량으로 관류 할 수 있도록함으로써 이루어진다. 이 순서는 거품이 튜브에 소개되지 않도록합니다. 문화에 대해 원하는 유량 펌프를 재설정 주택 입구에 커넥터를 삽입하고인큐베이터로 돌아갑니다.

4. 장치 분석

  1. 투수 분석
    1. 반응계에 용기의 투과율을 시각화하는 40 kDa의 FITC 덱스 트란을 사용한다. 공 초점 현미경에 용기 하우징을 놓고 용기면에 초점을 맞 춥니 다. 4X 배율 25 msec의 노출 시간의 입구 및 이미지 5 μM 40 kDa의 FITC 덱스 트란을 추가하고, 10 분 동안 초당 1 프레임에서.
    2. 청 등에 의해 발표 된 모델을 기초로 콜라겐 (μm의 / 초)으로 용기 벽에 걸쳐 덱스 트란의 투과성을 측정하는 분석 코드 화상 시리즈를 분석한다. 알. 31.
  2. 면역 염색 및 공 촛점 이미징 분석
    1. 혈관 문제를 해결하려면, PBS 세 번 (세척 당 20 분) 관류 20 분, 세척의 입구를 통해 3.7 %의 포름 알데히드 관류. 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트리톤 X-100 PE 블록과 결합 특이성 항체1 시간 동안 네트워크를 통해 rfused. 4 ° C에서 하룻밤 일차 항체 솔루션을 관류하고 PBS로 3 회 세척한다. 1 차 항체 용액을 관류 - 2 시간과 동일하게하여 PBS로 다시 세척 하였다.
    2. 1 ㎛의 Z-단계와 공 초점 현미경을 사용하여 현장에서 미세 혈관의 면역 형광 이미지를 가져 가라. 이미지 4 배, 10 배, 또는 20 배의 배율에서 미세 혈관.
      참고 : 10 배와 20 배 확대 된 이미지 등등 신장, 접합 형성, 셀룰러 세부 사항을 제공 할 것입니다 동안 4 배의 배율은 글로벌 네트워크 구조 정보를 제공합니다.
    3. Z 돌기 (이미지 / 스택 / Z 프로젝트), 크로스 섹션 (이미지 / 스택 / 직교 뷰) 및 3D 재구성 (이미지 / 스택 / 3D 프로젝트)와 ImageJ에를 사용하여 이미지 스택을 분석합니다.
  3. 주사 전자 현미경 영상
    1. 전자 현미경 분석을 위해, 졸 Karnovsky의 절반 강도 관류하여 반응계에서 해결의 ution 하룻밤 (0.2 M cacodylate 버퍼에 2 % 파라 포름 알데히드 / 2.5 %의 글루 타르 알데히드). 용기를 분해 조심스럽게 두 가지를 구분합니다. 가장자리를 잘라 내고 완전히 몇 일 동안 정착 용액에 담그지.
    2. (2 분마다)를 20 분 동안 25 % 글루 타르 알데하이드에서 용기의 두께의 상부를 담그고 PBS로 3 회 헹군다. 50 %, 70 %, 85 % (2 분마다) 100 % 에탄올 (5 분마다)에 두 개의 세척의 시리얼 에탄올 세척 탈수.
    3. 제조자의 프로토콜 (40) 다음 임계점 건조해서 상기 탈수 분석을위한 샘플을 준비한다. 금 - 팔라듐 (7 ㎚) 코트를 용기 스퍼터 5 kV의 스폿 사이즈 (3)의 가속 전압과 주사 전자 현미경으로 분석한다.

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결과

조작 된 선박 플랫폼은 내가 매트릭스 천연 콜라겐 유형에 내장 된 기능성 미세 혈관을 생성하고 체외에서 세포 생물 물리학 및 생화학 적 환경의 꽉 제어 할 수 있습니다. 설계 미세 혈관을 제조하기 위해, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를이)가 특허 루멘과 합류 내피 세포를 형성하기 위해 부착 콜라겐 포함 된 미세 유체 네트워크를 통해 관류한다. 도 1A-C에 도시 된 바와 같이, 용기의 형상은 특별히 유량 비틀림에 관한 질문에 응답하도록 설계 될 수 있고, 그 중에서도, 각 분기. 미세 혈관을 통한 유량을 조절하는 내피 세포의 전단 응력 응답에 대한 통찰력을 제공한다. 이전 제조 초점 직경 50㎛의 작게 그러나 어떤 경우에는 최대 500 ㎛, 미세 혈관 또는 주로 100 ㎛의 크기 범위에 선박왔다 SUCC왔다essfully 만들어 배양 하였다. 장기 개통의 예는 무게 중심의 흐름 (그림 2A)

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토론

엔지니어링 미세 혈관은 내강 형상, 유체 역학적 힘, 멀티 세포의 상호 작용 등의 생리 학적 특성이 존재하고 조정할 수있는 시험 관내 모델이다. 플랫폼이 유형은 모델 및 생체 외 배양 조건은 당해 미세의 것과 일치 할 수있는 다양한 상황에 내피 거동을 연구 할 수있는 기능을 제공하는 것을 강력하다. 예를 들어, 혈관 내피 세포와 같은 프로세스를 구동하는기구는, 다른 기관 등의 질병 상태 및 44와 같은 다른 병리학 적 상태에 다르게 발생하는 것으로 알려져있다. 이 때문에, 평면 내피 세포 배양 일관 6 불충분 이러한 필드는 비용과 시간이 소요 동물 모델에 크게 의존하고있다.

동물 모델은 정보 및 생물학 연구의 진행에 필수적인하면서, 항상 병원에 잘 번역하지 않습니다.이것은 크게 특히 9,45를 자극에 대한 반응에 관한, 쥐와 인간 생물학의 차이에 기인하고있다. 동물 모델에서 수집 한 정...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

저자는 줄기 세포 및 재생 의학뿐만 아니라 워싱턴 대학에서 워싱턴 나노 제조 시설에 대한 연구소의 린과 마이크 가비 이미징 연구실을 인정하고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국립 연구소의 재정 지원을 인정 (YZ에) DP2DK102258을 부여하고, 교육과 (MAR에) T32HL007312 (SSK 및 MAR에) T32EB001650을 부여합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Wafer Fabrication
AutoGlow 플라즈마 시스템AutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc PWM32 스핀 코터 
ABM Contact AlignerAB-M
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 개발자MicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8 "실리콘웨이퍼 World Inc.
테이블탑 마이크로 패턴 생성기하이델베르크 악기μ PG 101포토마스크 생성용
핫플레이트VWR97042-646
이프로필 알코올아반터 성능 재료9088
페트리 접시(120 x 120mm, 정사각형)시그마-알드리치Z617679
트리클로로(3,3,3-트리플루오로프로필)실란, 시그마-알드리치MKBG3805V
폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머 베이스 및 경화제Dow CorningSylgard 18410:1 (w/w)
진공 건조기Sigma-AldrichZ119024-1EA
OvenVWR9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA)Plexiglas
Corona Treater일렉트로 테크닉 제품, Inc.BD-20PMMA 장치 및 PDMS 금형의 플라즈마 처리를 위한 휴대용 장치
납땜 인두웰러 WTCPS
스테인레스 스틸 트러스 헤드 슬롯 머신 스크류McMaster-Carr 91785A096
스테인레스 스틸 다월 핀McMaster-Carr 93600A060
핀셋 Miltex24-572유사한 핀셋을 사용할 수 있습니다
주걱(마이크로 스푼)전자현미경 서비스62410-01
스크류 드라이버모든 일자 드라이버를 사용할 수 있습니다, 오토클레이브
유리 커버슬립(22 x 22mm)FisherScientific12-542B
표백제클로록스4460030966
페트리 접시(150 x 25mm)코닝430599
페트리 접시(100 x 20mm)Corning2909
면, 1cm x 3cm 조각오토클레이브
폴리에틸렌이민(PEI)Sigma-AldrichP3143세포 배양 등급 물에 1%로 희석
글루타르알데히드Sigma-AldrichG6257세포 배양 등급 물에
0.1%로 희석멸균 H2O오토클레이브 DI H2O
유형 I 콜라겐, 0.1% 아세트산Rajan et. al. 2006 (ref #37)에 설명된 대로 쥐 꼬리에서 분리
ml 주사기BD309659
10 ml 주사기BD309604
15 ml 원추형 튜브Corning352097
30 ml 원뿔형 튜브Corning352098
M199 10x 미디어 Life Technologies11825-015
1 N NaOH (sterile)Sigma-Aldrich415413세포 배양 등급 물에서 1 N으로 희석
HUVECsLonza
내피 성장 매체LonzaCC-3124
TrypsinCorning25-052-CI
소 태아 혈청 (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Leuconostoc spp.의 덱스트란 (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
인산염 완충 식염수(PBS)Corning21-031-CV
혈구계Hausser Scientific Co.3200
젤 로딩 팁VWR37001-152
18 G 블런트 필 니들BD 305180
20G 스테인레스 스틸 디스펜싱 바늘McMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, 3/32" OD 실리콘 튜빙Cole-ParmerEW-95702-00
1/16" 튜브-튜브 커플링McMaster-Carr5116K165
90° 엘보 커넥터, 튜브 대 튜브McMaster-Carr5121K901
루어 록 커플 링 (암, 1/16 "ID)McMaster-Carr51525K211
플라스틱 집게, 턱 그립 포함전자 현미경 서비스72971
이중 주사기 펌프Harvard Apparatus70-4505
5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브Fisher Scientific14-959-2A
Device Analysis
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Rabbit anti-hCD31Abcamab324571:25 working dilution
FITC 결합 항-폰 윌레브랜드 팩터 항체Abcamab88221:100 작동 희석
염소 항-토끼 568 보조 항체Thermofisher ScientificA-110111:100 작동 희석
HoeschtThermofisher ScientificH1399
DMSO 나트륨 카코딜레이트Sigma-AldrichC02500.2 M cacodylate buffer
EthanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated DextranSigma-AldrichFD40S 
추가 배양 시약 
CHIR-99021Selleck ChemS2924저분자 GSK-3 억제제
인간 재조합 VEGFPeprotech100-20
인간 재조합 bFGFPeprotechAF-100-18B
으로 절단 에 용해 1 에 재현탁;

참고문헌

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245(2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757(2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858(2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2(2009).

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